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Biochemistry

संपोषित कोशिकाओं में प्रकार्यीकृत नैनोबॉडीज का उपयोग करते हुए ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क में एन्डोसिटिक के उत्थान और प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

कोशिका की सतह से गोलगी के लिए प्रोटीन का प्रतिगामी परिवहन झिल्ली होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए biochemically सेल सतह का विश्लेषण करने के लिए-पुनः संयोजक प्रोटीन के golgi परिवहन HeLa कोशिकाओं में क्रियाशील नैनोबॉडीज का उपयोग ।

Abstract

कोशिका की सतह से गोलगी के लिए प्रोटीन और झिल्ली का परिवहन और परे होमियोस्टेसिस, अंगक पहचान और शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक है । प्रतिगामी प्रोटीन ट्रैफ़िक का अध्ययन करने के लिए, हमने हाल ही में एक बहुमुखी nanobody-आधारित टूलकिट विकसित किया है ताकि सेल की सतह से गोलगी कॉम्प्लेक्स तक परिवहन का विश्लेषण हो, या तो फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा, या बायोकैमिकली । हम क्रियाशील विरोधी हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) nanobodies इंजीनियर-छोटे, monomeric, उच्च संबध प्रोटीन बाँधने-कि सेल के लिए लागू किया जा सकता है एक extracellular gfp मोइटी के साथ ब्याज की झिल्ली प्रोटीन व्यक्त लाइनों । derivatized gfp पत्रकारों को बाध्य nanobodies विशेष रूप से भली भांति और ' पत्रकारों छंटाई मार्गों के साथ piggyback परिवहन कर रहे हैं । नैनोबॉडीज को फ्लोरोप्रेसेंस माइक्रोस्कोपी और लाइव इमेजिंग द्वारा प्रतिगामी परिवहन के साथ क्रियाशील किया गया था, एस्कॉर्बेट peroxidase 2 (APEX2) के साथ, इलेक्ट्रॉन द्वारा रिपोर्टर-नैनोबॉडी परिसरों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोपी, और tyrosine सल्फेशन (टीएस) के साथ ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क (tgn) आगमन की गतिकी का आकलन करने के लिए रूपांकनों । इस methodological लेख में, हम बैक्टीरियोली व्यक्त करने के लिए सामान्य प्रक्रिया रूपरेखा और क्रियाशील नैनोबॉडीज को शुद्ध । हम हमारे उपकरण के शक्तिशाली उपयोग का वर्णन mcherry-और टीएस संशोधित nanobodies का उपयोग करने के लिए endocytic उत्थान और कार्गो प्रोटीन के tgn आगमन का विश्लेषण ।

Introduction

कोशिका की सतह से प्रोटीन और लिपिड का प्रतिगामी यातायात विभिन्न इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए झिल्ली होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए counterbalance स्राव के लिए महत्वपूर्ण है और एंट्रोग्रेड परिवहन मशीनरी के घटकों को रीसायकल करने के लिए1 , 2. clathrin-निर्भर या-स्वतंत्र endocytosis के माध्यम से इंटर्नशिप के बाद, प्रोटीन और लिपिड कार्गो पहले जहां वे आगे भी endo-lysosomal प्रणाली, प्लाज्मा झिल्ली को पुनर्नवीनीकरण के साथ या तो पुनर्निर्देशित कर रहे हैं से जल्दी endosomes आबाद, या ट्रांस गोल्गी नेटवर्क (tgn) को लक्षित । endosomes और/या tgn के लिए सेल सतह से पुनर्चक्रण एंट्रोग्रेड ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर्स के एक नंबर के कार्यात्मक चक्र का हिस्सा है, जैसे धनायन निर्भर और धनायन स्वतंत्र मनोस-6-फॉस्फेट रिसेप्टर्स (cdmpr और cimpr) पहुंचाने नए संश्लेषित लाइसोसोमल हाइड्रोलीज़ को टीजीएन से देर से एंडोसोमस और लाइसोसोम3,4,5, सोर्टिलिं और सोरला6,7, और नाहीन (wls) को सेल की सतह पर wntless लिगंडस के परिवहन के लिए 8 , 9 , 10 , 11. अंय प्रोटीन tgn को वापस प्राप्त TGN46 और उसके संबंधित isoforms12,13,14, snares (घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील फ्यूजन फैक्टर लगाव रिसेप्टर्स) 15 , 16 , 17, एमीलॉइड प्रणेता प्रोटीन (एपीपी)18,19, प्रगतिशील एंसिलोसिस (ANK) प्रोटीन20, धातु ट्रांसपोर्टरों जैसे ATP7A/बी या DMT121,22, और ट्रांसमेम्ब्रेन कार्बोक्सिपेप्टिडेस डी, फ्रिन या BACE123,24,25सहित प्रोसेसिंग एंजाइम । इन अंतर्जात प्रोटीन के अलावा, जीवाणु और संयंत्र विषाक्त पदार्थों (जैसे, shiga और हैजा विष, ricin और abrin) अपहरण प्रतिगामी परिवहन मशीनरी cytosol26,27में retrotranslocation के लिए ईआर तक पहुँचने के लिए, 28,29.

आदेश में सीधे प्रतिगामी यातायात का विश्लेषण करने के लिए, हम पहले से एक nanobody-आधारित toolkit विकसित किया है लेबल और सेल की सतह से इंट्रासेल्युलर डिब्बों30के लिए कार्गो प्रोटीन का पालन करें । नैनोबॉडीज प्रोटीन के एक नए परिवार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो कि स्वाभाविक रूप से camelids और उपास्थि मछलियों31,३२में पाए जाने वाले समलैंगिकता भारी-श्रृंखला-केवल एंटीबॉडी (एचकेबीएस) से व्युत्पंन हैं वे चर भारी श्रृंखला hcabs के डोमेन (vhh) का गठन और पारंपरिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, iggs) पर कई फायदे हैं: वे monomeric हैं, छोटे (~ 15 केडीए), अत्यधिक घुलनशील, डिसल्फाइड बांड से रहित, जीवाणुरोधी व्यक्त किया जा सकता है, और के लिए चयनित उच्च-संबध बाइंडिंग३३,३४,३५,३६। हमारे nanobody उपकरण बहुमुखी और मोटे तौर पर लागू करने के लिए, हम सतह लेबल करने के लिए क्रियाशील विरोधी gfp nanobody कार्यरत है और उनके extracellular/lumenal डोमेन पर gfp के साथ टैग की गईं प्रोटीन ट्रैक । mcherry, एस्कॉर्बेट peroxidase 2 (APEX2)३७, या tyrosine सल्फेशन (टीएस) दृश्यों, वास्तविक ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो प्रोटीन के प्रतिगामी परिवहन के साथ nanobodies के functionalization द्वारा या तो फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, द्वारा इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी, या biochemically । tyrosylprotein सल्फोट्रांसटोरिज़ (TPST1 और TPST2) द्वारा मध्यस्थता के बाद से टायरोसिन सल्फेशन ट्रांस गोल्गी/tgn के लिए प्रतिबंधित एक posttranslational संशोधन है, हम सीधे सेल सतह से इस के लिए ब्याज की प्रोटीन की परिवहन और कैनेटीक्स का अध्ययन कर सकते हैं आंतरकोशिकीय गोलगी डिब्बा३८,३९,४०.

इस तरीके लेख में, हम क्रियाशील नैनोबॉडीज (vhh-2xts,-APEX2,-mcherry और डेरिवेटिव) के उत्पादन में आसानी का वर्णन आवेदनों की एक संख्या के लिए उपयुक्त स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण करने के लिए30. हम मुख्य रूप से सेल की सतह से सल्फेशन के डिब्बे के लिए इंट्रासेलुलर यातायात के विश्लेषण के लिए टीएस साइट-संशोधित नैनोबॉडी के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं ।

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Protocol

1. functionalized नैनोबॉडीज के साथ बैक्टीरियल परिवर्तन

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया गया है अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण, और के विश्लेषण के लिए क्रियाशील विरोधी gfp nanobodies के रूप में पहले30वर्णित है । अंय प्रोटीन moieties के साथ derivatization इस मानक प्रोटोकॉल के संशोधन की आवश्यकता हो सकती है ।

  1. गल chemocompetent बैक्टीरिया (~ १०० μl) प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त (जैसे, escherichia कोली rosetta BL21 (DE3) कोशिकाओं) उंहें बर्फ पर रखकर ।
    नोट: मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार chemocompetent बैक्टीरिया की कोशिकाओं को तैयार करें । वैकल्पिक रूप से, रासायनिक रूप से सक्षम बैक्टीरिया की कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है ।
  2. जोड़ें ५० एक प्लाज्मिड एंकोडिंग के एनजी क्रियाशील नैनोबॉडीज । को अनुमति देने के लिए पर्याप्त साइट-विशिष्ट जीवाणु अभिव्यक्ति के दौरान nanobody रिपोर्टर के बायोटिनीलेशन, भी जोड़ने के एक तीन गुना अतिरिक्त (१५० एनजी) एक जीवाणु अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एंकोडिंग बायोटिन ligase बीरा (प्लाज्मिड जानकारी के लिए भी तालिका 1 देखें) । धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट ।
    नोट: यदि नैनोबॉडी बायोटिनीलेशन आवश्यक नहीं है या नैनोबॉडी रिपोर्टर एक बायोटिन स्वीकारी पेप्टाइड (bap) से रहित हैं, तो एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग बीरा के साथ सह-परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है ।
  3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए जीवाणु कोशिकाओं को सेते हैं ।
  4. हीट एक पानी स्नान या एक हीटिंग ब्लॉक में ४२ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए उंहें रखने के द्वारा जीवाणु कोशिकाओं सदमे ।
  5. कमरे के 1 मिलीलीटर-तापमान (आरटी) luria शोरबा (पौंड) मध्यम जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए एक thermoshaker में बदल बैक्टीरिया सेते प्रतिरोध जीन की लक्षणप्ररूपी अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए । तैयार करने के लिए 1 एल पौंड मध्यम, शेष 5 जी खमीर निकालने के, 10 जी tryptone के और 10 ग्राम के nacl, पानी के साथ भरने और autoclaving द्वारा । यदि प्रकार्यीकृत नैनोबॉडी को एम्पिसिलिन/कार्बेनिसिलिन के प्रतिरोध वाले एक व्यंजक सदिश में उप-क्लोन किया गया है, तो चरण १.५ को छोड़ा जा सकता है ।
  6. ११,००० एक्स जी के लिए 1 मिनट और ताजा पौंड मध्यम के १०० μl में resuspend के लिए जीवाणुओं को गोली ।
  7. प्लेट संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पौंड प्लेटों पर निलंबित बैक्टीरिया (जैसे, ५० μg/एमएल कनमीसिन और ५० μg/एमएल कार्बेन्सिलिन के साथ जब बैक्टीरिया को नैनोबॉडी रिपोर्टर और बीरा के साथ सह-रूपांतरित किया गया है जैसा कि ऊपर कहा गया है (चरण १.२)) ।
  8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनकोबेटर में पौंड प्लेट्स रखें और रात भर बढ़ने दें (O/
    नोट: प्रोटोकॉल को 4 डिग्री सेल्सियस पर उगाए गए कालोनियों के साथ पौंड प्लेट को संग्रहित करके यहां रोका जा सकता है । पौंड प्लेटों को सील करने के लिए parafilm का प्रयोग करें ।

2. बैक्टीरियल तरल संस्कृति और functionalized नैनोबॉडी अभिव्यक्ति की प्रेरण

  1. प्लेट से ब्याज के वेक्टर युक्त एक बैक्टीरियल कॉलोनी उठाओ और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनकिबेटर में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक के 20 मिलीलीटर के साथ एक फ्लास्क में बढ़ने दें (चयन एंटीबायोटिक दवाओं के बारे में भी कदम १.७ देखें) ।
  2. अगले दिन, चयन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पौंड मध्यम के 1 एल युक्त एक फ्लास्क में उगाया 20 मिलीलीटर बैक्टीरियल संस्कृति को पतला ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल संस्कृति को सेते जारी रखें जब तक यह 0.6-0.7 के एक ओडी६०० तक पहुंचता है । प्रोटीन एक्सप्रेशन उत्प्रेरण से पहले संस्कृति को आरटी को शांत करने की अनुमति दें ।
  4. 1 मि. ली. आइसोप्रोपयल-β-डी-थिओग्लाक्टोपिरैनोसिड (आईपीटीजी) के 1 मिलीलीटर के जोड़ द्वारा प्रयुक् त नैनोबॉडीज और बिरा के प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित (1:1000 कमजोर पड़ने) के 1 मिमी के अंतिम सांद्रता के लिए । इसके अलावा एक 20 मिमी डी-बायोटिन स्टॉक समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ने में २०० μm डी-बायोटिन में जिसके परिणामस्वरूप विकास माध्यम में बाप एपिटोप के बायोटिनीलेशन को अनुमति देने के लिए क्रियाशील नैनोबॉडी (प्लाज्मिड जानकारी के लिए भी तालिका 1 देखें)
    नोट: डी-बायोटिन स्टॉक समाधान डीडीएच2ओ में तैयार किया जाता है और ५०० मिमी नाह2पीओ4के ड्रॉप-वार इसके अलावा समाधान में लाया जाता है । वैकल्पिक रूप से, डी-बायोटिन भी dmso में भंग किया जा सकता है । APEX2 (vhh-APEX2) के लिए नैनोबॉडीज का उत्पादन करने के लिए, LB माध्यम को 1 मिमी 5-अमीनोलेवुलिनिक एसिड (दाला) हाइड्रोक्लोराइड को हीम निगमन को बढ़ावा देने के साथ पूरक होना चाहिए । dALA ddh2हे में एक १०० मिमी स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जाता है ।
  5. वीएचएच-2xts के लिए 4 एच के लिए iptg-प्रेरित 1 L बैक्टीरियल संस्कृति को सेते हैं, 20 डिग्री सेल्सियस या आर टी ओ/एन के लिए वीएचएच-APEX2, या 16 डिग्री सेल्सियस पर vhh-mcherry के लिए (यह भी देखें प्लाज्मिड जानकारी के लिए तालिका 1 ) ।
    नोट: एक नया नैनोबॉडी निर्माण के लिए अभिव्यक्ति की स्थिति experimenter द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए.
  6. फ्लास्क से बैक्टीरिया की संस्कृति को एक 1 एल सेंटेरिगेशन बोतल में स्थानांतरित करें और ५,००० x g पर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए गोली दें । अधिवृंत और शुद्धि के साथ जारी है ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है पर बैक्टीरियल गोली भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के लिए । vhh के लिए गोली-APEX2 या vhh-mcherry आमतौर पर (क्योंकि शामिल heme की) भूरा है या गुलाबी, क्रमशः ।

3. कार्यीकृत नैनोबॉडीज का शुद्धिकरण

  1. यदि आवश्यक हो, बर्फ पर जमे हुए जीवाणु गोली गल (भी २.६ कदम देखें) ।
  2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा बैक्टीरियल सेल गोली और resuspend करने के लिए बर्फ की 30 मिलीलीटर-कोल्ड बाइंडिंग बफर (1 एक्स पीबीएस में 20 मिमी imidazole) जोड़ें । एक लेबल ५० मिलीलीटर ट्यूब में सस्पेंड बैक्टीरिया स्थानांतरण ।
  3. 30 मिलीलीटर बाध्यकारी बफर के साथ पूरक २०० μg/एमएल lysozyme, 20 μg/एमएल dnase मैं, 1 मिमी mgcl2 और 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (pmsf) और आरटी पर 10 मिनट के लिए पहले सेते, और फिर एक अंत पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए अंत में शेखर.
  4. एक टिप sonicator निलंबन में रखकर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में यांत्रिक रूप से जीवाणु कोशिकाओं लाइसे । के बीच में 1 मिनट ठंडा अवधि के साथ लगातार 3x 1 मिनट दालों लागू करें ।
  5. ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १५,००० एक्स जी पर बैक्टीरिया lysate अपकेंद्रितकरें मलबे और अक्षुण्ण कोशिकाओं को गोली । sonicated बैक्टीरियल सेल lysate हस्तांतरण या तो एक उपयुक्त केन्जिगेशन बोतल में अपकेंद्रीकरण के लिए या टेबलटॉप अपकेंद्रीकरण के लिए कई 5 मिलीलीटर ट्यूबों में lysate विभाजित ।
  6. सतह पर तैरनेवाला एक नई ५० मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण और pelleted मलबे त्यागें ।
  7. मैटीरियल मेटल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) द्वारा शुद्धि की तैयारी करते हुए बर्फ पर क्लीयर lysate स्टोर । हिस्टिडीन को अलग करने के लिए-चिह्नित क्रियाशील नैनोबॉडीज, एक काम अपने कॉलम ( सामग्री की तालिकादेखें) तेजी से और सरल गुरुत्वाकर्षण प्रवाह शुद्धि की अनुमति का उपयोग करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक स्तंभों के बजाय बैच शुद्धि भी उपयोग किया जा सकता है ।
  8. एक धातु स्टैंड पर अपने कॉलम बढ़ते ।
    1. कॉलम ' भंडारण समाधान से बाहर टेपर, और बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर (1x pbs में 20 मिमी imidazole) के साथ अपने कॉलम equilibrate ।
    2. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा खाली (प्रवाह के माध्यम से छोड़ दिया जा सकता है) ।
  9. धीरे से कॉलम पर मंजूरी दे दी बैक्टीरियल lysate (~ 30 मिलीलीटर) लोड । गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा खाली (प्रवाह के माध्यम से छोड़ दिया जा सकता है) ।
  10. बंधन बफर के 10 मिलीलीटर (1x पीबीएस में 20 मिमी imidazole) के साथ अपने कॉलम 2x धो लें ।
  11. एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में 2 मिलीलीटर elute बफर (५०० मिमी इमिडाजोल में 1 एक्स पीबीएस) के साथ नैनोबॉडीज को बदलना और एक बफर एक्सचेंज लागू करें ।
  12. बफर एक्सचेंज ।
    1. एक डिसॉल्टिंग कॉलम ( सामग्री तालिकादेखें) एक ५० मिलीलीटर ट्यूब कॉलम एडाप्टर में रखा 5 बार 1x pbs के 5 मिलीलीटर के साथ equilibrate ।
    2. बफर पैक बिस्तर में प्रवेश करने की अनुमति दें । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    3. पांचवें pbs समानता के बाद, 2 मिनट के लिए १,००० एक्स जी पर कॉलम स्पिन ।
    4. प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    5. एक नई ५० मिलीलीटर ट्यूब पर एडाप्टर के साथ कॉलम रखें । (चरण ३.११ से) पीबीएस-equilibrated विलवटिंग कॉलम और 2 मिनट के लिए १,००० एक्स जी पर स्पिन और eluted इकट्ठा पर (कदम से) eluted के 2 मिलीलीटर लोड ।
      नोट: वाणिज्यिक विलवटिंग कॉलम के बजाय, डायलिसिस का आदान-प्रदान बफर संरचना के लिए किया जा सकता है ।
  13. निर्माता के निर्देशों के अनुसार bicinchoninic (बीसीए) या ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर eluate की प्रोटीन (nanobody) एकाग्रता निर्धारित करें ।
    नोट: gfp रिपोर्टर सेल लाइनों, 2-10 मिलीग्राम/एमएल की एक शेयर एकाग्रता के द्वारा nanobody के लिए उपयुक्त assays इष्टतम है ।

4. functionalized नैनोबॉडी अभिव्यक्ति का सत्यापन (coomassie धुंधला)

  1. मानक प्रोटोकॉल्स के अनुसार सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीऐक्रिलेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) के लिए 10-12.5% जैल तैयार करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रीकास्टिंग ग्रैडिएंट जैल का उपयोग करें ।
  2. पिपेट के 20 μg शुद्ध क्रियाशील नैनोबॉडी में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और फोड़ा नमूना बफर में ९५ ° c के लिए 5 मिनट.
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, 2x नमूना बफर के 10 μl के साथ एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक 2 मिलीग्राम/एमएल नैनोबॉडी स्टॉक समाधान के 10 μl जोड़ें । यदि मात्रा बहुत छोटा है, आगे pbs में पतला nanobody नमूना बफर जोड़ने से पहले ।
  3. एक एसडीएस पर नमूना बफर में उबला हुआ शुद्ध नैनोबॉडी लोड-polyacrylamide जेल, और संदर्भ डाई तक मानक पृष्ठ प्रोटोकॉल के अनुसार चलाने (जैसे, ब्रोमोफीनॉल नीला) अलग जेल के अंत तक पहुँच गया है, coomassie धुंधला द्वारा पीछा किया और destaining ।
  4. coomassie जेल धुंधला और destaining ।
    1. जेल uncast और यह coomassie धुंधला समाधान के साथ दाग (एक 10 ग्राम में 5%/एल coomassie स्टॉक समाधान 10% एसिटिक एसिड में और ddh2हे में ४५% मेथनॉल के लिए) एक चलती मिलाते हुए मंच पर आरटी पर 20-30 मिनट के लिए । जेल धुंधला समाधान में पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए ।
    2. destain समाधान के साथ जेल 2-3 बार (७.५% एसिटिक एसिड और ddh2हे में 15% मेथनॉल) 1 एच के लिए प्रत्येक RT में, जेल ओ/एन को आगे destaining के लिए रवाना होने से पहले ।
      नोट: अतिरिक्त coomassie कुशलता से जेल के आसपास रसोई कागज तौलिए रखकर लथपथ किया जा सकता है ।
  5. छवि एक imager या पसंद के कैमरे के साथ जेल ।
    नोट: नैनोबॉडी एक्सप्रेशन को अपने epitopes को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनलॉट विश्लेषण द्वारा और सत्यापित किया जा सकता है ( यह भी चित्र 1aदेखें).

5. प्रतिदीप्ति अभिरंजक के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा functionalized नैनोबॉडीज के ऊपर उठाना

  1. एक सेल संस्कृति हुड में, बीज ~ ४००,००० करने के लिए ५००,००० HeLa कोशिकाओं stably 18 पर एक gfp टैग रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त-मिमी बर्तन या 6-अच्छी तरह से पूर्ण माध्यम के साथ समूहों में ३५-mm व्यंजन (No. 1.5 h)-एंटीबायोटिक्स युक्त (dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, dmem , के साथ पूरक 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), १०० इकाइयों/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल-glutamine, और १.५ μg/एमएल प्रोमाइसिन) ।
    नोट: यहाँ हम हेला कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो दृष्टांत प्रयोजनों के लिए egfp-calnexin, egfp-cdmpr और tfr-egfp व्यक्त करते हैं । स्थिर सेल लाइनों के अलावा, यह भी संक्रमण से संक्रमित हेला कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । स्थिर सेल लाइनों माता पिता गैर transduced हेला कोशिकाओं के साथ इस कदम पर सह खेती की जा सकती है, प्रत्यक्ष तुलना के लिए ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ७.५% सह2 इनकोबेटर में कोशिकाओं को इंसेब्रेट करें ।
    नोट: कोशिकाओं को अगले दिन ~ ८०% का एक कन्फ्लुएंसी होना चाहिए ।
  3. एक 15 या ५० मिलीलीटर पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में एक 2 मिलीग्राम/एमएल नैनोबॉडी स्टॉक समाधान के पिपेट 2 μl (इस मात्रा में एक ३५ मिमी पकवान या एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से क्लस्टर को कवर करने के लिए पर्याप्त है, मध्यम और नैनोबॉडी की मात्रा आनुपातिक रूप से अधिक सेल संस्कृति को शामिल करने के लिए समायोजित करें d ishes या क्लस्टर्स) ।
    नोट: चित्रण के प्रयोजन के लिए, हम यहां vhh-mcherry का उपयोग करें, के बाद से कोई और एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए egfp संवाददाताओं द्वारा भली भांति नैनोबॉडी देखने की आवश्यकता है ( चित्रा 2cदेखें) ।
  4. कोशिकाओं से विकास के माध्यम को निकालें और ३५ मिमी डिश या 6-अच्छी यूनिट के प्रति 2 μg/एमएल क्रियाशील नैनोबॉडी युक्त पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. एक ७.५% सह2 इनकोबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए कोशिकाओं सेते रिपोर्टर-मध्यस्थता nanobody ऊपर की अनुमति देने के लिए ।
    नोट: योजनाबद्ध प्रयोग के आधार पर, नैनोबॉडी के समय को समायोजित करने की आवश्यकता होती है । यहां दिखाए गए प्रयोग के लिए, 1 ज egfp-cdmpr और टीएफआर-ईजीएफपी द्वारा नैनोबॉडी के स्थिर स्थिति तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है ।
  6. मध्यम निकालें और कोशिकाओं को धोने 2-3 बार 1 के साथ 1x pbs के आरटी में एमएल.
  7. 3% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (पीएफए) आरटी में 10 मिनट के लिए ।
  8. पीएफए समाधान निकालें और 1 मिलीलीटर के साथ शेष फिक्सेटिव ५० मिमी एनएच4सीएल में 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए आरटी ।
    नोट: 3% पीएफए को फिक्टिव कचरे के रूप में अलग से निपटाया जाना चाहिए ।
  9. कोशिकाओं को धो कर 3 बार 1 मिलीलीटर 1x पीबीएस के साथ आरटी पर ।
  10. 1 मिलीलीटर ०.१% triton एक्स-१०० में 1x pbs में 10 मिनट के लिए आरटी के साथ कोशिकाओं को पारगम्यबद्ध करता है ।
    नोट: हालांकि कोई permeabilization आवश्यक है, egfp और mcherry प्रतिदीप्ति बेहतर है जब बाद में कोशिकाओं को बढ़ते मध्यम में एम्बेडेड हैं.
  11. कोशिकाओं को धो कर 3 बार 1 मिलीलीटर 1x पीबीएस के साथ आरटी पर ।
  12. एक बूंद (~ १०० μl) में 1% bsa के 1x pbs जिसमें 5 μg/एमएल dapi (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए संदंश के साथ coverslips प्लेस ।
  13. coverslips को पकवान में वापस रखें/अच्छी तरह से और 1 एक्स पीबीएस की १ मिलीलीटर आरटी के साथ 3 बार धो लें ।
  14. कांच स्लाइड लेबल और फ्लोरोमाउंट-जी के साथ कोशिकाओं माउंट । बढ़ते मध्यम 3-4 एच के लिए अंधेरे में कठोर चलो और प्रकाश संरक्षण के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर कांच स्लाइड की दुकान ।
  15. छवि धुंधला पसंद का एक खुर्दबीन का उपयोग पैटर्न (उदाहरण के लिए, बिंदु स्कैनिंग confocal ईमानदार खुर्दबीन) ।

6. (सल्फेशन विश्लेषण के लिए) सुसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा functionalized नैनोबॉडीज के uptake

  1. एक सेल संस्कृति हुड में, बीज ~ ४००,००० करने के लिए ५००,००० HeLa कोशिकाओं stably एक gfp में टैग रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त ३५ मिमी व्यंजन या पर 6-अच्छी तरह से एंटीबायोटिक युक्त पूर्ण माध्यम के साथ समूहों (dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, dmem, 10% भ्रूण बछड़ा के साथ पूरक सीरम (एफसीएस), १०० इकाइयों/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन, और १.५ μg/एमएल प्रोमाइसिन) ।
    नोट: जैसा कि ऊपर बताया गया है, हम यहां हेला कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो दृष्टांत प्रयोजनों के लिए egfp-calnexin, egfp-cdmpr और tfr-egfp व्यक्त करते हैं । स्थिर सेल लाइनों के अलावा, यह भी transiently transfected हेला इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ७.५% सह2 इनकोबेटर में कोशिकाओं को इंसेब्रेट करें ।
    नोट: कोशिकाओं को अगले दिन ~ ८०% की एक कन्फ्लुएंसी होना चाहिए ।
  3. पूरा माध्यम निकालें, 1 एक्स पीबीएस के साथ 2 बार धोने आरटी, और एक ७.५% सह2 इनकोबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक एच के लिए सल्फेट-फ्री मीडियम (एसएफएम) के साथ कोशिकाओं को भूखा करें ।
    नोट: sfm मेम अमीनो एसिड (50x) समाधान की 10 मिलीलीटर जोड़कर तैयार किया जाता है, 5 मिलीलीटर एल-ग्लूटामाइन (२०० मिमी), 5 मिलीलीटर विटामिन समाधान (100x), और ९०० μl के cacl2· 2h2O से ५०० मिलीलीटर ईगल के संतुलित लवण । एक ०.२२ μm फिल्टर और aliquot के माध्यम से गुजरती हैं ।
  4. एक हवादार हुड या रेडियोधर्मिता के काम के लिए नामित बेंच में, sfm में सोडियम नमक के रूप में ०.५ एमसीआई/एमएल [३५एस] सल्फेट के रूप में सल्फेट लेबलिंग माध्यम तैयार करें ।
    सावधानी: रेडियोधर्मिता युक्त सभी समाधानों को सावधानीपूर्वक संभालें । केवल नामित डाकू या बेंच में काम करते हैं । सभी सामग्री (टिप्स, ट्यूब, प्लेटें, आदि) या रेडियोधर्मिता के साथ संपर्क में धोने बफ़र्स एकत्र और अलग से निपटारा किया जाना है. नीचे दिए गए सभी चरणों के लिए यह करें (6.5-6.20 कदम) के रूप में अच्छी तरह से ।
  5. 1x pbs में vhh-2xts को सल्फेट लेबलिंग माध्यम में 2 μg/एमएल की अंतिम सांद्रता में जोड़ें ।
    नोट: नियंत्रण के रूप में, यह भी vhh-एसटीडी या एक और टीएस साइटों के नैनोबॉडी रहित विशिष्ट लेबलिंग का प्रदर्शन शामिल हैं ।
  6. एसएफएम को ०.७ मिलीलीटर सल्फेट लेबलिंग माध्यम से प्रतिस्थापित करें जिसमें ०.५ एमसीआई/एमएल [३५एस] सल्फेट और 2 μg/एमएल वीएचएच-2xts और 1 एच के लिए सेल को ३७ डिग्री सेल्सियस में एक ७.५% सह2 इनकोबेटर में रेडियोधर्मिता के साथ काम के लिए नामित किया गया है ।
    नोट: योजनाबद्ध प्रयोग के आधार पर, नैनोबॉडी सल्फेशन के समय को समायोजित करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, tgn आगमन कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए, लेबलिंग विभिन्न समय के लिए किया जाता है (उदा., 10 मिनट, 20 मिनट, 30 मिनट, आदि के लिए) ।
  7. लेबलिंग माध्यम निकालें और कोशिकाओं को ठंडा प्लेट या बर्फ पर आइस-कोल्ड 1x पीबीएस के साथ 2-3 बार धोएं ।
  8. 2 मिमी pmsf और 1x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल मंच पर 10-15 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते-lysis बफर (1% ट्राइटन एक्स-१०० और ०.५% डिऑक्सीचोलेट युक्त pbs) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. परिमार्जन और lysate हस्तांतरण में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब, भंवर lysate, और जगह के लिए 10-15 मिनट पर एक अंत से अधिक अंत में रोटेटर पर 4 ° c ।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर अपकेंद्रीकरण द्वारा एक पोस्टन्यूक्लियर lysate तैयार करें ।
  11. एक नई १.५ मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में निकेल मोतियों के घोल के 20-30 μl तैयार करें और 1 x पीबीएस के साथ एक बार धो कर धीरे से उन्हें १,००० एक्स जी पर १ मिनट के लिए पेल्टिंग करें ।
    नोट: इसके बजाय निकल मोती की, streptavidin मोती (यदि nanobody है biotinylated) या प्रोटीन नैनोबॉडी (T7-या हा टैग) के एक epitope के खिलाफ एक आईजीजी के साथ एक मोती इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  12. एक १.५ मिलीलीटर निकल मोती युक्त ट्यूब में postnuclear lysate स्थानांतरण और एक छोर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए सेते एक अंत से अधिक अंत पर रोटेटर नैनोबॉडी को अलग करने के लिए । एक aliquot (50-100 μl) पोस्टन्यूक्लियर lysate के निकालें और बाद में कुल सेल से जुड़े nanobody, gfp रिपोर्टर और लोडिंग नियंत्रण के बाद immunoblot विश्लेषण के लिए एसडीएस नमूना बफर में उबाल ।
  13. 1 x pbs या lysis बफर के साथ मोती 3 बार धो धीरे से १,००० एक्स जी के लिए एक मिनट के लिए pelleting ।
    नोट: मोतियों के अधिक कड़े धोने के लिए, 20 मिमी इमिडाज़ोल को पीबीएस या लाइसिस बफर में शामिल किया जा सकता है ।
  14. ध्यान से सभी धोने बफर मोती से हटाने, 2x नमूना बफर के ५० μl जोड़ने के लिए, और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फोड़ा ।
  15. लोड दोनों एक midi १२.५% sds पर मोती उबला हुआ-पृष्ठ जेल और मानक पृष्ठ प्रोटोकॉल के अनुसार चलाने के संदर्भ डाई तक (जैसे, ब्रोमोफीनॉल नीला) अलग जेल के अंत तक पहुंच गया है ।
    नोट: कुल सेल से जुड़े nanobody के immunoblot विश्लेषण, gfp रिपोर्टर और लोडिंग नियंत्रण भी एक मिनी १२.५% sds-पृष्ठ या प्रीकास्टिंग ढाल जेल का उपयोग किया जा सकता है ।
  16. निर्धारण बफर के ~ 30 मिलीलीटर में अलग जेल फिक्स (10% एसिटिक एसिड और ddh2हे में ४५% मेथनॉल) आरटी में 1 ज के लिए, जेल से तीन बार धोने ~ ५० मिलीलीटर के साथ विआयनीकृत पानी और जेल सुखाने के लिए तैयार ।
  17. सुखाने एसडीएस-पेज जैल ।
    1. ध्यान से फैला हुआ चिपटना फिल्म पर स्थिर जेल जगह और यह precut फ़िल्टर कागज के साथ कवर ।
    2. फिल्टर कागज सुखाने मंच के शीर्ष पर नीचे के साथ जेल प्लेस, वैक्यूम कवर जगह है, और जेल सुखाने के लिए वैक्यूम पंप पर स्विच । 3-5 एच के लिए जेल सूखी ।
    3. चिपटना फिल्म निकालें और एक स्वरूपक स्क्रीन के साथ सुसज्जित एक ऑटोएडिग्राफी कैसेट में सूखे जेल जगह है ।
  18. एक भास्वर स्क्रीन imager का उपयोग कर छवि ऑटोडियोग्राफ । निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    नोट: सिग्नल की ताकत के आधार पर, सूखे जैल को फॉस्फ़र स्क्रीन के साथ लंबे समय तक उजागर करने की आवश्यकता होती है ।

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Representative Results

करने के लिए प्रतिगामी प्रोटीन परिवहन की जांच करने के लिए विभिंन इंट्रासेलुलर स्थलों, हम हाल ही में एक विरोधी gfp nanobody आधारित उपकरण की स्थापना की है और लेबल के लिए सेल की सतह30से पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन का पालन करें । यहाँ, हम इस तरह के derivatized नैनोबॉडीज के जीवाणु उत्पादन का प्रदर्शन करते हैं और अपने आवेदन को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोलोटिंग द्वारा endocytic का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन करते हैं, साथ ही उनके उपयोग के लिए स्लैफेशन विश्लेषण द्वारा tgn आगमन की जांच । उत्तरार्द्ध आवेदन इस प्रोटोकॉल का methodological ध्यान केंद्रित है ।

हम मानक आणविक क्लोनिंग30द्वारा आम सुविधाओं के साथ अलग क्रियाशील विरोधी gfp nanobodies के एक toolbox उत्पन्न किया है । हमारे सरलतम (मानक) nanobody, vhh-एसटीडी, vhh डोमेन, एक T7 और विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा बाद में पता लगाने के लिए एक हा epitope शामिल हैं, एक carboxyterminal हेक्साइसटिडीन (His6)-शुद्धि के लिए टैग, और एक बायोटिन ग्राही पेप्टाइड (bap) अनुक्रम के लिए बायोटिनिलेशन और उच्च-बंधुता स्ट्रेप्टाविइन पुल-डाउन प्रयोग (चित्र 1a) । वीएचएच के derivatization-एसटीडी पैदावार अलग nanobody वेरिएंट endocytic की जांच करने के लिए और प्रतिगामी परिवहन biochemically, फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा ।

प्लाज्मा झिल्ली से ट्रांस गोल्गी/tgn के लिए प्रोटीन यातायात का आकलन करने के लिए, हम इन डिब्बों में tyrosylprotein सल्फोट्रांसटोरिज़ के विशेष स्थानीयकरण का लाभ लिया और इस प्रकार संशोधित vhh-एक मिलकर tyrosine सल्फेशन साइट के साथ एसटीडी (2xts) व्युत्पंन से चूहा procholecystokinin४१. जबकि vhh के संशोधन-mcherry के साथ एसटीडी फिक्स्ड और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा प्रतिगामी परिवहन के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है, एक peroxidase के साथ functionalization, ऐसे APEX2३७के रूप में, सक्षम बनाता है इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन, cytochemical डिब्बा अपक्षरण, या निकटता-निर्भर बायोटिनीलेशन प्रतिक्रियाओं । इसके अलावा, तंबाकू खोदना वायरस (tev) प्रोटीज़ के लिए एक दरार साइट की प्रविष्टि biochemically इंट्रासेलुलर और सतह से बंधे नैनोबॉडीज (चित्रा 1a) के बीच अंतर करने के लिए अनुमति देता है । हम पहले से इस्तेमाल किया है vhh-tev नैनोबॉडी-बाध्य egfp-cdmpr और tfr-egfp30के endocytic रीसाइक्लिंग कैनेटीक्स पर नजर रखने के लिए । के बाद सेल सतह पर नैनोबॉडी reappearance बस extracellularly के साथ पीछा करके मूल्यांकन किया जा सकता है रिकॉमबिनेंट टेव प्रोटीज नैनोबॉडी के carboxyterminal epitope कैसेट के एक व्युत्क्रम नुकसान पैदा कर रहा है । mcherry या APEX2 nanobody फ्यूजन में एक दरार साइट सहित वीएचएच-tev करने के लिए एक समान तरीके से लाइव सेल इमेजिंग द्वारा egfp पत्रकारों के रीसाइक्लिंग कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, या कोशिकीय डिब्बों के लिए cytochemical प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए, क्रमशः. अन्य प्रोटीन डोमेन (जैसे, अन्य फ्लोरोफोरेस या एंजाइमों) या अन्य posttranslational संशोधनों के लिए लक्ष्य दृश्यों के साथ functionalization आसानी से प्लाज्मिड वेक्टर एन्कोडिंग vhh-एसटीडी में एक संबंधित डालने subcloning द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (यह भी देखें प्लाज्मिड जानकारी के लिए तालिका 1) उपलब्ध spei और ecori प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर ।

ऊपर वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का उपयोग करना, सभी nanobodies यहां सचित्र उच्च शुद्धता और उपज (चित्रा 1b) के लिए अलग किया जा सकता है । केवल mcherry फ्लेशन प्रोटीन डोमेन के मामूली कतरन दिखाया पोस्ट शुद्धि (चित्र 1b, देखें गलियों 7-8) । बिरा अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति में, हम आम तौर पर vhh-std, vhh-2xts और उनके tev-संशोधित समकक्षों के लिए 25-35 मिलीग्राम प्राप्त, या ~ 20 vhh-APEX2 और vhh-mcherry और उनके tev-युक्त डेरिवेटिव के लिए मिलीग्राम. हमारे अनुभव से पता चलता है कि बिरा coexpression एक तिहाई से एक आधे से नैनोबॉडी उपज कम करती है ।

रिपोर्टर-मध्यस्थता नैनोबॉडी का वर्णन करने के लिए, हम हेला सेल लाइनों stably egfp-calnexin (सीएनएक्स), egfp-cdmpr, और टीएफआर-egfp (चित्रा 2a और बी) व्यक्त का इस्तेमाल किया है । egfp प्रत्येक प्रोटीन (यानी, संकेत और सीएनएक्स या cdmpr के रिपोर्टर अनुक्रम) के बीच, और टीएफआर के carboxyterminus के लिए, cytosolic छँटाई संकेतों unobstructed छोड़ने के extracellular/ इन सभी egfp-कार्गो अणुओं के सभी ईआर लक्ष्यीकरण के बाद विभिंन intracellular तस्करी itineraries है । चूंकि egfp-calnexin ईआर में निवासी है और आम तौर पर बाद गोलगी डिब्बों तक नहीं पहुंचता है, यह संभावित और अविशिष्ट नैनोबॉडी के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । इसके विपरीत, दोनों egfp-cdmpr और tfr-egfp गोलगी से परे परिवहन कार्य किया है और इस तरह तेजी से प्लाज्मा झिल्ली पर दिखाई देते हैं. उम्मीद के रूप में, जब vhh-mcherry असंशोधित HeLa और कोशिकाओं stably egfp-सीएनएक्स व्यक्त की एक मिश्रित आबादी के लिए जोड़ा गया था, कोई nanobody इंटर्नशिप या तो मामले में मनाया जा सकता है । हालांकि, दोनों egfp-cdmpr और tfr-egfp सेल की सतह पर vhh-mcherry पर कब्जा कर लिया और उंहें रिपोर्टर के अभिलक्ष्यन डिब्बों (चित्रा 2c) को piggyback पहुंचाया ।

vhh-mcherry एक निवासी tgn मार्कर के साथ colocalization सिद्धांत रूप में इस्तेमाल के लिए tgn आगमन का आकलन किया जा सकता है । फिर भी, हम tyrosine सल्फेशन पर आधारित एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण की स्थापना की. ट्रांस गोलगी/टीजीएन में होने वाले इस संशोधन का लाभ लेने के लिए, नैनोबॉडीज को टीएस साइट्स (चित्रा 1a) के साथ कार्यरूप दिया गया । इन प्रोटीन बाँधने की विशिष्टता और कार्यक्षमता प्रदर्शित करने के लिए, हम असंशोधित HeLa कोशिकाओं और कोशिकाओं stably व्यक्त egfp-सीएनएक्स, egfp-cdmpr और टीएफआर-egfp vhh-एसटीडी या वीएचएच-2xts के साथ 1 एच के लिए रेडियोधर्मी सल्फेट की उपस्थिति में. vhh-2xts के रेडियोलाब्लिंग केवल तब होता है जब एक रिपोर्टर tgn के लिए नैनोबॉडी retrogradely जहां यह tyrosine सल्फेशन मशीनरी के संपर्क में है परिवहन. HeLa व्यक्त egfp-सीएनएक्स और उनके पैतृक कोशिकाओं को कोई nanobody और इस तरह कोई sulfation का प्रदर्शन । दोनों egfp-cdmpr और टीएफआर-egfp, पूर्व की तुलना में काफी बाद nanobodies भली भांति । फिर भी, केवल egfp-cdmpr कारण vhh-2xts सल्फेटकृत किया जा करने के लिए (चित्रा 3a). यह tgn के लिए सेल की सतह से cdmpr के कुशल प्रतिगामी परिवहन की पुष्टि करता है और टीजीएन के लिए रिटर्निंग टीजीआई के खिलाफ सबूत (के रूप में कुछ अध्ययनों में सुझाव दिया गया है४२,४३) ।

internalization और रिपोर्टर प्रोटीन के tgn आगमन की कैनेटीक्स भी nanobody और सल्फेशन के विभिंन समय के बाद सेल lysates विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । रिपोर्टर के रूप में egfp-cdmpr का उपयोग करना, हमने पाया sulfation ~ 15 मिनट की एक अंतराल अवधि के बाद ही शुरू करने के लिए और केवल > 75 मिनट के बाद संतृप्ति तक पहुँचने के लिए (चित्रा 3b, गलियों 1-6, और सी, वर्ग प्रतीकों). उत्थान और सल्फेशन गतिकी लगभग 30 मिनट, tgn के लिए परिवहन को दर्शाती द्वारा स्थानांतरित कर दिया दिखाई दिया । इसके अलावा, इस विधि को औषधीय हस्तक्षेप या प्रोटीन सिलना दृष्टिकोण जैसे knockdown, पीटकर, या knocksideways द्वारा mpr परिवहन में शामिल छंटाई मशीनरी की जांच करने की अनुमति देता है । यहां, हम ब्रेफेल्डिन एक (bfa), ग्वानिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों में से एक अवरोधक का इस्तेमाल किया (gefs) कई arf gtpases के, आमतौर पर tgn के लिए प्रतिगामी परिवहन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए. जब bfa के साथ इलाज किया, sulfation पूरी तरह से समाप्त कर दिया गया था, जबकि ऊपर गतिज में और सीमा में दोनों अप्रभावित रहे (चित्रा 3b, गलियों 7-12, और सी, दौर प्रतीकों) ।

Figure 1
चित्रा 1: डिजाइन और उत्पादन के लिए क्रियाशील नैनोबॉडीज egfp-संशोधित सेल सतह प्रोटीन ट्रैक करने के लिए । (क) derivatized नैनोबॉडीज के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । मानक nanobody gfp-विशिष्ट vhh डोमेन के होते हैं, T7 और हा epitope टैग, एक bap, और एक hexahistidine (His6) शुद्धि टैग । इसके अलावा में अंय nanobodies दो tss, APEX2, या mcherry, एक साथ या tev प्रोटीज़ (tev) के लिए एक दरार साइट के बिना शामिल हैं । स्केल बार एमिनो एसिड में है (aa) । (ख) बैक्टीरियोली व्यक्त और शुद्ध नैनोबॉडीज (५० μg) ग्रेडिएंट एसडीएस-जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा विश्लेषण किया गया और coomassie के साथ दाग । केडीए में आणविक द्रव्यमान के साथ मार्कर प्रोटीन बाईं तरफ दिखाए जाते हैं । केवल vhh-mcherry और vhh-tev-mcherry vhh और mcherry डोमेन के बीच ंयूनतम कतरन दिखाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: uptake और विभिन्न egfp रिपोर्टर प्रोटीन द्वारा vhh-mcherry के इंट्राकोशिलर स्थानीयकरण । (क) egfp फ्यूजन प्रोटीन का योजनाबद्ध निरूपण. स्रावी झिल्ली प्रोटीन से प्राप्त अनुक्रम काले में एन टर्मिनल संकेत पेप्टाइड्स और पीले रंग में आंतरिक ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों के साथ दिखाया जाता है, और egfp हरे रंग में सचित्र है. egfp पूर्ण लंबाई cdmpr, टीएफआर, और calnexin (सीएनएक्स) के लिए जुड़े हुए किया गया था । एमिनो एसिड (एए) में स्केल बार । egfp-cdmpr और tfr-egfp30बताया गया है. (ख) HeLa कोशिकाओं stably egfp रिपोर्टर प्रोटीन काटा, lysed थे, और एसडीएस-जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा विश्लेषण और विरोधी gfp और विरोधी actin एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting । केडीए में आण्विक द्रव्यमान दाईं ओर दर्शाया गया है । (ग) हेला कोशिकाओं stably व्यक्त egfp-टैग रिपोर्टर प्रोटीन माता-पिता HeLa कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था, के साथ incubated 5 μg/एमएल vhh-mcherry (~ १०० एनएम) के लिए 1 ज ३७ पर डिग्री सेल्सियस और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित. स्केल बार = 10 μm । uptake केवल कक्ष सतह पर उजागर egfp के साथ एक रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं द्वारा होता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सल्फेशन विश्लेषण और tgn के लिए प्रतिगामी परिवहन के कैनेटीक्स टीएस-टैग nanobodies का उपयोग कर । (क) माता-पिता और HeLa कोशिकाओं stably व्यक्त egfp संशोधित रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग कर लेबल थे ०.५ एमसीआई/एमएल [३५एस] सल्फेट के लिए ६० मिनट के साथ 2 μg/एमएल vhh-एसटीडी या vhh-2xts. nanobodies निकल मोती का उपयोग कर अलग थे, एक १२.५% sds पर अलग-पृष्ठ के बाद स्वत सेल lysates के aliquots निकल पुल से पहले एकत्र किए गए और सेल के लिए इम्युनोब्लॉट जुड़े nanobody (His6), egfp, और actin । (ख और ग) हेला कक्ष stably एक्सप्रेस egfp-cdmpr ०.५ एमसीआई/एमएल [३५एस] सल्फेट के साथ 2 μg/एमएल वीएचएच-2xts की उपस्थिति में के साथ और बिना 2 μg/एमएल bfa के साथ लेबल थे विश्लेषण के रूप में (एक) । वीएचएच-2xts का परिमाणन और तीन स्वतंत्र प्रयोगों से sulfation ७५ मिनट के बाद bfa बिना मूल्य के प्रतिशत में दिखाया गया है (मतलब है और एसडी). काले चौकों, बिना bfa; ग्रे हलकों, bfa के साथ; खुला प्रतीकों, ऊपर उठाना; भरा प्रतीकों, सल्फेशन । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और buser एट अल से विस्तारित, २०१८, pnas30। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

तालिका 1: इस अध्ययन में दिखाए गए प्रकार्यीकृत नैनोबॉडीज का प्रोटीन अनुक्रम । T7 epitope में ग्रे, vhh में काले, हा epitope में नीले रंग में, bap अनुक्रम में नारंगी, हेक्साइसटिडीन (His6) में लाल, टेव प्रोटीज़ क्लीवेज साइट में बैंगनी, myc epitope में magenta, tyrosine में सल्फेशन अनुक्रम पीले, APEX2 में हरे, और गुलाबी में mcherry. अभिव्यक्ति वैक्टर एंकोडिंग इन क्रियाशील विरोधी gfp nanobodies (भी प्लाज्मिड जानकारी के लिए तालिका 1 देखें) जमा किया गया है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

nanobodies पारंपरिक एंटीबॉडी पर कई फायदे के साथ प्रोटीन बांधने की मशीन मचाने के एक उभरते वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं: वे छोटे हैं, स्थिर, monomeric, उच्च संबध और कमी के लिए चुना जा सकता है डाइसलफाईड बांड३३,३५, ४४ , ४५. वे अनुप्रयोगों की एक संख्या में उपयोग किया जाता है, जैसे सेल संस्कृति प्रणालियों और जीवों में विकासात्मक जीवविज्ञान में४६,४७,४८,४९, क्रिस्टलीकरण chaperones के रूप में संरचनात्मक जीव विज्ञान में५०,५१,५२,५३, inhibitors या एंजाइमों की गतिविधि नियन्त्रक के रूप में स्थिर conformational राज्यों५४,५५, ५६, के रूप में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिकर्मकों के लिए जैव रासायनिक विश्लेषण५७, या के रूप में "माध्यमिक नैनोबॉडी" एंटी-माउस और एंटी-रैबिट इम्यूनोग्लोबुलिन पर immunoblots का पता लगाने के लिए और immunohistochemical५८. हमारे पिछले अध्ययन में, हम विकसित और लागू किया है क्रियाशील बैक्टीरियल अभिव्यक्ति द्वारा उत्पादित nanobodies सतह लेबल प्रोटीन के लिए और विभिंन डिब्बों को उनके intracellular मार्ग ट्रैक, विशेष रूप से tgn30के लिए । हम उपकरण बहुमुखी बनाने के लिए एक विरोधी gfp nanobody का इस्तेमाल किया, extracellular gfp के साथ फ्यूजन प्रोटीन को लक्षित करने में सक्षम, yfp, या mcerulean कि पहले से ही उपलब्ध हो सकता है और विशेषता. mcherry, APEX2, या टीएस साइटों के साथ विरोधी gfp nanobodies के संशोधन हमें रिपोर्टर को स्थिर और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा ऊपर की निगरानी करने की अनुमति दी, ultraसंरचनात्मक प्रतिगामी परिवहन डिब्बों की कल्पना करने के लिए, इन डिब्बों ablate करने के लिए, या परिवहन का अध्ययन करने के लिए tgn के लिए कैनेटीक्स । हमारे उपकरण का एक दोष यह है कि लक्ष्य सेल लाइनों के पुनः संयोजक संशोधन (स्थिर अभिव्यक्ति या अंतर्जात टैगिंग) क्रियाशील विरोधी gfp nanobodies लागू किया जा सकता से पहले की आवश्यकता है । प्रकार्यीकरण पाठ्यक्रम का भी तेजी से बढ़ती संख्या के लिए लागू किया जा सकता है untagged अंतर्जात लक्ष्य पशु प्रतिरक्षण द्वारा स्थापित प्रोटीन या ribosome-प्रदर्शन और phage-प्रदर्शन सिंथेटिक vhh के चयन के खिलाफ निर्देशित लायब्रेरीज़५९। TS साइट्स (उदा., vhh-2xts) के साथ संशोधित नैनोबॉडीज का उपयोग करके, हम विविध egfp-संशोधित लक्ष्य प्रोटीन के tgn आगमन के परिवहन और गतिकी को सीधे माप सकते हैं । हमने एडैप्टर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 1 (एपी-1) के योगदान का अध्ययन करने के लिए वीएचएच-2xts को लागू किया है, जो दी गई परिवहन मशीनरी30की तेजी से निष्क्रियता की अनुमति देते हुए knocksideways कोशिकाओं में प्रत्यक्ष काइनेटिक विश्लेषण द्वारा mprs के प्रतिगामी परिवहन में । नैनोबॉडी सल्फेशन और इसलिए egfp-लेबल mprs के प्रतिगामी परिवहन आंशिक रूप से था, लेकिन पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं. tgn आगमन संवेदक के रूप में सल्फेशन का उपयोग कर हमारे nanobody आधारित दृष्टिकोण अन्य प्रयोगशालाओं से पिछले परिणाम की पुष्टि की प्रतिगामी endosome-टू-tgn परिवहन में एपी-1 के एक कार्यात्मक योगदान का संकेत17,६०, ६१. इस प्रकार, जीनोमिक, आनुवंशिक या रासायनिक जोड़तोड़ द्वारा कार्गो प्रोटीन पर, epsinr, Rab9/TIP47 या snx-BAR/retromer परिसरों के रूप में अन्य प्रतिगामी परिवहन मशीनरी के योगदान को काटना करने के लिए एक उपयोगी जैव रासायनिक उपकरण प्रदान कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक आधार प्रदान करता है कि कैसे एक सामान्य रूप में क्रियाशील नैनोबॉडीज का उपयोग करने के लिए लक्ष्य डिब्बों, रास्ते, और परिवहन कैनेटीक्स सुसंस्कृत कोशिकाओं में निर्धारित कर सकते हैं ।

अंय समूहों पहले से ही TS साइटों का उपयोग करने के लिए tgn सेल सतह से परिवहन का पालन किया है । ricin, शिगा या पर्टुसिस विष उपइकाइयों पहले sulfation साइटों के साथ संशोधित किया गया है tgn६२,६३,६४,६५,६६के माध्यम से एक परिवहन मार्ग का प्रदर्शन । इसके अलावा, टीएस पेप्टाइड्स भी रासायनिक gfp-cimpr और अंतर्जात TGN46 tgn६७,६८के लिए प्रतिगामी परिवहन परख iggs को युग्मित किया गया था । हमारे सल्फटेबल नैनोबॉडीज का लाभ सरल और पुनरुद्देशिनीय जीवाणु उत्पादन और लक्ष्य प्रोटीन के साथ 1:1 स्टॉइकियोमेट्री का है । इसके विपरीत, यह उदाहरण के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है कि द्विसंयोजक प्रोटीन binders, ऐसे iggs के रूप में, सेल की सतह प्रोटीन crosslink और endocytosis६९,७०के बाद lysosomes के लिए उनके इंट्रासेलुलर तस्करी में परिवर्तन कर सकते हैं, पर प्रकाश डाला मौजूदा तरीकों के संबंध में मोनोमेरिक प्रोटीन बाँधने का महत्व । हमारी तकनीक का एक महत्वपूर्ण कदम है कि रेडियोधर्मिता के साथ हैंडलिंग के लिए नैनोबॉडीज के सल्फेट लेबलिंग करने की आवश्यकता है । हालांकि, tgn आगमन का अध्ययन करने के लिए टीएस साइटों के साथ क्रियाशील नैनोबॉडीज के हमारे उपकरण संभवतः रेडियोधर्मिता विरोधी sulfotyrosine एंटीबॉडी का उपयोग कर के बिना लागू किया जा सकता है ।

हमारे पिछले अध्ययन से पता चलता है कि nanobody सल्फेशन बहुत कुशल नहीं हैं, mprs के sulfation के बाद से अभी तक एक अधिकतम तक पहुंच नहीं था ७५ मिनट, भले ही nanobody ऊपर ४५ मिनट30के बाद संतृप्त किया गया था । अन्य प्राकृतिक टीएस साइटों के लिए स्क्रीनिंग सल्फेशन दक्षता में सुधार हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, संभावित रूप से सल्फेशन दक्षता बढ़ाने के लिए, सल्फेशन मशीनरी के घटकों, जैसे कि TPST1 और TPST2, को अधिक अभिव्यक्त किया जा सकता है । दरअसल, यह पहले से दिखाया गया है कि ट्रांसपोर्टरों में से एक के overexpression 3 देने '-phoshoadenosine-5'-फ़ॉस्फोसल्फेट (paps), tpsts के लिए सब्सट्रेट, cytosol से गोलगी के लुमेन के लिए proteoglycans की sulfation स्थिति बदल सकता है ७१.

सल्फटेबल नैनोबॉडीज के अलावा, अन्य derivatizations भी endocytic डिब्बों और tgn के माध्यम से यातायात अनुरेखण अनुमति देते हैं । APEX2 प्रतिगामी परिवहन के प्रोटीमिक विश्लेषण के लिए निकटता-निर्भर बायोटिनीलेशन के लिए एक promiscuous लेबलिंग एंजाइम के रूप में लागू किया जा सकता है । APEX2 nanobody कि ब्याज की एक कार्गो रिपोर्टर द्वारा भली भांति है लक्ष्य डिब्बों के भीतर करीब निकटता में प्रोटीन लेबल होगा । तुलनात्मक प्रोटियोमिक्स अंतर्जात और tgn के विभिन्न प्रकार में अन्य अंतर्जात प्रोटीन की पहचान करने के लिए अनुमति देनी चाहिए कि नैनोबॉडी accesses. अपने लक्ष्य प्रोटीन के साथ संयोजन में nanobodies के कई रूपों बोधगम्य हैं । एक ताजा रिपोर्ट, उदाहरण के लिए, एक के लिए एक उल्टे दृष्टिकोण लागू यहां वर्णित: derivatized gfp अध्ययन और जाल के लिए इस्तेमाल किया गया था विरोधी gfp nanobody-टैग धानी एंट्रोग्रेड में छंटाई रिसेप्टर्स और संयंत्र के प्रतिगामी डिब्बों चिह्नित endomembrane प्रणाली७२. इसी तरह, क्रियाशील नैनोबॉडी जाल स्तनधारी कोशिका संस्कृति प्रणालियों में डिजाइन करने के लिए कब्जा और प्रतिगामी परिवहन के दौरान अलग डिब्बों में egfp संशोधित संवाददाताओं जमा हो सकता है ।

हमारे यहां प्रस्तुत विधि और टीएस साइट पर ध्यान केंद्रित के साथ प्रोटोकॉल टैग nanobodies मात्रात्मक और गुणात्मक सेल सतह से endocytic डिब्बों और tgn के लिए कार्गो प्रोटीन की ट्रैकिंग की अनुमति देता है सभ्य स्तनधारी कोशिकाओं में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम ग्रांट 31003a-१६२६४३ द्वारा स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा समर्थित था । हम समर्थन के लिए निकोल beuret और biozentrum इमेजिंग कोर सुविधा (imcf) धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४४ नैनोबॉडीज प्रतिगामी परिवहन गोल्गी कॉम्प्लेक्स टायरोसिन सल्फेशन बैक्टीरियल एक्सप्रेशन रेडियोलाब्लिंग egfp HeLa कोशिकाओं
संपोषित कोशिकाओं में प्रकार्यीकृत नैनोबॉडीज का उपयोग करते हुए ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क में एन्डोसिटिक के उत्थान और प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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