Summary
Этот протокол определяет экспериментальной процедуры характеризовать геном-изменения в уровнях столб-поступательные изменения гистона (ПТМ), возникающих в связи с гиперэкспрессия белков, связанные с ALS и болезни Паркинсона в Saccharomyces cerevisiae модели. После разъединения SDS-PAGE отдельные гистона PTM уровни концентрации обнаружены с модификации специфические антитела через западный blotting.
Abstract
Нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD), приводят к потере сотен тысяч жизней каждый год. Хватает эффективного лечения может остановить прогрессирование болезни. Несмотря на обширные последовательности в больших популяциях пациентов в большинстве случаев ALS и PD остаются необъяснимые, генетические мутации в одиночку. Эпигенетики такие механизмы, как столб-поступательные изменения гистона белков, могут быть вовлечены в этиологии нейродегенеративных заболеваний и прогрессии и привести к новые цели для фармацевтических вмешательства. Млекопитающих в vivo и in vitro модели ALS и PD являются дорогостоящими и зачастую требует длительных и трудоемких экспериментальных протоколов. Здесь мы приводим практический, быстрой и экономически подход к определению генома общесистемной изменения гистона модификации уровней с помощью Saccharomyces cerevisiae как модель системы. Этот протокол позволяет для всеобъемлющего расследования эпигеномные изменения, подключенных к нейродегенеративных proteinopathies, что подтверждают ранее сделанные выводы в различных модельных системах значительно расширяя наши знания о нейродегенеративные заболевания epigenome.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания являются разрушительных болезней с практически нет доступных вариантов лечения. Среди них особенно страшны боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD). Примерно в 90% случаев ALS и PD считаются спорадические, происходящие без семейной истории болезни, в то время как оставшиеся дела работать в семьях и как правило связаны с конкретным ген мутации1,2. Интересно, что оба этих заболеваний связаны с белком mislocalization и агрегации3,4,5,6. К примеру, сливается в саркома (FUS) и TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43) являются белки, связывающие РНК mislocalize в цитоплазму и объединяют в ALS7,8,9,10, 11,12, в то время как α-synuclein — это компонент принципа белковых агрегатов, называется Леви органов в PD5,13,14,15.
Несмотря на обширные генома всей ассоциации в больших популяциях пациентов подавляющее большинство случаев ALS и PD оставаться необъяснимая генетически. Можно эпигенетики играть определенную роль в нейродегенеративных заболеваний? Эпигенетики включает в себя изменения в экспрессии генов, происходит без изменения базовой последовательности ДНК16. Основные эпигенетический механизм включает столб-поступательные изменения (PTMs) гистоновых белков16. В эукариотических клетках генетический материал плотно завернута в хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, состоящий из 146 пар оснований ДНК, обернутые вокруг гистона octamer, состоящий из четырех пар гистонов (две копии каждого гистонами H2A, H2B, H3 и H4)17. Каждый гистона имеет N-терминальный хвост, который выступает из нуклеосомой и может быть изменена путем добавления различных химических постановление, обычно на остатков лизина и аргинина18. Эти PTMs являются динамическими, что означает, что они могут быть легко добавлены и удалены и включают группы ацетилирования, метилирование и фосфорилирования. PTMs контролировать доступность ДНК транскрипционный анализ техники и тем самым помочь управления ген выражение18. К примеру, ацетилирование гистона уменьшает силы электростатического взаимодействия между очень основные гистона белка и отрицательно заряженной ДНК позвоночника, позволяя гены, Упакованные ацетилированный гистонами быть более доступным и, таким образом высоко выраженная19. Совсем недавно замечательный биологических специфику конкретных гистона PTMs и их комбинаций привела к гистона кода гипотеза20,21 в котором белки, писать, стереть и чтение гистон PTMs все согласованно действовать для модулировать экспрессию генов.
Дрожжей является очень полезной моделью для изучения нейродегенеративные. Важно отметить, что многие нейрональных клеточных пути сохраняются из дрожжей для людей22,,2324. Дрожжи пилки цитотоксичность фенотипы и белковых включений по гиперэкспрессии FUS, TDP-43 или α-synuclein22,23,24,25,26. В самом деле Saccharomyces cerevisiae модели ALS были использованы для выявления генетических факторов риска в людей27. Кроме того дрожжи, экспрессирующих человека α-synuclein разрешено для характеристики сети Rsp5 как druggable цель улучшения α-synuclein токсичности в нейроны28,29.
Здесь мы описываем протокол эксплуатации Saccharomyces cerevisiae для выявления генома wide гистонов PTM изменения, связанные с нейродегенеративных proteinopathies (рис. 1). Использование S. cerevisiae весьма привлекательными из-за его простоту использования, низкая стоимость и скорость по сравнению с другими in vitro и животных моделей нейродегенеративные. Использование ранее разработан ALS и PD модели22,23,25,26, мы оверэкспрессировали человека FUS, TDP-43 и α-synuclein в дрожжей и открытые собственный гистона PTM изменения, происходящие в связь с каждой proteinopathy30. Протокол, который мы описываем здесь может быть завершена в менее чем за две недели от преобразования для анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. преобразование S. cerevisiae с нейродегенеративных proteinopathy связанные белком конструкции
- Расти дикого типа (WT) 303 дрожжи в дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) бульон на ночь с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C.
- После 12−16 h роста, развести дрожжи оптической плотности на 600 Нм (600OD) 0.25 с YPD. Как 10 мл жидкой культуры дрожжей будет необходимо для каждого преобразования, подготовьте 50 мл жидкого культуры дрожжей для пяти преобразований, соответствующий FUS, TDP-43, a-synuclein и конструкции вектора только (ccdB), а также преобразования отрицательного контроля без ДНК.
- Растут дрожжи с перемешиванием на 30 ° C, пока не будет достигнуто ОД600 между 0,60 и 0,80. Это, как правило, занимает 4−6 h.
- Тридцать минут, прежде чем рост дрожжей является полным, линеаризации плазмидные конструкции.
Примечание: Плазмидные конструкции, используемые здесь должна быть интегрирована непосредственно в геном, и следовательно до преобразования требуется линеаризации.- Вычислить объем запасов плазмида что составляет 1 мкг. вычесть этот объем от 44 мкл для расчета суммы нуклеиназы бесплатно H2O требуется.
- Добавление пробки microcentrifuge нуклеиназы бесплатно H2O, 5 мкл 10 x энзима ограничения буфера (Таблица материалов), 1 мкл NheI энзима ограничения (Таблица материалов) и соответствующее количество плазмида (исчисляемый шаг 1.4.1). Тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз и инкубировать при 37 ° C 15 мин. Плазмида в настоящее время линеаризованного и готовы к трансформации.
- После дрожжи культуры достигает ОД600 0,6-0,8, урожай клетки в 50 мл Конические трубки и спин вниз на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант.
- Вымойте клетки Пелле в 10 мл стерильной H2O и центрифуги на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант. Повторите 3 x для в общей сложности четыре смывки.
- В начале третьей стирки оттепель и варить 10 мкл спермы ДНК лосося за преобразование реакции на 5 мин на Отопление блока.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл dH2O на преобразование и разделить на соответствующее количество трубок microcentrifuge. Для пяти преобразований Ресуспензируйте Пелле в 500 мкл dH2O и равномерно разделена на пять отдельных microcentrifuge трубы.
- Центрифуга для 5 мин при 850 x g при комнатной температуре (RT) и удалить все остатки воды.
- В следующем порядке, 50 мкл стерильных H2O, 240 мкл 50% полиэтиленгликоля (PEG), 36 мкл 1 М LiAc, 10 мкл спермы лосося ДНК, 20 мкл линеаризованного плазмидной ДНК (или нуклеиназы свободной воды для преобразования управления ДНК). Тщательно перемешать после каждого добавления и вихревой кратко после добавления всех компонентов преобразования.
- Инкубируйте преобразования реакции при 42 ° C в течение 20 мин.
Примечание: Провести этот инкубации в водяной бане для более последовательного контроля температуры. - Центрифуга на 470 x g на RT для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 200 мкл стерильных H2O.
- Пластина подвески дрожжей на выборочной СМИ пластины и распространение с прокатки бисером или распределителя. Инкубировать пластины для 2−3 дня при температуре 30 ° C.
Примечание: Определенные синтетические (SD)-его плиты используются для плазмид, описанных здесь.
2. съемка подавления роста колонии и хранения в запасах глицерина
- Прививок одной колонии от преобразования пластины в 5 мл селективного СМИ, дополнена Рафиноза 2%. Растут на шейкер на 30 ° C на ночь. Выберите по крайней мере 12 колоний за преобразования.
Примечание: Не колоний ожидаются в пластину управления преобразования «нет ДНК». - Стерилизуйте контактный frogger с этанолом, следуют пылающий.
- Для каждой культуры, аликвота 100 мкл суспензии насыщенных клеток в первой строке 96-луночных плиты. Добавьте 200 мкл стерильных H2O на всех скважинах хорошо смежных столбцов. Для 1:5 серийных разведений добавьте 50 мкл из первого столбца в соседнем столбце позади с многоканальные пипетки. Тщательно перемешать, закупорить. Затем добавьте 50 мкл из второго столбца в третьей колонке и микс, закупорить. Повторите это для остальной части пластины.
- Пластина дрожжей, поместив frogger в 96-луночных пластине и затем штамповки аккуратно и равномерно нажимая вниз на выборочный СМИ пластины с и без галактозы. Инкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° С.
Примечание: SD-его и SGal-его плиты используются для плазмид, описанных здесь. - FUS, TDP-43 и а-synuclein преобразований определите колонии, отображение наиболее подавления роста присутствии галактозы. Выберите этот колонии от SD-его пластины и инокуляции в 10 мл селективного СМИ с 2% Рафиноза ночь роста. Для контроля переносчиков выберите отображение не подавление роста присутствии галактозы колонии.
- Подготовить глицерин запасов, объедините 0,5 мл насыщенной жидкости культуры с 0,5 мл 50% глицерина. Смешать, закупорить вверх и вниз и заморозить при температуре-80 ° C.
Примечание: Глицерин запасов может храниться до года-80 ° c.
3. гиперэкспрессия нейродегенеративных proteinopathy связанных белков в S. cerevisiae
- Из замороженных глицерин запасов, повторно испещрять дрожжей на гистидина, 2% глюкозы агар селективного СМИ пластины и проинкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° C.
- Для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроля в 5 мл гистидина селективного жидких сред с 2% Рафиноза инокуляции одной колонии. Расти с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C на ночь.
- Расти 100 мл жидкого культуры для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроль (FUS, TDP-43 и Векторный контроль;-synuclein и вектор управления).
- Подготовка 100 мл культуры в выборочной СМИ с 2% галактозы.
- Измерить ОД600 ночь культур и рассчитать количество ночь культуры, необходимые для визуализации гиперэкспрессия культур начала ОД600 0,3. Как правило на ночь культуры достигнет ОД600 0.9−10, требует около 5 мл на ночь культуры начать 100 мл свежего культуры.
- Побудить гиперэкспрессия белка путем выращивания дрожжей на СМИ галактозу (см. шаг 3.3.1) для 5 h (FUS и TDP-43) или 8 h (a-synuclein) с тряску при 30 ° C.
- Мера ОД600 каждой культуры в конце периода индукции. Стандартизация всех клеток с наименьшим значением600 ОД. Урожай в 50 мл трубки культуры центрифугированием при 850 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Примечание: Если ОД600 , измеренные в конце индукции 0.654 и 0,984, соответственно, 100 мл-synuclein культуры и 100 мл культуры управления, урожай 95 мл-synuclein культуры и 67,1 мл культуры управления. - Ресуспензируйте Пелле в 1 мл стерильного dH2O для каждые 10 мл культуры выросли. Равномерно разделить гранулы, aliquoting 1 мл клеток ресуспендирования в microcentrifuge трубы. Например если начиная с 100 мл культуры, Ресуспензируйте Пелле в 10 мл стерильной dH2O и разделить его на 10 microcentrifuge трубы.
- Центрифуга на 850 x g 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант. Оснастки замораживание клеток окатышей в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
Примечание: Клетки гранулы могут храниться при температуре-80 ° C на срок до одного года.
4. клетки лизис и Западный blotting для обнаружения столб-поступательные изменения гистона
- Лизис клеток
- Оттепель дрожжевых клеток окатышей на льду и Ресуспензируйте клеток окатышей в 100 мкл dH2O.
- Для ячейки взмучивания добавьте 0,2 М NaOH 300 мкл и 20 мкл 2-меркаптоэтанол. Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз.
- Инкубировать клетки на льду за 10 мин и затем центрифуги на 3200 x g на настольная центрифуга для 30 s на RT. удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл 1 x загрузки красителя и варить 10 мин на Отопление блока.
Примечание: Рецепт для 6 x загрузки краситель можно найти в Таблице материалов.
- Электрофорез геля полиакриламида додецилового сульфата натрия и мембраны передачи
- Подготовьте камеру гель, поставив два гели в гель держатель и заполнение внутренней камере на вершину с управлением буфера и заполнение вне камеры до отметки 2 гель линии.
- Загрузите 15 мкл пример из шага 4.1.4 за хорошо в геле полиакриламида 12% 10-хорошо. Для белка лестница Лейн нагрузка 5 мкл.
- Побегите гель для приблизительно 45 мин, 150 V, или до тех пор, пока загрузка краситель фронта достигает нижней части геля.
- Пока выполняется гель, подготовка к передаче мембраны путем замачивания волоконно колодки (два на гель) в буфер передачи (Таблица материалов) и замачивания винилидена фторида (PVDF) мембраны в метаноле. Промойте мембрану в буфер передачи перед передачей.
Примечание: PVDF мембрану должны быть сокращены к размеру геля и использовать один из PVDF мембраны для каждого гель переводится. - Монтаж на полусухой передачи аппарат клеток, передача «сэндвич»: от нижней электрода, место (1) замоченный волоконно колодки, (2) замоченный и промыть PVDF мембрану, (3) гель от шага 4.2.3 и (4) второй замоченный волоконно колодки.
Примечание: Убедитесь избежать воздушных пузырей в передаче «сэндвич». Аккуратно ролл «сэндвич» с Серологические Пипетки вытеснить пузыри. После того, как гель был сделан на вершине PDVF мембраны, убедитесь, что не для того переместить его. - Осуществлять передачи белка, установив пакет мощность до 150 мА на 1 ч (для одного «сэндвич»).
- Обнаружение гистона PTMs с модификации специфические антитела
- Удаление мембраны из передачи аппарат. Промойте кратко dH2O.
- При необходимости проверьте Перенос белков с пятно Пуансо, поливая достаточно Пуансо пятно покрытие мембраны в пластиковую коробочку и инкубации на RT с нежно тряска для 30−60 s. Удалите Пуансо пятно и промойте dH2O до тех пор, пока пятно фон исчезает и белка полосы видны невооруженным глазом. Продолжать промыть dH2O до тех пор, пока все пятно удаляется из мембраны.
- Блокировать мембраны, инкубации помарку для 1 h на RT с плавное покачивание с трис-буфер солевой (TBS) блокирующий буфер (Таблица материалов) в небольшой коробке окрашивание. Используйте достаточно блокирующий буфер для покрытия помаркой.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы место мембраны вертикально в поле окрашивания, так что стороной мембраны, на котором белки лежат не обращены вниз. - Инкубировать пятно в поле окрашивания на ночь с гистонов модификации специфические антитела реактивной к дрожжей на 4 ° C. Разбавьте антитела в блокирующем буфере TBS согласно спецификации производителя. Также включать элемент управления надлежащего ядерного загрузки, такие как анти всего H3, поднятые в различных принимающих видов от модификации специфические антитела. Например если зондирование для H3S10ph с антитела анти H3S10ph, вырос в кролика, используйте антитело против всего H3, вырос в мыши как элемент загрузки. Повторите это для каждого блот при необходимости.
Примечание: Разбавления антитела могут быть использованы для в общей сложности три раза в течение одного месяца. Хранить их при 4 ° C. - Промойте мембрану 4 x в дом сделал TBS + 0.1% Полисорбат 20 (TBST) за 5 мин с качания на RT.
- Инкубировать пятно с флуоресцентные вторичные антитела на указанный производителем разведений (осел анти кролик 680 и осел анти мышь) за 1 ч на RT.
Примечание: Флуоресцентные вторичные антитела должны быть защищены от света во время хранения и использования. Осуществлять инкубации в темные пластмассовые ящики или накрыть алюминиевой фольгой. - Промойте мембрану 4 x с TBST за 5 минут и промыть TBS 5 минут во время раскачивания на RT.
- Визуализация пятно на флуоресцентные западную помарку изображений системы за 2 мин визуализировать анти кролик 680 и вторичные антитела анти мыши 800 в 800 Нм, 700 Нм каналов и соответственно.
Примечание: Реплицирует независимо проводятся начиная с раздела 1. Необходимо убедиться, что сигнал реакции антитела находится в пределах диапазона, над которой сигнал ответа является линейным для интерпретации соответствующих данных в этих экспериментах.
- Удаление мембраны из передачи аппарат. Промойте кратко dH2O.
5. анализ данных и статистика
- Открыть изображение пятно в изображений программное обеспечение (Таблица материалов). Приобрести объемная плотность образцов изменения конкретных групп в вектор управления, TDP-43 и фу (или переносчиками и a-synuclein), нарисовав прямоугольник, кадры группы в режиме анализа.
- Повторите шаг 5.1 для загрузки элемента управления ленты.
Примечание: Там будет загрузки контролировать изменения конкретных диапазонах в каждом образце и. - Вычислить относительную плотность изменения конкретных групп путем деления каждой группы плотность соответствующей группы в образце векторного управления. Это нормализует данные с переносчиками.
- Вычислить относительную плотность нагрузки группы управления путем деления каждой группы плотность загрузки соответствующего управления полоса в образце векторного управления.
- Вычисления скорректированного относительная плотность каждой группы путем деления относительная плотность модификации конкретные группы над относительной плотности нагрузки группы управления для каждого образца. Теперь данные могут быть визуализированы в форме гистограммы.
Примечание: Для удобства обработки, шаги 5.3-5.5 может быть сделано в электронной таблице (Дополнительный файл). - После нескольких независимых реплицирует, выполнения Уэлч T-тесты между двумя контрольными образцами и соответствующие proteinopathy модели (элементы управления против FUS, управления по сравнению с TDP-43 и по сравнению с a-synuclein) с p = 0,05 как отсечки для значение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для иллюстрации этого метода, мы будем использовать недавно опубликованные результаты30. WT человека FUS и TDP-43 были оверэкспрессировали за 5 ч, в то время как WT α-synuclein был оверэкспрессировали за 8 ч. Конструкция ccdB был использован как элемент отрицательный вектор. Рисунок 2 показывает подавления роста в твердых и жидких культур. Дрожжей было собрано как описано и Западный blotting с модификации специфические антитела была выполнена. Анти всего H3 был использован как элемент управления загрузки. Значительное снижение уровня H3S10ph и H3K14ac проявляется в модели гиперэкспрессия FUS (Рисунок 3Аb). Существует значительное увеличение уровня ацетилирования на H4K12 и H4K16 в TDP-43 гиперэкспрессия модели, не наблюдаются ни FUS или α-synuclein гиперэкспрессия (рис. 3 cd). Существует также значительное снижение уровня H3K36me2 и H2BT129ph в α-synuclein гиперэкспрессия модели (Рисунок 3ef).
Чтобы показать, что изменение гистона PTMs коррелирует с количеством выражения протеина proteinopathy нейродегенеративных, выражение фу могут быть настроены, вызывая выражение протеина на различных уровнях галактозу (рис. 4a). Галактоза смешивается с сахарозы в изменении соотношения, таким образом, что общая концентрация сахара является постоянным на уровне 2%, но количество галактозы изменяется, что приводит к ряду уровнях выражения протеина. В S. cerevisiae, сахароза медленно метаболизируется до глюкозы, который подавляет галактозы индукции31. Следовательно сахароза активирует не подавляет всасывание галактозы. Чем меньше количество галактозы используется, чтобы вызвать гиперэкспрессия FUS, меньше токсичность наблюдалось в твердых и жидких культуры (рис. 4бc). Важно отметить, что чем ниже уровень гиперэкспрессия FUS, чем меньше величина снижения уровня H3S10ph (рис. 4 d-f).
Рисунок 1: Methodoverview для описания изменений в столб-поступательные изменения гистона подключен к нейродегенеративных заболеваний proteinopathies в моделях дрожжи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: токсичность связанные с гиперэкспрессия нейродегенеративных связанных с proteinopathy белков в моделях дрожжи. Кровянистые выделения анализы показывают жизнеспособность клеток дрожжей, экспрессирующих переносчиками, TDP-43, Фу или α-synuclein присутствии () глюкозы или галактозы (b). (c) рост кривой, иллюстрирующие жизнеспособность клеток в жидком культуре под галактозы индукции. Планки погрешностей указывают ± стандартное отклонение. n = 3 для каждого штамма. Реплицирует результатом полностью независимых экспериментов. Данные, адаптированных с разрешения Чэнь, K. et al., нейродегенеративные заболевания Proteinopathies подключены к собственный гистона Post-translational изменения ландшафтов. ACS химических нейронауки. 9 (4), 838-848 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: изменения гистона столб-поступательные изменения, связанные с гиперэкспрессия нейродегенеративных связанных с proteinopathy белков в моделях дрожжи. Фу proteinopathy модель показывает снижение уровня () H3S10ph, n = 6 и (b) H3K14ac, n = 3. И наоборот, TDP-43 proteinopathy модель показывает повышение уровня (c) H4K12ac, n = 3 и (d) H4K16ac, n = 6, в то время как α-synuclein модель показывает снижение уровня (e) H3K36me2, n = 3 и (f) H2BT129ph, n = 7. Ошибка бары шоу + стандартное отклонение. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Реплицирует результатом полностью независимых экспериментов. Данные, адаптированных с разрешения Чэнь, K. et al., нейродегенеративные заболевания Proteinopathies подключены к собственный гистона Post-translational изменения ландшафтов. ACS химических нейронауки. 9 (4), 838-848 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: степень снижения уровня H3S10ph связана с уровнем FUS гиперэкспрессия. () мультфильм иллюстрацией использования сахароза и галактозы коэффициенты для настройки количества FUS гиперэкспрессия. (b) зрительные анализов показаны жизнеспособность клеток при наличии различной галактозы. (c) рост кривой в жидком культуре, показаны жизнеспособность клеток при наличии различной галактозы. Планки погрешностей указывают ± стандартное отклонение. (d) представитель иммуноблотов показываю что Белка FUS уровнях подъем как клетки подвергаются воздействию увеличения соотношения галактозы. Phosphoglycerate киназы (ПГК) использовался в качестве элемента управления загрузки. (e) представитель иммуноблотов Показываю соответствующего снижения уровня H3S10ph с увеличением соотношения галактозы. (f) количественный гистограммы (e). n = 3 для каждого условия. Планки погрешностей указывают + стандартное отклонение для количественной оценки диаграммы. Реплицирует результатом полностью независимых экспериментов. Данные, адаптированных с разрешения Чэнь, K. et al., нейродегенеративные заболевания Proteinopathies подключены к собственный гистона Post-translational изменения ландшафтов. ACS химических нейронауки. 9 (4), 838-848 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанные здесь обеспечивает простой, целесообразным и экономически эффективным способом изменения генома wide гистонов ПТМ, коррелирует с нейродегенеративных proteinopathies классификации. Хотя есть другие модели ALS и PD, например в vitro линий клеток человека и мышиным модели32, S. cerevisiae остается привлекательным из-за своей простоты использования. К примеру дрожжи модели не требуют использования стерильных капот, ни они требуют, что интенсивное обучение, которое идет вместе с работой культуры клеток. Кроме того реагенты для культивирования дрожжей также являются гораздо более доступными, чем поставки культуры mammalian клетки. Дрожжи модели использовались не только выявить детерминанты домена протеина агрегации22,23,24,25,26, но также привели к выявлению генетического риска факторы в ALS27, а также модификаторы белка агрегации токсичности22. Кроме того исключить Set3, членом деацетилаз гистонов комплекс, были найдены для снижения токсичности TDP-43 в дрожжи33. Интересно, что наши выводы в дрожжи являются согласны с недавними сообщениями о модификации изменения гистона в обе модели мыши FUS и в человека SH-SY5Y Фу гиперэкспрессия модель34,35. Кроме того недавно обнаружил изменения в шаблоны метилирование ДНК вокруг ключевых генов PD, такие, как SNCA и PARK2, поддержка эпигенетики в PD36,37роль.
Здесь мы показываем, что эти модели дрожжи также может использоваться для обнаружения, как нейродегенеративных proteinopathies взаимодействуют с epigenome30. Мы находим, что собственный изменения гистона изменения, связанные с каждой моделью proteinopathy. Протокол, изложенные здесь позволяет нам подтвердить ранее сделанные выводы в других системах модель. Наиболее удивительно этот метод усилил наше понимание epigenomic Панорама нейродегенеративных заболеваний. Расширенный набор изменений, представленные здесь может раскрыть Роман гистона писатель и Ластик цели для фармакологического вмешательства. Эти результаты подчеркивают возможный вклад гистонов PTMs и эпигенетики в патологии ALS, PD и других нейродегенеративных заболеваний и может предоставить новые возможности для лечения этих заболеваний.
Особое внимание необходимо принимать в шагах 1.9 и 1.10 при преобразовании дрожжи для overexpress нейродегенеративных proteinopathies. В частности добавление реагентов в надлежащем порядке во время шага 1.10 необходима для обеспечения эффективности высокой трансформации. Кроме того очень важно выбрать отображение наиболее подавления роста в галактозу колонии. Следует также позаботиться при монтаже бутерброд Западной. Случайного сложения пузырей между гелем и мембраны будет блокировать передачу белка и обеспечивают блок роликов на пятно, что может затруднить анализ данных.
Одно ограничение этого протокола является, что антитела ограничены только привязки и обнаружения изменения гистона один или два за один раз. Важно также правильно стандартизировать образцы после гиперэкспрессия белка (шаги 3.4−3.6). Полностью удалить все роста, средства массовой информации будет гарантировать, что каждая ячейка Пелле ветров высокомобильна в том же объеме. Аналогичным образом, важно тщательно аликвота такое же количество суспензию клеток в microcentrifuge трубы (шаг 3.4). Если образцы не являются стандартизированными должным образом, трудно какие-либо выводы из любых изменений на уровнях PTM гистонов. Такая проблема станет очевидным в расхождения на уровне контроля погрузки Вестерн-блот (раздел 4.2). Чтобы исправить это, геля SDS-PAGE, загружен с соответствующими образцы могут быть Кумасси витражи, позволяя для количественного определения группы белков образцов (раздел 5) и последующего повторного стандартизации образцов, основанный на количестве белка в настоящее время на каждом образце.
В заключение этот протокол позволяет для анализа гистона PTM изменения, связанные с гиперэкспрессия белков, связанных с нейродегенеративных proteinopathies просто менее чем через две недели, от преобразования для статистического анализа. Помимо возможности изучения proteinopathies, связанные с нейродегенеративных заболеваний, этот общий протокол может быть использован для изучения изменения гистона PTM в любой модели гиперэкспрессия дрожжей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Royena Tanaz, Юсуф Худа и Sadiqa Taasen для получения технической помощи. Мы очень благодарны профессор Джеймс короче за щедрое предоставление реагентов и интеллектуальной помощи в разработке сахарозы настройки экспериментов. Плазмиды дрожжи были щедрый подарок от профессор Аарон Gitler (включая 303 Гал-Фу; Плазмиды # 29614 Addgene). Бруклинский колледж и расширенный научно исследовательский центр (КЮНИ), а также низ NINDS Advanced докторской перехода награду (K22NS09131401) поддержал M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013 (2017).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
