Summary
이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.
Abstract
신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병 (PD), 루 경화 증 (ALS) 등 생활 매년 수천의 수백의 손실. 효과적인 치료 옵션 수 질병의 진행을 중단 하는 부족. 대형 환자 집단에서 광범위 한 시퀀싱 노력에도 불구 하 고 대부분의 ALS 및 PD 경우 혼자 유전자 변이 의해 설명할 수 없는 남아 있습니다. Epigenetics 메커니즘, 히스톤 단백질의 포스트 번역 상 수정 같은 신경 퇴행 성 질환 병 인 및 진행에 관련 되어있을 수 있습니다 고 제약 개입에 대 한 새로운 목표. ALS와 PD의 포유류 vivo에서 그리고 생체 외에서 모델은 비용이 많이 드는 연장과 힘 드는 실험 프로토콜 요구. 여기, 우리는 게놈 넓은 변경 Saccharomyces cerevisiae 를 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 히스톤 수정 레벨을 결정 하는, 빠르고, 실용적이 고 비용 효율적인 접근을 개설 한다. 크게의 우리의 지식을 확대 하는 동안 다른 모델 시스템에서 이전 연구 결과 확증 신경 proteinopathies에 연결 하는 epigenetic 변화에 포괄적인 수사를 위해이 프로토콜을 사용 하는 신경 퇴행 성 질병 epigenome입니다.
Introduction
신경 퇴행 성 질환 거의 아무 치료 옵션을 사용할 수 있는 치명적인 질병이 있습니다. 이러한 가운데, 루 경화 증 (ALS) 및 파 킨 슨 병 (PD)는 특히 무서운. ALS와 PD의 경우의 약 90% 산발적, 나머지 경우 가족에서 실행 하 고 일반적으로 특정 유전자 돌연변이1,2에 연결 하는 동안, 질병의 가족 력이 없이 발생으로 간주 됩니다. 흥미롭게도,이 질병의 두 단백질 mislocalization 및 집계3,4,,56와 연결 됩니다. 예를 들어, 육 (FUS)에 융합 및 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43)는 세포질에 mislocalize ALS7,,89,10에서 집계 하는 RNA 의무적인 단백질 11,12, α-synuclein는 배치할 PD5,13,,1415Lewy 몸 불리의 원리 구성 요소.
대형 환자 집단에서 광범위 한 게놈 넓은 협회 노력에도 불구 하 고 압도적인 대부분의 ALS 및 PD 경우 남아 설명할 수 없는 유전자. Epigenetics는 신경 질환에 역할을 할 수 있습니다.? Epigenetics는 원본 DNA 시퀀스16변경 없이 발생 하는 유전자 발현에서 변화 구성 되어 있습니다. 주요 epigenetic 메커니즘 히스톤 단백질16의 포스트 번역 상 수정을 (PTMs)를 포함 한다. 진 핵 세포에서 유전 물질 염색 질으로 단단히 싸여 있다. Chromatin의 기본 단위는 DNA는 히스톤 octamer 감싸의 146의 기본적인 쌍의 구성 된 nucleosome 히스톤 (2 부 각 히스톤 H2A, H2B, H3, H4)17의 4 쌍의 구성입니다. 각 히스톤이 있다 N 맨끝 꼬리는 nucleosome 중 돌출 하 리 신과 아르기닌 잔류물18에 일반적으로 다양 한 화학 moieties의 추가 의해 수정할 수 있습니다. 이러한 PTMs 이므로 동적, 그들은 쉽게 추가 될 수 있습니다 및 제거, 그룹 acetylation, 메 틸 화, 인 산화 등을 포함. PTMs transcriptional 기계, DNA의 접근을 제어 하 고 따라서 제어 유전자 식18도움. 예를 들어 histone acetylation 매우 기본적인 히스톤 단백질 및 유전자 더 액세스할 수 acetylated 히스톤에 의해 포장 수 있도록 부정 청구 DNA 등뼈 사이 정전기 상호 작용의 힘을 감소 따라서 매우 19를표현 했다. 최근에, 특정 히스톤 PTMs 및 그들의 조합의 놀라운 생물 특이성 히스톤 코드 가설20,21 어떤 단백질에서을 작성, 삭제, 및 읽기 히스톤 PTMs 모든 콘서트에서 행동을 주도하 고 있다 유전자 발현 조절
효 모 neurodegeneration 공부에 매우 유용한 모델 이다. 중요 한 것은, 많은 신경 세포 통로 인간22,,2324누 룩에서 보존 됩니다. 효 모 세포 독성 고기 및 FUS, TDP-43, 또는 α-synuclein22,,2324,,2526의 overexpression에 단백질 포함 정리. 사실, ALS의 Saccharomyces cerevisiae 모델 인간27에서 유전 위험 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 α-synuclein ameliorate α-synuclein 독성 신경28,29druggable 대상으로 Rsp5 네트워크의 특성에 대 한 허용 overexpressing 효 모.
여기, 우리가 Saccharomyces cerevisiae 신경 proteinopathies (그림 1)과 관련 된 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화를 감지를 악용 하는 프로토콜을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 사용 때문에 그것의 사용의 용이성, 저렴 한 비용과 속도 neurodegeneration의 다른 시험관 및 동물 모델에 비해 매우 매력적 이다. ALS와 PD 모델22,23,,2526개발 이전 활용, 우리 인간의 FUS, TDP-43, 및 효 모에 발견된 고유 히스톤 PTM 변화에서 발생 하는 α-synuclein overexpressed 있다 각 proteinopathy30와 연결입니다. 우리가 여기에 설명 하는 프로토콜은 데이터 분석에 변환에서 2 주 미만에 완료할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 신경 proteinopathy 관련 단백질 구조와 S. cerevisiae 변형
- 효 모 추출 물 펩 포도 당 (YPD) 국물 (200 rpm) 30 ° c.에 떨고 함께 하룻밤에 야생 타입 (WT) 303 효 모 성장
- 12−16 h의 성장, 후 희석 효 모 600에서 광학 밀도 YPD와 0.25 nm (OD600). 효 모 액체 문화 10 mL 각 변환에 대 한 필요 하 게 됩니다, 효 모 액체 문화 50 mL 해당 FUS, TDP-43, synuclein, a 벡터만 (ccdB) 구조, 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 변환 하는 5 개의 변환 준비 없이 DNA.
- OD600 0.60와 0.80 사이이 때까지 30 ° C에서 동요와 효 모 성장. 이 일반적으로 4−6 h를 걸립니다.
- 30 분 전에 효 모 성장 완료, 선형화 플라스 미드 구조.
참고: 플라스 미드 구문을 여기에 사용 되는 게놈에 직접 통합 해야 하며 따라서 선형화 필요 변환 전에.- 계산 플라스 미드의 볼륨 금액 1 µ g 합니다. 빼기가이 볼륨 nuclease 무료 H2O 필요의 양을 계산 하 44 µ L에서 합니다.
- Microcentrifuge 튜브를 nuclease 무료 H2O, 10 x 제한 효소 버퍼 (자료 테이블)의 5 µ L, NheI 제한 효소 (자료 테이블)의 1 µ L 및 플라스 미드 (에서 계산된 단계 1.4.1)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 플라스 미드는 이제 선형화 및 준비 변환입니다.
- 효 모 후 문화 0.6-0.8, 50 mL 원뿔 튜브에 스핀 아래로 3 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 850 x g 에서 수확 셀의 OD600 에 도달합니다.
- 살 균 H2O 3 분 삭제 상쾌한에 대 한 850 x g 4 ° C에서 원심 분리기의 10 mL에 셀 펠 릿을 세척. 총 4 개의 세척의 3 배를 반복 합니다.
- 3 세척의 시작에서 해 동 하 고 연어 정자 DNA가 열 블록에 5 분에 대 한 변환 반응 당 10 µ L를 끓여.
- DH2O 변환 당 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 microcentrifuge 튜브의 적절 한 수로 분할. 5 변환, dH2O의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 5 별도 microcentrifuge 튜브로 균등 하 게 분할 합니다.
- 실 온 (RT)에서 850 x g 에 5 분 동안 centrifuge 고 모든 나머지 물을 제거 합니다.
- 다음과 같은 순서로 살 균 H2O, 240 µ L의 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), 1 M LiAc, 연어 정자 DNA의 10 µ L, 선형화 플라스 미드 DNA의 20 µ L (또는 nuclease 무료 물 없는 DNA 컨트롤 변환에 대 한)의 36 µ L의 50 µ L를 추가. 믹스 철저 하 게 각 추가 소용돌이 후 간단히 모든 변환 구성 요소를 추가한 후.
- 20 분 동안 42 ° C에 변화 반응을 품 어.
참고: 더 일관 된 온도 제어를 위한 물 욕조에이 부 화를 실시 합니다. - 470 x g RT에 대 한 5 분 삭제 상쾌한에 centrifuge 및 살 균 H2o.의 200 µ L에서 각 셀 펠 릿 resuspend
- 효 모 현 탁 액 선택적 미디어 접시에 접시 및 롤링 구슬 또는 스프레더 확산. 30 ° c.에 2−3 일에 대 한 번호판을 품 어
참고: 합성 정의 (SD)-여기에서 설명 하는 플라스 미드에 사용 되는 그의 접시.
2. 측량 식민지 성장 억제 및 글리세롤 주식에 저장
- 2% 유 보충 선택적 미디어의 5 mL에 변환 격판덮개에서 단일 식민지 접종 30 ° C에서 통에 밤새 껏 증가 한다. 변환 당 적어도 12 식민지를 선택 합니다.
참고: 없음 식민지 "DNA" 변환 제어 접시에 예상 된다. - 핀-frogger 불타는 다음 에탄올 소독.
- 각 문화는 96 잘 접시의 첫 번째 행에서 포화 세포 현 탁 액의 aliquot 100 µ L에 대 한. 인접 한 잘 열의 모든 스에서 살 균 H2O의 200 µ L를 추가 합니다. 1:5 직렬 희석에 대 한 멀티 채널 피펫으로 뒤에 인접 한 열에 첫 번째 열에서 50 µ L을 추가 합니다. Pipetting으로 철저 하 게 혼합. 다음 50 µ L 두 번째 열에서 세 번째 열과 혼합 하 여 추가 pipetting 합니다. 이 접시의 나머지 부분에 대 한 반복 합니다.
- Frogger 96 잘 접시에 놓고 다음 눌러 부드럽게 하 고 균등 하 게 내려와 갈 락 토스 없이 선택적 미디어 접시에 스탬프 플레이트 효 모. 2−3 일 30 ° C에서 품 어.
참고: SD-그의 SGal 그의 접시는 여기에서 설명 하는 플라스 미드 사용 됩니다. - FUS, TDP-43, 그리고-synuclein 변환, 갈 락 토스의 대부분 성장 억제를 표시 하는 식민지를 식별 합니다. SD-그의 격판덮개에서이 식민지를 선택 하 고 선택적 미디어 하룻밤 성장 위한 2% 유 보충의 10 mL에 접종. 벡터 제어에 대 한 갈 락 토스의 존재 없는 성장 억제를 표시 하는 식민지를 선택 하십시오.
- 글리세롤 주식 준비, 50% 글리세롤의 0.5 mL와 포화 액체 문화의 0.5 mL을 결합. 아래로 pipetting으로 혼합 하 고-80 ° c.에 동결
참고 사항: 글리세롤 주식 저장할 수 있습니다-80 ° c.에서 1 년까지
3. 신경 proteinopathy의 overexpression S. cerevisiae 에서 단백질 관련
- 냉동된 글리세롤 주식, 히스티딘, 효 모 다시 행진에서 2% 포도 당 한 천 선택적 미디어 격판덮개 그리고 2−3 일 30 ° C에서 품 어.
- Overexpression 모델 및 제어 2% 유 보충 히스티딘 선택적 액체 미디어의 5 ml에서의 각 단일 식민지를 예방. 하룻밤에 30 ° C (200 rpm)를 떨고 함께 성장.
- 액체 문화의 100 mL의 overexpression 모델과 컨트롤 각각에 대 한 성장 (FUS, TDP-43, 및 벡터 제어;-synuclein 및 벡터 제어).
- 2% 갈 락 토스와 보완 하는 선택적 미디어에서 문화의 100ml 준비 합니다.
- OD600 의 숙박 문화를 측정 하 고 하룻밤 문화의 시작 OD600 0.3의 overexpression 문화를 렌더링 하는 데 필요한 금액을 계산. 일반적으로, 야간 문화 0.9−10, 약 5 mL 100 mL 신선한 문화의 시작을 하룻밤 문화 요구의 OD600 에 도달 한다.
- 5 h (FUS 및 TDP-43) 또는 8 h (-synuclein) 30 ° c.에 떨고와 갈 락 토스 미디어 (3.3.1 단계 참조)에 효 모 성장 하 여 단백질 overexpression를 유도
- 유도 기간의 끝에 각 문화권의 OD600 를 측정 합니다. OD600 최소값을 모든 셀 수를 표준화. 4 ° c.에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuging 여 50 mL 튜브에 문화를 수확 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 경우 유도의 끝에 측정 된 OD600 값 0.654 0.984, 각각,-synuclein 문화 100 mL 및 100 mL의 제어 문화, 95 mL-synuclein 문화 및 제어 문화의 67.1 mL 수확. - 살 균 dH2O 성장 문화의 모든 10 ml의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. Aliquoting 셀 물의 resuspension의 1 mL microcentrifuge 튜브에 의해 펠 릿을 균등 하 게 분할 합니다. 예를 들어 100 mL의 문화에서 시작 해 서, 살 균 dH2O 10 mL에 펠 릿을 resuspend 그리고 10 microcentrifuge 튜브로 그것을 분할.
- 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다. 스냅 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결
참고: 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 최대 1 년.
4. 세포 세포의 용 해 및 히스톤 포스트 번역 상 수정을 검출 하 부 럽
- 세포 세포의 용 해
- 효 모 세포 알갱이 얼음에 녹여와 dH2o.의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend
- 셀 물의 resuspension를 0.2 M NaOH의 300 µ L 2-mercaptoethanol의 20 µ L을 추가. 아래로 pipetting으로 resuspend.
- 10 분 동안 얼음에 셀을 품 어 고 다음 30 탁상 원심 분리기에 3200 x g 에서 원심에서 실시간 삭제 상쾌한 s.
- 염료와 10 분이 열 블록에 대 한 종 로드 x 1의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
참고: 로드 염료 x 6에 대 한 제조 법 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다.
- 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 그리고 막 전송
- 두 젤 젤 홀더 및 충전 내부 챔버에 버퍼를 실행 하 고 2-젤 라인 마크를 외부 챔버를 작성 상단에 배치 하 여 젤 챔버를 준비 합니다.
- 10 잘 12 %polyacrylamide 젤으로 잘 당 4.1.4 단계에서 15 µ L의 샘플을 로드 합니다. 단백질 사다리 레인 5 µ L 로드.
- 150 V, 또는 젤의 하단에 도달 하면 염료 전면 로드 될 때까지 약 45 분 젤을 실행 합니다.
- 젤을 실행 하는 동안 전송 버퍼 (자료 테이블)에 (젤 당 2) 섬유 패드를 몸을 담글 하 고 메탄올에 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 멤브레인을 몸을 담글 하 여 막 전송을 위해 준비 합니다. 전송 하기 전에 전송 버퍼에 막을 헹 구 십시오.
참고: PVDF 막 젤의 크기에 절단 해야 하 고 전송 되는 모든 젤 한 PVDF 막 사용 합니다. - 조립, 세미 드라이 전송 장치 셀에 전송 '샌드위치': 하단 전극에서 장소 (1) presoaked 섬유 패드, (2) presoaked 및 씻어 서 PVDF 막, (3) 단계의 4.2.3, 젤 및 (4) 두 번째 presoaked 섬유 패드.
참고: 전송 '샌드위치'에 공기 방울을 피하기 위해 있는지 확인 부드럽게 '샌드위치' 거품 밖으로 강제로 serological 피펫으로 롤. 일단 젤 PDVF 막 위에 배치 되었습니다, 그것을 이동 하지 않도록 확인 합니다. - 단백질 전송 150 파워 팩을 설정 하 여 수행 (1 ' 샌드위치')에 대 한 1 시간 mA.
- 히스톤 PTMs 수정 특정 항 체를 검출
- 전송 장치에서 멤브레인을 제거 합니다. 짧게 dH2O. 린스
- 필요에 따라 작은 플라스틱 상자에서 막 커버 하 고 30−60 s. 제거 Ponceau S에 대 한 부드러운 떨고와 RT에 잠복기 얼룩 배경 얼룩 때까지 지명 타자2O로 씻어 충분히 Ponceau S 얼룩을 붓는 의해 Ponceau S 얼룩과 단백질의 전송 확인 사라집니다 및 단백질 밴드 육안으로 볼 수 있습니다. DH2O 린스 모든 얼룩 막에서 제거 될 때까지 계속 합니다.
- 작은 얼룩 상자에서 막 tris 버퍼 염 분 (TBS) 블로킹 버퍼 (테이블의 재료)과 함께 부드러운 락와 RT에 1 시간을 위한 얼룩을 배양 하 여 차단 합니다. 충분 한 차단 버퍼를 사용 하 여 얼룩을 커버.
참고: 배치 막 직 립 착 색 상자에서 그렇게 막 쪽에 단백질 거짓말 하지 향하게 주의 해야 합니다. - 품 어 하룻밤 4 ° c.에 효 모 쪽으로 반응 한 히스톤 수정 특정 항 체와 착 상자에 오 점 제조업체 사양에 따라 TBS 블로킹 버퍼에서 항 체 희석. 또한 안티 총 H3 수정 특정 항 체에서 다른 호스트 종에서와 같은 적절 한 핵 로드 컨트롤을 포함 합니다. 예를 들어, 토끼에서 안티-H3S10ph 항 체와 H3S10ph에 대 한 탐색 하는 경우 로드 컨트롤 마우스에서 안티 총 H3 항 체를 사용 합니다. 필요에 따라 모든 오 점을 위해 이것을 반복 합니다.
참고: 항 체 희석 한 달에서 세 번의 총 다시 수 있습니다. 4 ° c.에서 그들을 저장합니다 - 막 4 워시 x 집 만든 TBS + 0.1% 폴 20 (TBST) 실시간에서 락으로 5 분
- 제조 업체 지정 된 희석 (당나귀 안티 토끼 680와 당나귀 안티 마우스) 실시간에서 1 h에서 형광 이차 항 체와 오를 품 어
참고: 보조 형광 항 체 보호 되어야 합니다에서 저장 및 사용 하는 동안. 어두운 플라스틱 상자에서 인큐베이션을 카 리 또는 알루미늄 호 일 커버. - 막 4 워시 x TBST 가진 5 분을 실시간에 락 하는 동안 5 분 TBS로 세척
- 형광 서쪽 오 점 2 분에 대 한 시스템 이미징에 시각화 오 시각화 안티 토끼 680와 반대로 마우스 800 2 차 항 체는 800 nm와 700 nm 채널, 각각.
참고: 복제는 독립적으로 실시 하지 섹션 1에서에서 시작 합니다. 그것은 항 체 신호 응답은 신호 응답은이 실험에서 적절 한 데이터 해석에 대 한 선형 범위 이내 인지 확인 해야 합니다.
- 전송 장치에서 멤브레인을 제거 합니다. 짧게 dH2O. 린스
5. 데이터 분석 및 통계
- 오픈 이미지 이미징 소프트웨어 (자료 테이블)에서 오 점입니다. 프레임 분석 모드에서 밴드 사각형을 그려서 벡터 제어, TDP-43, FUS (또는 벡터 제어 및 synuclein) 수정 특정 밴드 샘플의 원시 밀도 취득 합니다.
- 컨트롤 밴드를 로드 하기 위한 5.1 단계를 반복 합니다.
참고: 있을 것 이다는 로드 제어 밴드와 각 샘플에서 수정 특정 밴드. - 벡터 제어 샘플에서 해당 밴드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 수정 특정 밴드의 상대 밀도 계산 합니다. 이 데이터는 벡터 제어를 정규화합니다.
- 로드의 상대 밀도 계산 해당 로드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 컨트롤 밴드 벡터 제어 샘플에서 컨트롤 밴드.
- 로드의 상대 밀도 통해 수정 특정 밴드의 상대 밀도 분할 하 여 각 밴드의 조정된 상대 밀도 계산 각 샘플에 대 한 컨트롤 밴드. 이제, 데이터 히스토그램 형태로 구상 될 수 있다.
참고: 처리의 용이성, 단계 5.3-5.5 스프레드시트 (보충 파일)에서 할 수 있습니다. - 중요성에 대 한 구분으로 후 여러 독립 복제, 두 개의 샘플 및 적절 한 proteinopathy 사이 실행된 웰 치의 T-테스트 모델 (FUS 대 제어, TDP-43, 대 제어 및 제어-synuclein 대) p = 0.05 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법을 설명 하기 위해 우리는 최근에 출판 된 결과30의 활용 것입니다. 동안 WT α-synuclein는 8 h overexpressed WT 인간의 FUS 및 TDP-43 5 h overexpressed 했다. CcdB 구문 벡터 부정적인 제어로 사용 되었다. 그림 2 는 고체와 액체 문화에서 성장 억제를 보여준다. 효 모는 설명 된 대로 수확 했다 하 고 수행한 수정-특정 항 체로 서 부 럽. 반대로 총 H3 로드 제어로 사용 되었다. H3S10ph와 H3K14ac의 수준에서 크게 감소 FUS overexpression 모델 (그림 3ab)에서 분명 하다. 나타나지 않으면에 FUS TDP-43 overexpression 모델 또는 α-synuclein overexpression 모델 (그림 3 cd)에서 H4K12 및 H4K16 acetylation의 수준에서 크게 증가 하 고 있습니다. 또한 α-synuclein overexpression 모델 (그림 3ef)에 H3K36me2와 H2BT129ph의 수준에서 상당한 감소가 있다.
히스톤 PTMs 변화 식 신경 proteinopathy 단백질의 양의 상관 관계를 표시 하려면 FUS 표현 갈 락 토스 (그림 4a)의 다양 한 수준에서 단백질 발현을 유도 하 여 조정 될 수 있습니다. 갈 락 토스 설탕의 총 농도 2%, 하지만 갈 락 토스의 양을 단백질 식 레벨의 범위에 수정 되는 비율을 변화에 자당 혼합입니다. S. cerevisiae 에 자당은 포도 당, 갈 락 토스 유도31억제를 물질 대사로 변화 천천히. 따라서, 자당 활성화도 유도 갈 락 토스를 표시 하지 않습니다. 갈 락 토스의 낮은 금액 FUS overexpression를 유도 하는 데 사용, 적은 독성 (그림 4bc) 고체와 액체 문화에서 관찰 되었다. 중요 한 것은, 낮은 FUS overexpression의 수준, H3S10ph 수준 (그림 4 d-f)에서 감소의 작은 크기.
그림 1: 효 모 모델에서 신경 퇴행 성 질병 proteinopathies에 연결 된 히스톤 포스트 번역 상 수정에 변화 특성에 대 한 Methodoverview. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 효 모 모델에서 신경 proteinopathy 관련 단백질의 overexpression와 관련 된 독성. 탐지 분석 overexpressing 벡터 제어, TDP-43, FUS, 또는 α-synuclein (는) 포도 당 또는 갈 락 토스 (b) 존재 하는 효 모에 대 한 세포 생존 능력을 보여줍니다. (c) 성장 곡선 갈 락 토스 유도에서 액체 문화에서 세포 생존 능력을 보여주는. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타냅니다. n = 각 변형에 대 한 3. 복제 완전히 독립적인 실험에서 결과. 데이터 첸, K. 그 외 신경 퇴행 성 질병 Proteinopathies에 연결 된 고유한 히스톤 Post-translational 수정 풍경 허가 적응. ACS 화학 신경. 9 (4), 838-848 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 히스톤 포스트 번역 상 수정 관련 된 효 모 모델에서 신경 proteinopathy 관련 단백질의 overexpression에에서 변화. FUS proteinopathy 모델 표시 감소 수준 (는) H3S10ph, n = 6, 및 (b) H3K14ac, n = 3. 반대로, TDP-43 proteinopathy 모델 n (c) H4K12ac의 증가 수준을 보여줍니다 = 3, 및 (d) H4K16ac, n = 6, α-synuclein 모델을 보여 줍니다 (전자) H3K36me2의 감소 수준을 n = 3, 및 (f) H2BT129ph, n = 7. 오류 막대 표시 + 표준 편차입니다. *, p < 0.05, * * *, p < 0.001. 복제 완전히 독립적인 실험에서 결과. 데이터 첸, K. 그 외 신경 퇴행 성 질병 Proteinopathies에 연결 된 고유한 히스톤 Post-translational 수정 풍경 허가 적응. ACS 화학 신경. 9 (4), 838-848 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: H3S10ph 수준에 있는 감소의 정도 FUS overexpression의 수준에 연결. FUS overexpression의 양을 조정 하려면 자당 및 갈 락 토스 비율의 사용 (a) 만화 그림. (b) Spotting 분석 실험 갈 락 토스의 다양 한 레벨의 세포 생존 능력을 보여주는 갈 락 토스의 다양 한 레벨의 세포 생존 능력을 보여주는 액체 문화에서 (c) 성장 곡선. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타냅니다. (d) 대표 immunoblots 전시 FUS 단백질에 상승 레벨 셀 갈 락 토스의 비율 증가에 노출 됩니다. Phosphoglycerate 키 니 아 제 (PGK) 로드 제어로 사용 되었다. 갈 락 토스의 비율을 증가 함께 H3S10ph 수준에서 (e) 대표 immunoblots 표시 해당 줄. (e)의 (f) 정량 히스토그램. n = 각 조건에 대해 3. 오차 막대 표시 + 정량화 차트에 대 한 표준 편차. 복제 완전히 독립적인 실험에서 결과. 데이터 첸, K. 그 외 신경 퇴행 성 질병 Proteinopathies에 연결 된 고유한 히스톤 Post-translational 수정 풍경 허가 적응. ACS 화학 신경. 9 (4), 838-848 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜의 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화 신경 proteinopathies 연관 분류, 편법, 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 그러나 거기에 다른 모델의 ALS 및 PD, 등 생체 외에서 인간 세포 선 및 murine 모델32, S. cerevisiae 남아 사용의 용이성 때문에 매력적인. 예를 들어, 효 모 모델 살 균 후드의 사용을 요구 하지 않습니다 없으며 그들은 필요로 할 교육 집중 셀 문화 작업 함께 간다. 또한, 효 모 배양에 대 한 시 약 포유류 세포 배양 공급 보다 훨씬 더 저렴 한 있습니다. 효 모 모델 공개 도메인 결정 단백질 집계22,23,,2425,26, 뿐만 아니라 또한 이끌어 잠복 유전 위험에 악용 되어 있다 ALS27, 단백질 집계 독성22의 한정자에 있는 요인. 또한, Set3, 복잡 한, 히스톤 deacetylase의 구성원의 삭제를 효 모33TDP-43 독성을 줄이기 위해 발견 되었습니다. 흥미롭게도, 효 모에 우리의 연구 결과 히스톤 수정 변경 사항 모두 FUS 마우스 모델에서 및 인간의 SH SY5Y FUS overexpression 모델34,35에서 최근 보고서와 있습니다. 또한, 최근 발견 주위 주요 PD 유전자, DNA 메 틸 화 패턴 변경 SNCA 와 PARK2, PD36,37epigenetics에 대 한 역할을 지원.
여기, 우리가 이러한 효 모 모델 또한 신경 proteinopathies epigenome30상호 작용 하는 방법을 발견 하 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리는 히스톤 수정에 뚜렷한 변화 각 proteinopathy 모델와 관련 된 찾을. 여기에 설명 된 프로토콜 다른 모델 시스템에서 이전 연구 결과 확증 할 수 있습니다. 가장 현저 하 게,이 방법은 신경 질환의 epigenomic 파노라마의 우리의 이해를 고조는. 여기에 제시 된 수정 확장된 집합 수 약리학 내정간섭을 위한 새로운 히스톤 작가 및 지우개 목표를 발견 하 고. 이러한 결과 히스톤 PTMs의 가능한 기여와 ALS, PD, 그리고 다른 신경 퇴행 성 질환의 병 리에 epigenetics 강조 하 고이 질병의 치료에 대 한 새로운도 제공할 수 있습니다.
특별 한 주의 1.9 및 1.10 단계에서 누 룩을 변형 하는 경우로 이동 신경 proteinopathies overexpress 필요가 있다. 특히, 1.10 단계는 시 약을 적절 한 순서로 추가 높은 변환 효율을 보장 하는 데 필요한입니다. 또한, 그것은 매우 갈 락 토스에 대부분 성장 억제를 표시 하는 식민지를 선택 하는 것이 중요입니다. 한다 또한 주의 서쪽 샌드위치를 조립 하는 경우. 젤과 막 사이의 거품의 실수로 추가 단백질의 양도 차단 하 고 데이터 분석을 방해할 수 있는 오에 블록 관광 명소를 제공.
이 프로토콜의 한 제한 항 체 바인딩 및 한 번에 하나 또는 두 개의 히스톤 수정을 감지만 제한 된 것입니다. 그것은 또한 단백질 overexpression (단계 3.4−3.6) 후 샘플을 제대로 표준화 중요입니다. 같은 볼륨에 resuspended 완전히 제거 모든 성장 미디어 각 셀 펠 릿 바람을 보장 합니다. 유사 하 게, 신중 하 게 aliquot 하는 것이 중요 하다 동일한 양의 세포 현 탁 액 microcentrifuge 튜브 (3.4 단계). 샘플 제대로 표준화 되지 경우 어떤 결론에서 변경한 히스톤 PTM 수준에 어렵습니다. 이러한 문제는 서쪽 오 점 (단원 4.2)의 로드 제어의 수준에 불일치에 명백한 될 것 이다. 이 문제를 해결 하려면 관련 샘플 로드 SDS 페이지 젤 Coomassie 스테인드, 샘플 (5 절)의 단백질 밴드 정량화 및 샘플 각 샘플에 존재 하는 단백질의 양에 따라 후속 다시 표준화에 대 한 허용 될 수 있습니다.
결론적으로,이 프로토콜 변환 통계 분석에서에서 단지 미만 2 주에 신경 proteinopathies에 관련 된 단백질의 overexpression 연관 히스톤 PTM 변화의 분석에 대 한 수 있습니다. Proteinopathies 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 연구 활성화, 외이 일반적인 프로토콜 히스톤 PTM 변경 어떤 효 모 overexpression 모델 연구에 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 기술 Royena Tanaz, Huda 유세 프 및 Sadiqa Taasen 감사합니다. 우리는 시 약 및 자당 튜닝 실험의 디자인에서 지적 도움의 관대 한 제공에 대 한 교수 제임스 짧은에 매우 감사. 효 모 플라스 미드 교수 아론 Gitler (303 Gal FUS;를 포함 하 여에서 관대 한 선물을 했다 Addgene 플라스 미드 # 29614)입니다. NIH NINDS 고급 박사 전환 수상 (K22NS09131401) 뿐 아니라 고급 과학 연구 센터 (CUNY)와 브루클린 대학 지원 M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
