Summary
Este protocolo descreve procedimentos experimentais para caracterizar todo o genoma de alterações nos níveis de modificações borne-translational do histone (PTM) ocorrendo em relação a superexpressão de proteínas associadas com a ALS e a doença de Parkinson em Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Após a separação de SDS-PAGE, níveis PTM histona individuais são detectados anticorpos específicos de modificação através da mancha ocidental.
Abstract
Doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD), causam a perda de centenas de milhares de vidas anualmente. Opções de tratamento eficazes, capazes de impedir a progressão da doença são escassos. Apesar dos esforços de sequenciamento extensa em grandes populações de pacientes, a maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável por mutações genéticas sozinhos. Epigenetics mecanismos, tais como a modificação pós-traducional de proteínas histonas, podem estar envolvidos na progressão e etiologia de doenças neurodegenerativas e levam a novos alvos para intervenção farmacêutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro da ALS e PD são caros e muitas vezes exigem prolongados e laboriosos de protocolos experimentais. Aqui, podemos delinear uma abordagem prática, rápida e econômica para determinar todo o genoma de alterações nos níveis de modificação de histona utilizando Saccharomyces cerevisiae como um sistema modelo. Este protocolo permite investigações abrangentes sobre alterações epigenéticas, ligadas ao proteinopathies neurodegenerativas que corroborar conclusões anteriores em sistemas diferentes do modelo ao mesmo tempo expandindo significativamente nosso conhecimento sobre o Epigenoma de doenças neurodegenerativas.
Introduction
Doenças neurodegenerativas são doenças devastadoras, com pouca ou nenhuma opção de tratamento disponível. Entre estes, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD) são particularmente terrível. Aproximadamente 90% dos casos de ALS e PD são considerados esporádicos, ocorrendo sem histórico familiar da doença, enquanto os restantes casos funcionar nas famílias e geralmente estão ligados a um gene específico mutação1,2. Curiosamente, ambos destas doenças estão associados com a proteína mislocalization e agregação de3,4,5,6. Por exemplo, fundido em sarcoma de (FUS) e proteína de ligação a DNA TAR 43 (TDP-43) são proteínas de ligação de RNA que mislocalize para o citoplasma e agregam em ALS7,8,9,10, 11,12, enquanto α-synuclein é o componente do princípio de agregados proteicos denominados corpos de Lewy em PD5,13,14,15.
Apesar dos esforços de associação ampla de genoma-largo em grandes populações de pacientes, a esmagadora maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável geneticamente. Pode epigenética desempenham um papel na doença neurodegenerativa? Epigenetics compreende alterações na expressão gênica que ocorrem sem alterações de sequência de DNA subjacente16. Um mecanismo epigenético principal envolve as modificações borne-translational (PTMs) de histona proteínas16. Em células eucarióticas, material genético é fortemente envolvido na cromatina. A unidade básica da cromatina é a nucleossoma, composto por 146 pares de bases de DNA enrolado ao redor de um octamer de histona, composto por quatro pares de histonas (duas cópias de cada das histonas H2A, H2B, H3 e H4)17. Cada histona tem a cauda do N-terminal que se projeta fora do nucleossoma e pode ser modificada pela adição de várias partes de químicas, normalmente em resíduos de lisina e arginina18. Estes PTMs são dinâmicas, o que significa que eles podem ser facilmente adicionados e removidos e incluem grupos como fosforilação, metilação e acetilação. PTMs controlar a acessibilidade do DNA para a maquinaria transcricional e contribuindo assim para controle de expressão de gene18. Por exemplo, a acetilação da histona reduz a força da interação eletrostática entre a proteína histona altamente básica e o backbone de DNA carregado negativamente, permitindo que os genes embalados por histones acetificados para ser mais acessível e, portanto, altamente expresso19. Mais recentemente, a notável especificidade biológica de histona particular PTMs e suas combinações levou o histona código hipótese20,21 na quais proteínas que escrever, apagar e ler PTMs de histona todos agem em conjunto para Module a expressão gênica.
O fermento é um modelo muito útil para estudar a neurodegeneração. Importante, muitos caminhos celulares neuronais são conservados de levedura para seres humanos22,23,24. Levedura recapitular fenótipos de citotoxicidade e inclusões de proteína com superexpressão de FUS, TDP-43 ou α-synuclein22,23,24,25,26. Na verdade, modelos de Saccharomyces cerevisiae de ALS já foram usados para identificar fatores de risco genéticos em seres humanos27. Além disso, o fermento superexpressão α-synuclein humana permitida a caracterização da rede Rsp5 como um destino druggable para amenizar a toxicidade de α-synuclein em neurônios28,29.
Aqui, descrevemos um protocolo explorando Saccharomyces cerevisiae para detectar alterações no genoma-largo do histone PTM associadas com proteinopathies neurodegenerativas (Figura 1). O uso de S. cerevisiae é altamente atraente por causa de sua facilidade de uso, baixo custo e a velocidade em comparação com outros modelos in vitro e animais de neurodegeneração. Aproveitamento anteriormente desenvolvido ALS e PD modelos22,23,25,26, podemos ter overexpressed humana FUS, TDP-43 e α-synuclein em levedura e mudanças PTM descobertos histona distintas ocorrem em conexão com cada proteinopathy30. O protocolo que descrevemos aqui pode ser concluído em menos de duas semanas de transformação para análise de dados.
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Protocol
1. transformar S. cerevisiae com construções de proteína associada proteinopathy neurodegenerativas
- Crescer tipo selvagem (WT) 303 fermento no fermento extrato peptona dextrose (YPD) caldo de carne durante a noite com agitação (200 rpm) a 30 ° C.
- Após 12−16 h do crescimento, diluir o fermento para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0.25 com YPD. Como 10 mL de cultura de levedura líquida serão necessários para cada transformação, preparar 50 mL de cultura de levedura líquida para cinco transformações correspondentes a FUS, TDP-43, um-synuclein e construções de vetor único (ccdB), bem como uma transformação de controlo negativo sem DNA.
- Cresce o fermento com agitação a 30 ° C até que seja alcançada uma OD600 entre 0,60 e 0,80. Isso geralmente leva 4−6 h.
- Trinta minutos antes do crescimento de levedura é completo, linearizar construções de plasmídeo.
Nota: As construções de plasmídeo usadas aqui devem integrar diretamente do genoma, e daí a linearização é necessária antes da transformação.- Calcule o volume de estoque de plasmídeo que equivale a 1 µ g. Subtrair este volume de 44 µ l para calcular a quantidade de nuclease livre H2O necessário.
- Adicione nuclease livre H2O, 5 µ l de tampão de enzima de restrição x 10 (Tabela de materiais), 1 µ l da enzima de restrição NheI (Tabela de materiais) e a quantidade adequada de plasmídeo (calculado na etapa 1.4.1) para um tubo de microcentrifugadora. Misture bem, pipetando para cima e para baixo e incubar a 37 ° C por 15 min. O plasmídeo agora é linear e pronta para a transformação.
- Após o fermento cultura atinge uma OD600 de 0,6-0,8, colheita de células em um tubo cônico de 50 mL e spin-down a 850 x g a 4 ° C por 3 min. Discard sobrenadante.
- Lave centrifugado em 10 mL de estéril H2O e centrifugar 850 x g a 4 ° C por 3 min. Discard sobrenadante. Repita 3 x para um total de quatro lavagens.
- No início da terceira lavagem, descongelar e ferver 10 µ l de esperma de salmão DNA por reação de transformação por 5 min num bloco de aquecimento.
- Resuspenda o pellet de células em 100 µ l de dH2O por transformação e dividido em um número adequado de microcentrifuga tubos. Para cinco transformações, resuspenda o pellet em 500 µ l de dH2O e dividir uniformemente em cinco tubos microcentrifuga separado.
- Centrifugue por 5 min a 850 x g , à temperatura ambiente (RT) e remover toda a água restante.
- Adicione, na seguinte ordem, 50 µ l de estéril H2O, 240 µ l de 50% polietileno glicol (PEG), µ l 36 de 1m LiAc, 10 µ l de esperma de salmão DNA, 20 µ l de plasmídeo linear (ou água livre de nuclease para nenhuma transformação de controle do DNA). Misture bem após cada adição e vórtice brevemente depois que todos os componentes de transformação foram adicionados.
- Incube as reações de transformação a 42 ° C por 20 min.
Nota: Efectue esta incubação num banho de água para controle de temperatura mais consistente. - Centrifugar a 470 x g em RT durante 5 min. Discard sobrenadante e ressuspender cada célula em 200 µ l de estéril H2O.
- Placa de suspensão de leveduras em placas de meios selectivos e espalhar com rolamento de esferas ou propagador. Incubar as placas 2−3 dias a 30 ° C.
Nota: Sintético-definido (SD)-suas placas são utilizadas para os plasmideos descritos aqui.
2. Agrimensura supressão de crescimento de colônia e armazenamento em estoques de glicerol
- Inocule colônias única de chapas de transformação em 5 mL de meios selectivos, suplementados com 2% rafinose. Cresce num agitador a 30 ° C durante a noite. Selecione pelo menos 12 colónias por transformação.
Nota: Não há colônias são esperadas na placa de controle de transformação de "nenhum DNA". - Esterilize o pin-frogger com etanol, seguido em chamas.
- Para cada cultura, alíquota 100 µ l de suspensão de células saturado na primeira linha de uma placa de 96 poços. Adicione 200 µ l de estéril H2O em todos os poços das colunas adjacentes bem. Para diluições de 1:5 série, adicione 50 µ l da primeira coluna para a coluna adjacente para trás com pipeta multicanal. Misture bem por pipetagem. Adicione 50 µ l da segunda coluna para a terceira coluna e mistura pipetando. Repita isto para o resto da placa.
- Fermento de placa colocando frogger em uma placa de 96 poços e então carimbo pressionando delicadamente e uniformente para baixo em placas de meios selectivos com e sem galactose. Incube a 30 ° C para 2−3 dias.
Nota: Placas SD-His e SGal-His são utilizadas para os plasmideos descritos aqui. - Para FUS, TDP-43 e transformações de um synuclein, identifica a colônia exibindo a maioria supressão de crescimento na presença de galactose. Selecione esta colônia do SD, seu prato e inocular em 10 mL de meios selectivos, suplementados com rafinose de 2% de crescimento durante a noite. Para o controle de vetor, escolhe uma colônia exibindo sem supressão de crescimento na presença de galactose.
- Para preparar ações de glicerol, combine 0,5 mL de cultura líquida saturada com 0,5 mL de glicerol a 50%. Misture pipetando para cima e para baixo e congelar a-80 ° C.
Nota: As existências de glicerol podem ser armazenadas por até um ano a-80 ° C.
3. superexpressão de proteinopathy neurodegenerativas associadas a proteínas no S. cerevisiae
- De estoques de glicerol congelado, re-raia fermento em histidina, 2% glicose ágar seletivo mídia placas e incuba a 30 ° C para 2−3 dias.
- Inocule colônias única para cada um dos modelos de superexpressão e controle em 5 mL de meio líquido seletivo histidina, suplementado com 2% rafinose. Cresce com agitação (200 rpm) a 30 ° C durante a noite.
- Crescer 100 mL de cultura líquida para cada um dos modelos de superexpressão e controles (FUS, TDP-43 e o vetor de controlam; por-synuclein e o vetor de controle).
- Prepare 100 mL de cultura em meios selectivos, suplementados com 2% de galactose.
- Medir o OD600 de culturas durante a noite e calcular a quantidade de cultura durante a noite, necessária para processar culturas superexpressão em uma partida de OD600 de 0.3. Normalmente, as culturas durante a noite vão chegar uma OD600 de 0.9−10, exigindo cerca de 5 mL de cultura durante a noite para começar a 100 mL de cultura fresca.
- Induzir a superexpressão da proteína pelo crescimento de levedura na mídia de galactose (consulte a etapa 3.3.1) para 5h (FUS e TDP-43) ou 8 h (um synuclein), com agitação a 30 ° C.
- Medida OD600 de cada cultura no final do período de indução. Padronize todas as acusações de célula para o valor mais baixo de600 OD. Colheita de cultura em tubos de 50 mL por centrifugação a 850 x g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante.
Nota: Se os valores de600 OD medidos no final da indução são 0.654 e 0,984, respectivamente, para 100 mL de cultura de um synuclein e 100 mL de cultura de controle, colheita 95 mL da cultura por-synuclein e 67,1 mL de cultura de controle. - Resuspenda o pellet em 1 mL de estéril dH2O para cada 10 mL de cultura cultivada. Pellet de Split uniformemente por alíquotas de 1ml de ressuspensão de célula para tubos microcentrifuga. Por exemplo, se iniciando com 100 mL de cultura, resuspenda o pellet em 10 mL de estéril dH2O e dividi-lo em 10 tubos microcentrifuga.
- Centrifugar a 850 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, remover o sobrenadante. Snap freeze pelotas de célula em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
Nota: Aglomerados de células podem ser armazenados a-80 ° C por até um ano.
4. celular Lise e mancha ocidental para detectar modificações borne-translational histona
- Lise celular
- Descongelar as pelotas de células de levedura no gelo e Resuspenda pelotas de célula em 100 µ l de dH2O.
- Para a ressuspensão de célula, adicione 300 µ l de 0,2 M de NaOH e 20 µ l de 2-Mercaptoetanol. Resuspenda pipetando para cima e para baixo.
- Incubar as células no gelo por 10 minutos e em seguida centrifugar a 3.200 x g em uma centrífuga de mesa para 30 s no RT. Discard sobrenadante.
- Resuspenda o pellet de células em 100 µ l de 1 x carregamento corante e deixe ferver por 10 min em um bloco de aquecimento.
Nota: A receita para 6 x tintura de carregamento encontram-se na Tabela de materiais.
- Transferência de electroforese do gel de polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio e membrana
- Prepare o gel de câmara, colocando dois géis em um gel de titular e enchimento câmara interna para a parte superior com tampão em execução e enchendo a Câmara exterior à marca linha dois-gel.
- Carrega 15 µ l de amostra da etapa 4.1.4 por alvéolo em um gel de polyacrylamide do bem 10 12%. Para a pista de escada de proteína, carrega 5 µ l.
- Funcione o gel por aproximadamente 45 min a 150 V, ou até carregar frente corante atinge a parte inferior do gel.
- Enquanto o gel está sendo executado, prepare-se para transferência de membrana imersão pastilhas de fibra (duas por gel) no buffer de transferência (Tabela de materiais) e saturando a membrana de polivinilideno fluoreto (PVDF) em metanol. Lave a membrana no buffer de transferência antes de transferência.
Nota: A membrana PVDF deve ser cortado para o tamanho do gel e usar uma membrana PVDF para cada gel sendo transferido. - Reúnam-se, na célula de aparelhos de transferência semi-seca, uma transferência 'sanduíche': do eléctrodo de fundo, coloque a almofada de fibra (1) presoaked, (2) presoaked e enxaguada membrana PVDF, (3) gel da etapa 4.2.3 e (4) um segundo bloco de fibra presoaked.
Nota: Certifique-se de evitar bolhas de ar na transferência 'sanduíche'. Rode suavemente 'sanduíche' com pipeta sorológica de forçar a eliminação de bolhas. Uma vez que o gel foi colocado em cima da membrana PDVF, certifique-se de não movê-lo. - Realizar a transferência de proteína definindo power pack para 150 mA por 1h (para um ' sanduíche').
- Deteção de histona PTMs com anticorpos específicos de modificação
- Remova a membrana do aparelho de transferência. Lave brevemente com dH2O.
- Opcionalmente, marque a transferência das proteínas com mancha de Ponceau S derramando bastante mancha de Ponceau S para cobrir a membrana em uma pequena caixa de plástico e incubando em RT com agitação suave para s 30−60 Ponceau-S remover mancha e enxágue com dH2O até mancha de fundo desaparece e bandas de proteína são visíveis a olho nu. Continue a lavar com dH2O até qualquer mancha é removida da membrana.
- Bloquear a membrana incubando borrão para 1h no RT com balanço suave com tampão salino (TBS) bloqueio tampão tris (Tabela de materiais) em uma pequena caixa de coloração. Use bastante tampão de bloqueio para cobrir a mancha.
Nota: Tenha cuidado para colocar membrana vertical na caixa de coloração para que o lado de membrana no qual proteínas mentem não é virado para baixo. - Incubar o borrão na caixa coloração durante a noite com um anticorpo específico de modificação de histona reativa para levedura a 4 ° C. Dilua o anticorpo em tampão de bloqueio TBS de acordo com as especificações do fabricante. Também incluem um controle de carregamento nuclear adequada, como H3 anti-total gerado em uma espécie de host diferente do anticorpo específico de modificação. Por exemplo, se sondando para H3S10ph com um anticorpo anti-H3S10ph levantado no coelho, use um anticorpo de H3 anti-total gerado no mouse como um controle de carregamento. Repita isto para cada mancha conforme necessário.
Nota: As diluições de anticorpo podem ser reutilizadas para um total de três vezes dentro de um mês. Armazená-los em 4 ° C. - Lavar a membrana 4 x em casa-feito TBS + 0,1% polissorbato 20 (TBST) por 5 min com balanço no RT
- Incube blot com anticorpos secundários fluorescentes em diluições especificado pelo fabricante (burro anti-coelho 680 e anti-rato burro) por 1h no RT
Nota: Anticorpos secundários fluorescentes devem ser protegidos da luz durante o armazenamento e o uso. Realizar a incubação em caixas de plástico escuras ou cobrir com papel alumínio. - Lavar a membrana 4 x com TBST por 5 min e lave com TBS por 5 min enquanto balançando no RT
- Visualize mancha em um Western blot fluorescente, sistema de 2 min. de imagem Visualize o anti-coelho 680 e anticorpos secundários anti-rato 800 na 800 nm e 700 canais nm, respectivamente.
Nota: Repetições são conduzidas independentemente a partir da seção 1. É necessário verificar se a resposta do anticorpo sinal está dentro do intervalo no qual a resposta do sinal é linear para interpretação de dados apropriados nesses experimentos.
- Remova a membrana do aparelho de transferência. Lave brevemente com dH2O.
5. estatísticas e análise de dados
- Abrir imagem do borrão em um software de imagem (Tabela de materiais). Adquira a densidade bruta das amostras de faixas específicas modificação no vetor controle, TDP-43 e FUS (ou controle vetorial e por-synuclein), desenhando um retângulo que emoldura a banda no modo de análise.
- Repita a etapa 5.1 para bandas de controle de carregamento.
Nota: Haverá um carregamento controle de banda e uma banda de modificações específicas em cada amostra. - Calcule a densidade relativa das bandas modificação específica dividindo cada banda pela densidade da banda correspondente na amostra de controle de vetor. Isso normaliza os dados para o controle do vetor.
- Calcular a densidade relativa do carregamento banda controle dividindo cada banda pela densidade da carga correspondente banda de controle para a amostra de controle de vetor.
- Calcular a densidade relativa ajustada de cada banda, dividindo-se a densidade relativa da banda modificação específica sobre a densidade relativa do carregamento banda controle para cada amostra. Agora, os dados podem ser visualizados em forma de histograma.
Nota: Para facilidade de processamento, passos 5.3 – 5.5 podem ser feitos em uma planilha (Arquivo complementar). - Depois de várias repetições independentes, T-testes do execução Welch entre as amostras de controle de dois e o proteinopathy apropriado modelo (controle versus FUS, controle versus TDP-43 e controle versus um-synuclein), com p = 0,05 como o corte de significado .
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Representative Results
Para ilustrar este método, nós vai aproveitar resultados recentemente publicados30. WT FUS humana e TDP-43 eram overexpressed por 5h, enquanto WT α-synuclein foi overexpressed para 8 h. Uma construção de ccdB foi usada como um controle negativo do vetor. A Figura 2 mostra a supressão do crescimento em culturas de sólidos e líquidas. Levedura foi colhida conforme descrito e mancha ocidental com anticorpos específicos modificação foi realizada. Anti-total H3 foi usado como um controle de carregamento. Uma diminuição significativa dos níveis de H3S10ph e H3K14ac é aparente no modelo de superexpressão de FUS (Figura 3ab). Há um aumento significativo nos níveis de acetilação na H4K12 e H4K16 no modelo de superexpressão de TDP-43 que não são observadas em ambos os FUS ou modelo de superexpressão de α-synuclein (Figura 3 cd). Há também diminuições significativas nos níveis de H3K36me2 e H2BT129ph no modelo de superexpressão de α-synuclein (Figura 3ef).
Para mostrar que a mudança na histona PTMs correlaciona-se com a quantidade de expressão da proteína proteinopathy neurodegenerativas, a expressão de FUS pode ser ajustada através da indução de expressão de proteínas em níveis variados de galactose (figura 4a). Galactose é misturado com sacarose na mudança de proporções tais que a concentração total de açúcar é constante em 2%, mas a quantidade de galactose é modificada, resultando em uma gama de níveis de expressão de proteínas. No S. cerevisiae, sacarose é lentamente metabolizado em glicose, que suprime a galactose indução31. Daí, sacarose nem ativa nem suprime indução de galactose. Quanto menor a quantidade de galactose usado para induzir a superexpressão de FUS, observou-se a menor toxicidade na cultura de sólidos e líquida (figura 4bc). Importante, o mais baixo o nível de superexpressão de FUS, quanto menor a magnitude da redução nos níveis de H3S10ph (Figura 4 d-f).
Figura 1: Methodoverview para a caracterização das mudanças no borne-translational modificações do histone conectado a proteinopathies de doenças neurodegenerativas em modelos fermento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: toxicidade associada com superexpressão de proteínas relacionadas com proteinopathy de neurodegenerativas em modelos de fermento. Ensaios de spotting mostram viabilidade celular de levedura superexpressão controle vetorial, TDP-43, FUS ou α-synuclein na presença de glicose (um) ou galactose (b). (c) crescimento curva ilustrando a viabilidade celular em cultura líquida sob indução de galactose. Barras de erro indicam o desvio padrão de ±. n = 3 para todas as estirpes. Repetições resultam de experiências completamente independentes. Adaptado com permissão de Chen, K. et al. neurodegenerativas doença Proteinopathies estão ligados ao distinto do Histone Post-translational paisagens de modificação de dados. Químicos ACS neurociência. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: alterações em modificações borne-translational do histone associadas com superexpressão de proteínas relacionadas com proteinopathy de neurodegenerativas em modelos de fermento. Um modelo de proteinopathy FUS mostra diminuição dos níveis de (um) H3S10ph, n = 6 e (b), H3K14ac, n = 3. Por outro lado, um modelo de proteinopathy de TDP-43 mostra aumento dos níveis de (c), H4K12ac, n = 3 e (d), H4K16ac, n = 6, enquanto um modelo de α-synuclein mostra a diminuição dos níveis de (e), H3K36me2, n = 3 e (f), H2BT129ph, n = 7. Mostrar barras de erro + desvio padrão. *, p < 0.05, * * *, p < 0,001. Repetições resultam de experiências completamente independentes. Adaptado com permissão de Chen, K. et al. neurodegenerativas doença Proteinopathies estão ligados ao distinto do Histone Post-translational paisagens de modificação de dados. Químicos ACS neurociência. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: medida de diminuição nos níveis de H3S10ph está ligada ao nível de superexpressão de FUS. (um) Cartoon ilustração da utilização de sacarose e galactose rácios para ajustar a quantidade de superexpressão de FUS. (b) ensaios de Spotting mostrando viabilidade celular na presença de níveis variados de galactose. curva (c) crescimento em cultura líquida, mostrando a viabilidade celular na presença de níveis variados de galactose. Barras de erro indicam ± desvio-padrão. (d) representante immunoblots mostrando que a proteína FUS níveis ascensão como as células são expostas a aumentando rácios de galactose. Fosfoglicerato quinase (PGK) foi usada como um controle de carregamento. (e) representante immunoblots apresentando correspondentes diminuições nos níveis de H3S10ph com o aumento de rácios de galactose. histograma (f), quantificação de (e). n = 3 para cada condição. Barras de erro indicam + desvio padrão no gráfico de quantificação. Repetições resultam de experiências completamente independentes. Adaptado com permissão de Chen, K. et al. neurodegenerativas doença Proteinopathies estão ligados ao distinto do Histone Post-translational paisagens de modificação de dados. Químicos ACS neurociência. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui fornece uma maneira simples, conveniente e econômica de categorização de alterações de todo o genoma do histone PTM correlacionadas com proteinopathies neurodegenerativas. Embora existam outros modelos de ALS e PD, como in vitro murino e linhas de células humanas modelos de32, S. cerevisiae permanece atraente por causa de sua facilidade de uso. Por exemplo, modelos de fermento não requer o uso de um capuz estéril, nem eles exigem o intensivo treinamento que vai junto com o trabalho de cultura de células. Além disso, os reagentes para cultivo de levedura são também muito mais acessíveis do que fontes de cultura de células de mamíferos. Modelos de levedura tem sido explorados para não só revelar os determinantes do domínio da proteína agregação22,23,24,25,26, mas também levaram à descoberta de risco genético fatores em ALS27, bem como modificadores de proteína agregação toxicidade22. Além disso, a supressão do Set3, membro da histona deacetilase complexo, foi encontrada para reduzir a toxicidade de TDP-43 em levedura33. Curiosamente, nossos resultados no fermento estão de acordo com recentes relatórios sobre alterações de modificação de histonas em ambos um modelo do rato FUS e em um humano SH-SY5Y FUS superexpressão modelo34,35. Além disso, descobri recentemente alterações nos padrões de metilação do DNA em torno de genes PD-chave, tais como SNCA e PARK2, um papel de suporte para epigenética em PD36,37.
Aqui, nós mostramos que esses modelos de fermento também podem ser usados para descobrir como proteinopathies neurodegenerativas interagem com o epigenoma30. Encontramos que mudanças distintas em modificações do histone estão associadas com cada modelo de proteinopathy. O protocolo descrito aqui nos permite corroborar conclusões anteriores em outros sistemas de modelo. Mais notavelmente, este método tem uma elevada nossa compreensão do panorama epigenomic de doenças neurodegenerativas. O conjunto expandido de modificações apresentadas aqui poderia descobrir alvos de escritor e eliminador de histona romance para intervenção farmacológica. Estes resultados destacam a possível contribuição de histonas PTMs e epigenética na patologia da ALS, PD e outras doenças neurodegenerativas e podem fornecer novas avenidas para tratamento destas doenças.
Especial cuidado deve ser tomado em etapas 1.9 e 1.10 ao transformar o fermento para overexpress proteinopathies neurodegenerativas. Especificamente, adicionar os reagentes na ordem correta durante a etapa de 1.10 é necessário garantir a transformação de alta eficiência. Além disso, é muito importante escolher a colônia exibindo a supressão de crescimento a maioria em galactose. Deve também ter cuidado ao montar o sanduíche de Western. Adição acidental de bolhas entre o gel e membrana irá bloquear a transferência da proteína e fornecer pontos de bloco sobre o Borrão que pode dificultar a análise de dados.
Uma limitação do presente protocolo é que os anticorpos são restritos a apenas vinculação e detecção de modificações do histone de um ou dois de cada vez. Também é crucial padronizar corretamente as amostras após a superexpressão da proteína (3.4−3.6 passos). Remover completamente todo crescimento mídia irá garantir que cada pellet celular acaba resuspended no mesmo volume. Da mesma forma, é importante a alíquota cuidadosamente a mesma quantidade de suspensão de células para os tubos de microcentrifuga (passo 3.4). Se as amostras não são devidamente padronizadas, é difícil tirar conclusões de quaisquer alterações nos níveis de PTM de histona. Esse problema se tornaria aparente discrepâncias nos níveis do controle de carregamento do Western blot (seção 4.2). Para remediar esta situação, um gel de SDS-PAGE carregado com amostras relevantes pode ser Coomassie manchado, permitindo a quantificação de banda proteína das amostras (seção 5) e subsequente re-padronização de amostras com base na quantidade de proteína presente em cada amostra.
Em conclusão, este protocolo permite a análise de histona PTM mudanças associadas a superexpressão de proteínas relacionadas com proteinopathies neurodegenerativas em pouco menos de duas semanas, de transformação para análise estatística. Além de permitir o estudo das proteinopathies associadas com doenças neurodegenerativas, este protocolo geral pode ser usado para estudar alterações de histona PTM em qualquer modelo de superexpressão de levedura.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen para ajuda técnica. Nós estamos muito gratos ao Prof James Shorter para a oferta generosa de reagentes e assistência intelectual no design de experimentos de sintonização de sacarose. Plasmídeos de levedura foram um presente generoso do Prof Aaron Gitler (incluindo 303Gal-FUS; Plasmídeo Addgene # 29614). Brooklyn College e o centro de pesquisa ciência avançada (CUNY), bem como um NIH NINDS Advanced Postdoctoral transição Award (K22NS09131401) com suporte M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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