Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse af Endocytic optagelse og retrograd Transport til Trans-Golgi netværket ved hjælp af Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Retrograd transport af proteiner fra cellens overflade til Golgi er afgørende at fastholde membran homøostase. Her, beskriver vi en metode til at analysere biokemisk celle overflade til Golgi transport af rekombinante proteiner ved hjælp af functionalized nanobodies i HeLa celler.

Abstract

Transport af proteiner og membraner fra cellens overflade til Golgi og videre er afgørende for homeostase, organelle identitet og fysiologi. For at studere retrograd protein trafik, har vi for nylig udviklet en alsidig nanobody-baserede toolkit for at analysere transporten fra cellens overflade til Golgi kompleks, enten ved faste og levende celle imaging, ved elektronmikroskopi eller biokemisk. Vi konstruerede functionalized anti-grøn fluorescerende proteiner (NGL) nanobodies — små, monomere, høj-affinitet protein bindemidler — der kan anvendes til cellelinjer udtrykker Membranproteiner af interesse med en ekstracellulære NGL-gruppe. Derivatized nanobodies bundet til normal god landbrugspraksis journalister er specifikt internaliseret og transporteres piggyback langs journalister sortering ruter. Nanobodies blev functionalized med fluorophores til følge retrograd transport af Fluorescens mikroskopi og live imaging med Ascorbat peroxidase 2 (APEX2) til at undersøge de ultrastrukturelle lokalisering af reporter-nanobody komplekser af elektron mikroskopi, og med tyrosin sulfation (TS) motiver til at vurdere kinetik af trans-Golgi netværk (TGN) ankomst. I denne metodologiske artikel skitsere vi den generelle procedure for at bacterially express og rense functionalized nanobodies. Vi illustrere den kraftfulde brug af vores værktøj ved hjælp af den mCherry - og TS-modificerede nanobodies til at analysere endocytic optagelse og TGN ankomst af last proteiner.

Introduction

Retrograd trafik af proteiner og lipider fra cellens overflade til forskellige intracellulære rum er afgørende for opretholdelse af membran homøostase modvægt sekretion og at genbruge komponenter af anterograd transport machineries1 , 2. efter internalisering via clathrin-afhængige eller -uafhængig endocytose, proteiner og lipid cargo først udfylde tidligt endosomes fra hvor de er yderligere omdirigeret enten langs den endo-lysosomale system, genanvendt til plasma membran, eller målrettet til trans-Golgi netværk (TGN). Genbrug fra endosomes og/eller cellens overflade til TGN er en del af den funktionelle cyklus af en række anterograd transmembrane cargo receptorer, såsom kation-afhængige og kation-uafhængige mannose-6-fosfat-receptorer (CDMPR og CIMPR) leverer nyligt syntetiserede lysosomale hydrolaser fra TGN til afdøde endosomes og lysosomer3,4,5, sortilin og SorLA6,7, og Wntless (WLS) transport af Wnt ligander til cellens overflade 8 , 9 , 10 , 11. andre proteiner hentet tilbage til TGN er TGN46 og dens relaterede isoformer12,13,14, snarer (opløselige N- ethylmaleimide-følsomme fusion faktor vedhæftet fil receptorer) 15 , 16 , 17, amyloid forløber protein (APP)18,19, progressive ankylose (ANK) protein20, metal transportvirksomheder som ATP7A/B eller DMT121,22, og transmembrane forarbejdning enzymer herunder carboxypeptidase D, furin eller BACE123,24,25. Bortset fra disse endogene proteiner kapre bakteriel og plante toksiner (fx Shiga og kolera toksin, ricin og abrin) retrograd transport machineries til at nå på Skadestuen for retrotranslocation i cytosol26,27, 28,29.

For at direkte analysere retrograd trafik, har vi tidligere har udviklet en nanobody-baseret toolkit for at mærke og følge lasten proteiner fra cellens overflade til intracellulære rum30. Nanobodies repræsenterer en ny familie af protein bindemidler afledt af homodimeriske heavy chain kun antistoffer (hcAbs) der forekommer naturligt i camelids og arter fisk31,32. De udgør de variable heavy-kæde domæne (VHH) af hcAbs og har mange fordele i forhold til konventionelle antistoffer (f.eks. IgGs): de er monomere, lille (~ 15 kDa), højt opløseligt, blottet for disulfid obligationer, kan bacterially udtrykkes og valgt høj-affinitet bindende33,34,35,36. For at gøre vores nanobody værktøj, alsidigt og bredt anvendelige, ansat vi functionalized anti-NGL nanobodies til overflade-label og spor proteiner markeret med normal god landbrugspraksis på deres ekstracellulære/lumenal domæne. Ved functionalization af nanobodies med mCherry, Ascorbat peroxidase 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfation (TS) sekvenser, retrograd transport af bonafide transmembrane cargo proteiner kan analyseres af enten fast og live celle imaging, af elektronmikroskopi, eller biokemisk. Da tyrosin sulfation medieret af tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 og TPST2) er en posttranslationelle modifikation begrænset til trans-Golgi/TGN, vi kan direkte undersøgelse transport og kinetik af proteiner af interesse fra cellens overflade til dette intracellulære Golgi rummet38,39,40.

I artikelen metoder beskrive vi lethed, hvormed produktionen af functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry og derivater) egner sig til en række applikationer til at analysere retrograd transport i pattedyrceller30. Vi fokusere hovedsagelig på brugen af TS websted-modificerede nanobody til analyse af intracellulære trafik fra cellens overflade til rum i sulfation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bakteriers Transformation med Functionalized Nanobodies

Bemærk: Denne protokol er blevet optimeret til udtryk, oprensning og analyse af functionalized anti-NGL nanobodies som tidligere beskrevet30. Forædling med andre protein fraspaltning kan kræve ændring af denne standard protokol.

  1. Optø chemocompetent bakterier (~ 100 µL) egnet til protein udtryk (fx, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) ved at placere dem på is.
    Bemærk: Forberede chemocompetent bakterieceller ifølge standard lab procedurer. Alternativt, kemisk kompetente bakterieceller kan købes kommercielt.
  2. Tilføje 50 ng af et plasmid kodning functionalized nanobodies. For at give tilstrækkelig lokationsspecifikke biotinylation af nanobody reporter under bakteriel udtryk, også tilføje en tredobbelt overskydende (150 ng) af en bakteriel udtryk plasmid kodning biotin ligase BirA (Se også tabel 1 plasmid oplysninger). Forsigtigt afpipetteres op og ned.
    Bemærk: Hvis nanobody biotinylation er ikke nødvendigt eller nanobody reportere er blottet for et biotin acceptor peptid (BAP), er co transformation med et plasmid kodning BirA ikke påkrævet.
  3. Inkuber bakterieceller i 30 min på is.
  4. Heat shock de bakterieceller ved at placere dem i 1 minut på 42 ° C i et vandbad eller en opvarmning blok.
  5. Der tilsættes 1 mL af stuetemperatur (RT) Luria bouillon (LB) medium og Inkuber de transformerede bakterier i en thermoshaker i 1 timer ved 37 ° C at tillade fænotypiske udtryk af resistensgener. For at forberede 1 L LB medium, balance 5 g gær extract, 10 g trypton og 10 g NaCl, fylde op med vand og steriliseres ved autoklavering. Hvis den functionalized nanobody har været subcloned i et udtryk vektor indeholdende resistens over for ampicillin/carbenicillin, kan trin 1.5 udelades.
  6. Pellet bakterier på 11.000 x g i 1 min og resuspend i 100 µL af frisk LB medium.
  7. Plade de suspenderede bakterier på LB plader der indeholder de respektive antibiotika (fx med 50 µg/mL kanamycin og 50 µg/mL carbenicillin Når bakterierne har været co transformeret med nanobody reporter og BirA som anført ovenfor (trin 1.2)).
  8. LB-plader i en inkubator ved 37 ° C og lad vokse natten over (O/N).
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her ved at gemme LB-plade med dyrkede kolonier ved 4 ° C. Bruge parafilm for at forsegle LB plader.

2. flydende bakteriekulturen og induktion af Functionalized Nanobody udtryk

  1. Vælg en bakteriel koloni indeholdende vektor af interesse fra pladen og lad det vokse i en kolbe indeholdende 20 mL af LB medium suppleret med antibiotika O/N i en rystende inkubator ved 37 ° C (Se også trin 1.7 med hensyn til valg af antibiotika).
  2. Næste dag, fortyndes bakteriekulturen dyrket 20 mL i en målekolbe indeholdende 1 L af LB medium med valg af antibiotika.
  3. Fortsat at udruge bakteriekulturen ved 37 ° C, indtil den når en OD600 på 0,6-0,7. Tillad kultur at køle ned til RT før inducerende protein udtryk.
  4. Fremkalde protein udtryk for functionalized nanobodies og BirA ved tilsætning af 1 mL af 1 M isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) til en endelig koncentration på 1 mM af inducer (1:1, 000 fortynding). Også tilsættes 10 mL af en 20 mM d-biotin stamopløsning resulterer i 200 µM d-biotin i vækstmediet at tillade biotinylation af BAP epitop findes i functionalized nanobodies (Se også tabel 1 plasmid oplysninger)
    Bemærk: D-biotin stamopløsningen er forberedt i ddH2O og bragt ind i løsning af drop-wise tilsætning af 500 mM NaH2PO4. Alternativt, d-biotin kan også være opløst i DMSO. At producere nanobodies sammenvokset til APEX2 (VHH-APEX2), LB medium skal suppleres desuden med 1 mM 5-aminolaevulinsyre syre (dALA) hydroklorid at fremme hæm indarbejdelse. dALA er udarbejdet som en 100 mM stamopløsning i ddH2O.
  5. Inkubér IPTG-induceret 1 L bakteriekultur ved 30 ° C i 4 h for VHH-2xTS, ved 20 ° C eller RT O/N til VHH-APEX2 eller på 16 ° C O/N til VHH-mCherry (Se også tabel 1 plasmid oplysninger).
    Bemærk: Udtrykket betingelser for en ny nanobody konstruktion skal optimeres ved eksperimentatoren.
  6. Overføre bakteriekulturen fra kolben i et 1 L centrifugering flaske og sammenpresse cellerne på 5.000 x g ved 4 ° C i 45 min. Decant supernatanten og fortsætte med rensning.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her ved at gemme den bakterielle pellet ved-80 ° C på ubestemt tid. Pellet til VHH-APEX2 eller VHH-mCherry er typisk brunlig (på grund af den indbyggede hæm) eller pink, henholdsvis.

3. rensning af Functionalized Nanobodies

  1. Hvis det er nødvendigt, optø frosne bakteriel pellet på is (Se også trin 2.6).
  2. Der tilsættes 30 mL iskold binding buffer (20 mM imidazol i 1 x PBS) til bakteriel celle pellet og resuspend af pipettering op og ned. Overføre resuspenderet bakterier ind i en mærket 50 mL rør.
  3. Tillæg 30 mL binding buffer med 200 µg/mL Lysozym, 20 µg/mL DNase I, 1 mM MgCl2 og 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) og inkuberes først for 10 min på RT, og derefter 1 time ved 4 ° C på en ende over ende shaker.
  4. Mekanisk lyse bakterieceller i en 50 mL tube ved at placere et tip sonikator i suspensionen. Anvende konstant 3 x 1 min. pulser med 1 min afkøling perioder mellem.
  5. Der centrifugeres bakterielle lysate på 15.000 x g ved 4 ° C i 45 min til pellet debris og intakt celler. Overfør sonicated bakteriel cellen lysate enten i en passende centrifugering flaske til centrifugering eller opdele den lysate i flere 5 mL rør til bordplade centrifugering.
  6. Overføre supernatanten ind i en ny 50 mL rør og kassér den pelleted debris.
  7. Gemme den ryddet lysate på is samtidig med at forberede rensning af immobiliserede metal affinitet kromatografi (IMAC). For at isolere histidin-markeret functionalized nanobodies, ansætte enkelt-bruger hans kolonner (Se Tabel af materialer) giver mulighed for hurtig og enkel tyngdekraft-flow rensning.
    Bemærk: Alternativt kan batch rensning i stedet for kommercielle kolonner bruges også.
  8. Montering af hans kolonner på en Metal stativ.
    1. Taper ned kolonner lagerløsning, og Blandingen henstår hans kolonne med 10 mL af binding buffer (20 mM imidazol i 1 x PBS).
    2. Tomme af tyngdekraften flow (gennemstrømnings-kan blive kasseret).
  9. Gradvist indlæse fjernes bakteriel lysate (~ 30 mL) over på kolonnen. Tomme af tyngdekraften flow (gennemstrømnings-kan blive kasseret).
  10. Vaske hans kolonne 2 x med 10 mL af binding buffer (20 mM imidazol i 1 x PBS).
  11. Elueres nanobodies med 2 mL af eluering buffer (500 mM imidazol i 1 x PBS) ind i et 2 mL rør og anvende en buffer udveksling.
  12. Buffer Exchange.
    1. Blandingen henstår en afsaltning kolonne (Se Tabel af materialer) placeret i en 50 mL tube kolonne adapter 5 gange med 5 mL af 1 x PBS.
    2. Tillad bufferen til at indtaste den pakkede seng. Kassér gennemstrømnings.
    3. Efter den femte PBS ækvilibrering, spin kolonnen ved 1.000 x g i 2 min.
    4. Kassér gennemstrømnings.
    5. Sted kolonnen med adapter ind på en ny 50 mL tube. Indlæse elueret functionalized nanobody (fra trin 3.11) på PBS-ekvilibreres udvanding kolonne og spin på 1.000 x g i 2 min. 2 mL og Eluatet opsamles.
      Bemærk: I stedet for kommercielle udvanding kolonner, kan dialyse anvendes til at udveksle buffer sammensætning.
  13. Bestemme proteinkoncentration (nanobody) af eluatet ved hjælp af bicinchoninic (BCA) eller Bradford assay ifølge producentens anvisninger.
    Bemærk: For nanobody optagelse assays af normal god landbrugspraksis reporter cellelinjer er en stock koncentration på 2-10 mg/mL optimal.

4. validering af Functionalized Nanobody udtryk (Coomassie farvning)

  1. Forberede sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) Ifølge standardprotokoller 10-12,5% geler.
    Bemærk: Alternativt kan du bruge kommercielt tilgængelige præfabrikerede gradient geler.
  2. Med pipette overfoeres 20 µg af renset functionalized nanobody til en 1,5 mL rør og kog i prøvebuffer ved 95 ° C i 5 min.
    Bemærk: Som et eksempel, skal du tilføje 10 µL af en 2 mg/mL nanobody stamopløsning i 1,5 mL tube med 10 µL af 2 x prøvebuffer. Hvis volumen er for lille, fortyndes yderligere nanobody i PBS før du tilføjer prøvebuffer.
  3. Indlæse den renset nanobody kogt i prøvebuffer på en SDS-polyacrylamid gel, og køre efter standard side protokol indtil reference farvestof (f.eks. bromophenol blå) har nået slutningen af adskille gel, efterfulgt af Coomassie farvning og affarvning.
  4. Coomassie Gel farvning og affarvning.
    1. Uncast gel og bejdse det med Coomassie farvning løsning (5% af en 10 g/L Coomassie stamopløsning i 10% eddikesyre og 45% methanol i ddH2O) i 20-30 min på RT på en bevægende ryster platform. Gelen skal være helt dækket af Farvningsopløsningen.
    2. Destain gelen 2 - 3 gange med destain løsning (7.5% eddikesyre og 15% methanol i ddH2O) i 1 time på RT, før de forlader gel O/N for yderligere affarvning.
      Bemærk: Overskydende Coomassie kan være effektivt gennemblødt ved at placere køkken papirhåndklæder omkring gel.
  5. Billede gel med en imager eller kamera af valg.
    Bemærk: Nanobody udtryk kan yderligere valideret af immunblot analyse ved hjælp af antistoffer rettet mod dens epitoper (Se også figur 1A).

5. optagelse af Functionalized Nanobodies af dyrkede celler til fluorescens farvning

  1. I en celle kultur hætte, frø ~ 400.000 til 500.000 HeLa celler stabilt udtryk for en normal god landbrugspraksis-tagged reporter protein på 18-mm glas coverslips (No. 1,5 H) i 35-mm retter eller 6-godt klynger med komplet medium indeholdende antibiotika (Dulbeccos modificerede Eagle medium, DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 enheder/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin og 1,5 µg/mL puromycin).
    Bemærk: Her bruger vi HeLa celler stabilt udtrykker EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR og TfR-EGFP henblik på illustration. Ud over stabil cellelinjer, kan også forbigående transfekteret HeLa celler bruges. Stabil cellelinjer kan dyrkes sammen på dette trin med forældrenes ikke transduced HeLa celler, til direkte sammenligning.
  2. Inkuber celler O/N ved 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator at formere.
    Bemærk: Celler skal have en confluency ~ 80% det næste dag.
  3. Pipette 2 µL af en 2 mg/mL nanobody stamopløsning ind i en 15-50 mL rør indeholdende 2 mL af komplette mellemstore (dette volumen er tilstrækkelig til at dække en 35 mm parabol eller et godt af en 6-godt klynge, justere lydstyrken på medium og nanobody proportionalt til at omfatte flere celle kultur d ishes eller klynger).
    Bemærk: Med henblik på illustration bruger vi her VHH-mCherry, da ingen yderligere antistoffarvning er forpligtet til at se nanobody internaliseret af de EGFP journalister (Se figur 2 c).
  4. Fjern vækstmediet fra cellerne og der tilsættes 2 mL af forvarmet komplet medium indeholdende 2 µg/mL functionalized nanobody pr. 35 mm parabol eller 6-godt enhed.
  5. Inkuber celler i 1 timer ved 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator tillade reporter-medieret nanobody udbredelse.
    Bemærk: Afhængigt af den planlagte eksperiment skal tidspunktet for nanobody optagelse justeres. For forsøget vist her, er 1 h tilstrækkelige til at nå steady-state nanobody optagelse af EGFP-CDMPR og TfR-EGFP.
  6. Fjern mediet og cellerne vaskes 2 - 3 gange med 1 mL af 1 x PBS på RT.
  7. Fix cellerne med 1 mL 3% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 10 min på RT.
  8. Fjerne PFA løsning og slukke resterende fiksativ med 1 mL 50 mM NH4Cl i 1 x PBS for 5 min på RT.
    NOTE: 3% PFA skal bortskaffes separat som Fikseringsvæske affald.
  9. Cellerne vaskes 3 gange med 1 mL af 1 x PBS på RT.
  10. Permeabilize celler med 1 mL 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS for 10 min på RT.
    Bemærk: Selv om der kræves ingen permeabilization, er EGFP og mCherry fluorescens bedre når bagefter cellerne er indlejret i montering medium.
  11. Cellerne vaskes 3 gange med 1 mL af 1 x PBS på RT.
  12. Placere coverslips med pincet på en slip (~ 100 µL) af 1% BSA i 1 x PBS indeholdende 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i 5 min på RT.
  13. Plads i coverslips tilbage i parabol/brønd og vask 3 gange med 1 mL af 1 x PBS på RT.
  14. Etiket glas lysbilleder og montere celler med Fluoromount-G. Lad montering medium hærde i mørke for 3-4 h og gemme glas dias ved 4 ° C under lys beskyttelse.
  15. Billede farvning mønstre ved hjælp af et mikroskop af valg (f.eks. punkt Scanning Konfokal opretstående mikroskop).

6. udbredelse af Functionalized Nanobodies af dyrkede celler (for Sulfation analyse)

  1. I en celle kultur hætte, frø ~ 400.000 til 500.000 HeLa celler stabilt udtrykker en normal god landbrugspraksis-tagged reporter protein i 35 mm retter eller på 6-godt klynger med komplet medium indeholdende antibiotika (Dulbeccos modificerede Eagle medium, DMEM, suppleret med 10% føtal kalv serum (FCS), 100 enheder/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin og 1,5 µg/mL puromycin).
    Bemærk: Som nævnt ovenfor, bruger vi her HeLa celler stabilt udtrykker EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR og TfR-EGFP henblik på illustration. Ud over stabil cellelinjer, kan også forbigående transfekteret HeLa bruges.
  2. Inkuber celler O/N ved 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator at formere.
    Bemærk: Celler skal have en confluency ~ 80% næste dag.
  3. Fjerne den fuldstændige medium, vask 2 gange med 1 x PBS på RT og sulte celler med sulfat-fri medium (SFM) i 1 timer ved 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator.
    Bemærk: SFM fremstilles ved tilsætning af 10 mL af MEM aminosyrer (50 x) opløsning, 5 mL L-glutamin (200 mM), 5 mL vitamin opløsning (100 x) og 900 µL af CaCl2·2H2O til 500 mL af Eagles afbalanceret salte. Passere gennem et 0,22 µm filter og delprøve.
  4. I en ventileret hood eller bænk udpeget for radioaktivitet arbejde, forberede sulfat mærkning medium indeholdende 0,5 mCi/mL [35S] sulfat som natriumsalt i bæredygtig skovforvaltning.
    Forsigtighed: Omhyggeligt håndtere alle opløsninger indeholdende radioaktivitet. Kun arbejde i udpegede hætter eller bænke. Alle materiale (tips, rør, plader, etc.) eller vask buffere i kontakt med radioaktivitet skal opsamles og bortskaffes separat. Gør dette for alle trinene nedenfor (skridt 6,5-6,20) samt.
  5. Tilføj VHH-2xTS i 1 x PBS i sulfat mærkning medium til en slutkoncentration på 2 µg/mL.
    Bemærk: Som kontrol, også omfatte VHH-std eller en anden nanobody TS websteder for at påvise specifikke mærkning.
  6. Erstatte SFM med 0,7 mL af sulfat mærkning medium indeholdende 0,5 mCi/mL [35S] sulfat og 2 µg/mL VHH-2xTS og inkuberes celler i 1 timer ved 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator udpeget til at arbejde med radioaktivitet.
    Bemærk: Afhængigt af den planlagte eksperiment skal tidspunktet for nanobody sulfation justeres. Derudover Bestem TGN ankomst kinetik ved er mærkning udført for forskellige tidspunkter (f.eks. til 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
  7. Fjerne den mærkning medium og cellerne vaskes 2 - 3 gange med iskold 1 x PBS på en afkøling plade eller is.
  8. Der tilsættes 1 mL af lysisbuffer (PBS indeholdende 1% Triton X-100 og 0,5% deoxycholate) suppleret med 2 mM PMSF og 1 x protease hæmmer cocktail og inkuberes celler for 10-15 min på en vuggende platform ved 4 ° C.
  9. Skrabe og overførsel af lysate til en 1,5 mL tube, vortex lysate, og sted for 10-15 min på en ende over ende rotator ved 4 ° C.
  10. Forberede en postnuclear lysate ved centrifugering ved 10.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
  11. Ved hjælp af en ny 1,5 mL tube, forberede 20-30 µL af en opslemning af nikkel perler i 1,5 mL rør og vaske en gang med 1 x PBS ved forsigtigt pelleringsmidler dem ved 1.000 x g i 1 min.
    Bemærk: I stedet for nikkel kan perler, streptavidin perler (hvis nanobody er biotinylated) eller protein A perler med en IgG mod en epitop af nanobody (T7 - eller HA-tag) bruges.
  12. Overføre den postnuclear lysate ind i en 1,5 mL rør indeholdende nikkel perler og Inkuber i 1 time ved 4 ° C på en ende over ende rotator at isolere nanobodies. Fjerne en alikvot del (50-100 µL) af den postnuclear lysate og kog i SDS prøvebuffer for efterfølgende immunblot analyse af samlede celle-associerede nanobody, normal god landbrugspraksis reporter og lastning kontrol.
  13. Vaske perlerne 3 gange med 1 x PBS eller lysis buffer af forsigtigt pelleringsmidler ved 1.000 x g i 1 min.
    Bemærk: For strengere vask af perler, kan 20 mM imidazol medtages i PBS eller lysis buffer.
  14. Forsigtigt fjerne alle vask buffer fra glasperler, tilsæt 50 µL af 2 x prøvebuffer, og kog i 5 min. ved 95 ° C.
  15. Belastning både kogt perler på en midi 12,5% SDS-PAGE gel og køre efter standard side protokol indtil reference farvestof (f.eks. bromophenol blå) har nået slutningen af de adskillende gel.
    Bemærk: Immunblot analyse af samlede celle-associerede nanobody, normal god landbrugspraksis reporter og lastning kontrol kan også udføres ved hjælp af en mini 12,5% SDS-PAGE eller præfabrikerede gradient gel.
  16. Fix de adskillende gel i ~ 30 mL af fiksering buffer (10% eddikesyre og 45% methanol i ddH2O) i 1 time på RT, vaske gel tre gange med ~ 50 mL deioniseret vand og forberede gel tørring.
  17. Tørring SDS-PAGE geler.
    1. Omhyggeligt placere den fast gel på strakte plastfolie og dække det med precut filtrerpapir.
    2. Placere gel med filtrerpapir ned på tørring platformen, Placer vakuum dækslet, og tænd vakuumpumpen til gel tørring. Tørre gel for 3-5 h.
    3. Fjerne plastfolie og læg de tørrede gel i en Autoradiografi kassette udstyret med en fosfor skærm.
  18. Billede autoradiograph ved hjælp af en fosfor skærmen Imager. Følg vejledningen fra fabrikanten.
    Bemærk: Afhængigt af styrken af signalet, tørret geler skal udsættes længere med fosfor skærme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge retrograd protein transport til forskellige intracellulære destinationer, har vi for nylig etableret en anti-NGL nanobody-baseret værktøj til at mærke og følge rekombinant fusion proteiner fra celle overflade30. Her, påvise vi bakteriel produktion af sådanne derivatized nanobodies og demonstrere deres ansøgning at studere endocytic optagelse af Fluorescens mikroskopi samt immunoblotting og deres anvendelse at undersøge TGN ankomsten af sulfation analyse. Den sidstnævnte anvendelse er metodologiske fokus for denne protokol.

Vi har genereret en værktøjskasse med forskellige functionalized anti-normal god landbrugspraksis nanobodies med fælles funktioner af standard molekylære kloning30. Vores enkleste (standard) nanobody, VHH-std, indeholder VHH domæne, en T7 og en HA epitop for efterfølgende påvisning af specifikke antistoffer, en carboxyterminal hexahistidine (His6)-tag for rensning og et biotin acceptor peptid (BAP) rækkefølgen for biotinylation og høj-affinitet streptavidin pull-down eksperimenter (figur 1A). Forædling af VHH-std giver forskellige nanobody varianter for at undersøge endocytic optagelse og retrograd transport biokemisk, ved faste og levende celle imaging og ved elektronmikroskopi.

At vurdere protein trafik fra plasma membran til trans-Golgi/TGN, vi benyttede sig af den eksklusive lokalisering af tyrosylprotein sulfotransferases i disse rum og dermed ændret VHH-std med en tandem tyrosin sulfation site (2xTS) afledt fra rotte procholecystokinin41. Mens ændringer i VHH-std med mCherry giver mulighed for direkte visualisering af retrograd transport af fast og levende celle imaging, functionalization med en peroxidase, såsom APEX237, muliggør elektronmikroskopi undersøgelser, cytochemical rum ablation, eller nærhed-afhængige biotinylation reaktioner. Derudover tillader indsættelse af en spaltning site for tobakken etch virus (TEV) protease at biokemisk skelne mellem intracellulære og overflade-bundet nanobodies (figur 1A). Vi har tidligere brugt VHH-tev for at overvåge endocytic genanvendelse kinetik af nanobody-bundet EGFP-CDMPR og TfR-EGFP30. Nanobody genkomst på cellens overflade efter optagelse kunne vurderes simpelthen ved at jage med extracellularly anvendt rekombinant TEV protease forårsager en invers tab af den nanobody carboxyterminal epitop kassette. Herunder en spaltning site i mCherry eller APEX2 nanobody fusion er nyttige at studere genanvendelse kinetik af EGFP journalister af levende celle imaging på en lignende måde til VHH-tev eller begrænse cytochemical reaktioner på intracellulære rum, henholdsvis. Functionalization med andre protein domæner (f.eks. andre fluorophores eller enzymer) eller target sekvenser for andre posttranslationelle modifikationer kan opnås let ved subcloning en respektive indsætte ind i plasmid vektor kodning VHH-std (Se også Tabel 1 plasmid oplysninger) ved hjælp af tilgængelige SpeI og EcoRI begrænsning websteder.

Ved hjælp af protokollen, som beskrevet ovenfor, kan alle nanobodies illustreret her isoleres til høj renhed og udbytte (figur 1B). Kun mCherry fusions viste mindre klipning af protein domæner post rensning (figur 1B, se baner 7-8). I mangel af BirA udtryk fremstillet vi typisk 25-35 mg til VHH-std, VHH-2xTS og deres tev-modificerede modparter, eller ~ 20 mg for VHH-APEX2 og VHH-mCherry og derivater deraf tev-holdige. Vores erfaring viser, at BirA coexpression sænker nanobody udbytte med en tredjedel til halvdelen.

For at illustrere reporter-medieret nanobody optagelse, har vi brugt HeLa cellelinjer stabilt udtrykker EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR og TfR-EGFP (figur 2A og B). EGFP var smeltet ekstracellulære/lumenal slutningen af hvert protein (dvs. mellem signal og reporter rækkefølgen af CNX eller CDMPR), og carboxyterminus af TfR, forlader de cytosole sortering signaler uhindret. Alle disse EGFP-tagged cargo molekyler har forskellige intracellulære handel ruter efter ER rettet mod. Da EGFP-Calnexin er bosat på Skadestuen og normalt ikke nå post-Golgi rum, tjener det som en negativ kontrol for potentielle og uspecifikke nanobody udbredelse. Derimod EGFP-CDMPR og TfR-EGFP har transport funktioner ud over Golgi og således vises støt på plasmamembran. Som forventet, når VHH-mCherry blev tilføjet til en blandet population af uforandret HeLa og celler, der stabilt udtrykker EGFP-CNX, kunne ingen nanobody internalisering være observeret i begge tilfælde. Men både EGFP-CDMPR og TfR-EGFP erobrede VHH-mCherry på celleoverfladen og transporteret dem piggyback til reporter's homing rum (figur 2 c).

VHH-mCherry colocalization med en resident TGN markør kunne anvendes i princippet til at vurdere TGN ankomst. Endnu, vi etableret en biokemiske tilgang baseret på tyrosin sulfation. For at drage fordel af denne ændring forekommer i trans-Golgi/TGN, nanobodies blev functionalized med TS lokaliteter (figur 1A). For at demonstrere specificitet og funktionalitet af disse protein bindemidler, rugede vi umodificeret HeLa celler og celler, der udtrykker stabilt EGFP-CNX, EGFP-CDMPR og TfR-EGFP med VHH-std eller VHH-2xTS for 1 h i overværelse af radioaktivt sulfat. Radiolabeling af VHH-2xTS kun opstår, når en journalist transporterer nanobody retrogradely til TGN hvor det er udsat for tyrosin sulfation maskiner. HeLa udtrykker EGFP-CNX og deres forældres celler vises ingen nanobody udbredelse og dermed ingen sulfation. EGFP-CDMPR og TfR-EGFP internaliseret nanobodies, sidstnævnte betydeligt, mere end de tidligere. Dog kun EGFP-CDMPR forårsaget VHH-2xTS at være sulfated (figur 3A). Dette bekræfter effektiv retrograd transport af CDMPR fra cellens overflade til TGN og giver beviser mod TfR vender tilbage til TGN (som er blevet foreslået i nogle undersøgelser42,43).

Kinetik af internalisering og TGN ankomsten af reporter proteiner kan også bestemmes ved at analysere cellelysater efter forskellige tidspunkter for nanobody optagelse og sulfation. Med EGFP-CDMPR som reporter, fandt sulfation starter kun efter en mellemliggende periode på ~ 15 min og nå frem til mætning kun efter > 75 min (figur 3B, baner 1-6, og C, firkantet symboler). Optagelse og sulfation kinetik syntes flyttet af næsten 30 min, afspejler transport til TGN. Derudover metoden gør det muligt for at undersøge den sortering maskiner involveret i MPR transport af farmakologiske indblanding eller protein silencing tilgange såsom knockdown, knockout eller knocksideways. Her brugte vi brefeldin A (BFA), en hæmmer af guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) af flere Arf GTPases, generelt forstyrrer retrograd transport til TGN. Når behandlet med BFA, blev sulfation helt afskaffet, mens optagelsen forblev upåvirket både i kinetik og i omfang (figur 3B, baner 7-12, og C, runde symboler).

Figure 1
Figur 1: Design og produktion af functionalized nanobodies til at spore EGFP-ændret celle overflade proteiner. (A) skematisk gengivelse af den derivatized nanobodies. Den standard nanobody består af normal god landbrugspraksis-specifikke VHH domæne, T7 og HA epitop tags, en BAP, og en hexahistidine (His6) rensning tag. Andre nanobodies omfatter desuden to TSs, APEX2 eller mCherry, hver med eller uden en spaltning site for TEV protease (tev). Skalalinjen er i aminosyrer (aa). (B) udtrykt Bacterially og renset nanobodies (50 μg) blev analyseret af gradient SDS-gelelektroforese og farves med Coomassie. Markør proteiner med molekylmasse i kDa er vist til venstre. Kun VHH-mCherry og VHH-tev-mCherry viste minimal klipning mellem VHH og mCherry domæner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: optagelse og intracellulære lokalisering af VHH-mCherry af forskellige EGFP reporter proteiner. (A) skematisk repræsentation af EGFP fusion proteiner. Sekvenser afledt af sekretoriske Membranproteiner er vist i sort med N-terminalen signal peptider og interne transmembrane segmenter i gul, og EGFP er illustreret med grønt. EGFP var smeltet til fuld længde CDMPR, TfR og Calnexin (CNX). Skalalinjen i aminosyrer (aa). EGFP-CDMPR og TfR-EGFP har været beskrevet30. (B) HeLa celler stabilt udtrykker EGFP reporter proteiner er høstet, mængden, og analyseret af SDS-gel elektroforese og immunoblotting ved hjælp af anti-normal god landbrugspraksis og anti-actin antistoffer. Molekylvægt i kDa er angivet til højre. (C) HeLa celler stabilt udtrykker EGFP-tagged reporter proteiner var blandet med forældrenes HeLa celler, inkuberes med 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) for 1 h ved 37 ° C og forarbejdet til fluorescens mikroskopi. Skalalinjen = 10 μm. Optagelse sker kun af celler, der udtrykker en reporter med EGFP udsat på cellens overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sulfation analyse og kinetik af retrograd transport til TGN bruger TS-markeret nanobodies. (A) Børnesikring og HeLa celler stabilt udtrykker EGFP modificerede reporter proteiner var mærket ved hjælp af 0,5 mCi/mL [35S] sulfat i 60 min. med 2 μg/mL VHH-std eller VHH-2xTS. Nanobodies blev isoleret ved hjælp af nikkel perler, adskilt på en 12,5% SDS-PAGE efterfulgt af Autoradiografi. Delprøver af cellelysater blev indsamlet før nikkel pull ned og immunoblotted for celle-associerede nanobody (His6), EGFP og aktin. (B og C) HeLa celler stabilt udtrykker EGFP-CDMPR var mærket med 0,5 mCi/mL [35S] sulfat for op til 75 min tilstedeværelse af 2 μg/mL VHH-2xTS med og uden 2 μg/mL BFA før analyse som i (A). Kvantitering af VHH-2xTS udbredelse og sulfation fra tre uafhængige forsøg er vist i procent af værdi uden BFA efter 75 min (middelværdi og SD). Sorte firkanter, uden BFA; grå cirkler med BFA; åbne symboler, optagelse; fyldt symboler, sulfation. Dette tal har været ændret og udvidet fra Buser et al., 2018, PNAS30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Protein sekvenser af den functionalized nanobodies vist i denne undersøgelse. T7 epitop i grå, VHH i sort, HA epitop i blå, BAP sekvens i orange, hexahistidine (His6) i rød, TEV protease kavalergang site i lilla, myc epitop i magenta, tyrosin sulfation sekvens i gul, APEX2 i grøn, og mCherry i pink. Udtrykket vektorer kodning disse functionalized anti-NGL nanobodies er blevet deponeret (Se også tabel 1 plasmid oplysninger). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies repræsenterer en ny klasse af protein binder stilladser med mange fordele i forhold til konventionelle antistoffer: de er lille, stabil, monomere, kan vælges for høj affinitet og manglende disulfid obligationer33,35, 44 , 45. de bruges i en række applikationer, såsom i celle kultur systemer og organismer i udviklingsmæssige biologi46,47,48,49, som krystallisering chaperoner til stabilisere konformationelle stater i strukturbiologi50,51,52,53, som hæmmere eller aktivitet modulatorer af enzymer54,55, 56, immunhistokemisk reagenser til biokemiske analyser57, eller som "sekundære nanobodies" at opdage anti-mus og anti-kanin immunoglobuliner på immunoblots og immunfluorescens58. I vores tidligere undersøgelse, vi har udviklet og anvendt functionalized nanobodies produceret af bakteriel udtryk til overfladen-label proteiner og spore deres intracellulære rute til forskellige rum, især til TGN30. Vi brugte en anti-NGL nanobody at gøre værktøjet alsidige, i stand til target fusion proteiner med ekstracellulære normal god landbrugspraksis, YFP eller mCerulean, som muligvis allerede tilgængelige og karakteriseret. Ændring af anti-NGL nanobodies med mCherry, APEX2 eller TS sites gjort det muligt at overvåge reporter optagelse af faste og levende celle imaging, til ultrastructurally visualisere retrograd transport rum, ablate disse rum eller studere transport kinetik til TGN. En ulempe af vores værktøj er at rekombinant ændring af target cellelinjer (stabil udtryk eller endogene tagging) er nødvendig, før functionalized anti-NGL nanobodies kan anvendes. Functionalization kan selvfølgelig også anvendes til det hastigt voksende antal nanobodies rettet mod ukodede endogene target proteiner fastsat af animalsk immunization eller af ribosomet-display og phage display udvalg af syntetiske VHH biblioteker59. Bruger nanobodies modificeret med TS sites (fx VHH-2xTS), kan vi direkte måle transport og kinetik af TGN ankomsten af forskellige EGFP-modificerede mål proteiner. Vi har anvendt VHH-2xTS for at studere adapter protein kompleks 1 bidrag (AP-1) i retrograd transport af MPRs direkte kinetic analyse i knocksideways celler giver mulighed for hurtig inaktivering af given transport maskiner30. Nanobody sulfation og dermed retrograd transport af EGFP-mærket MPRs var delvis, men ikke helt blokeret. Vores nanobody-baseret tilgang ved hjælp af sulfation som TGN ankomst sensor bekræftede tidligere resultater fra andre laboratorier, der angiver en funktionel bidrag af AP-1 i retrograd endosome til TGN transport17,60, 61. Sulfatable nanobodies kan således give en nyttig biokemiske værktøj til at dissekere bidrag af andre retrograd transport machineries, såsom epsinR, Rab9/TIP47 eller SNX-BAR/retromer komplekser, på cargo proteiner af genomisk, genetiske og kemiske manipulation. Protokollen præsenteres her giver et grundlag for hvordan man kan gøre brug af functionalized nanobodies i almindelighed til at bestemme målet rum, veje, og transportere kinetik i kulturperler celler.

Andre grupper har allerede gjort brug af TS websteder at følge transport fra cellen overflade til TGN. Ricin, Shiga eller kighoste toksin underenheder er tidligere blevet ændret med sulfation websteder til at demonstrere en transportrute gennem TGN62,63,64,65,66. Derudover havde TS peptider også været kemisk koblet til IgGs til assay retrograd transport af normal god landbrugspraksis-CIMPR og endogene TGN46 til TGN67,68. Vores sulfatable nanobodies har fordelen af simpel og reproducerbar bakteriel produktion og en 1:1 støkiometrisk med target proteinet. Tværtimod, det er for eksempel kendt at divalent protein bindemidler, såsom IgGs, kan bitmapgenkendelse cellens overflade proteiner og ændre deres intracellulære handel til lysosomer efter endocytose69,70, fremhæve den betydningen af monomere protein bindemidler med hensyn til eksisterende metoder. Et kritisk trin i vores teknik er, at håndtering med radioaktivitet er forpligtet til at udføre sulfat mærkning af nanobodies. Vores værktøj af functionalized nanobodies med TS websteder til at studere TGN ankomst kan potentielt anvendes dog uden radioaktivitet ved hjælp af anti-sulfotyrosine antistoffer.

Vores tidligere undersøgelse tyder på, at nanobody sulfation ikke er meget effektive, da sulfation af MPRs ikke havde endnu nået et maksimum efter 75 min, selv om nanobody udbredelse var mættet efter 45 min.30. Screening for andre naturområder TS kan forbedre sulfation effektivitet. Alternativt, at potentielt øge sulfation effektivitet, komponenter af selve sulfation maskinen, såsom TPST1 og TPST2, kan være overexpressed. Faktisk har det tidligere været vist at overekspression af en af transportvirksomheder levere 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS), substrat for TPSTs, fra cytosol til lumen af Golgi kunne ændre sulfation status af proteoglycaner 71.

Ud over sulfatable nanobodies tillade andre derivatizations også sporing transport gennem endocytic rum og til TGN. APEX2 kan anvendes som en promiskuøs mærkning enzym til nærhed-afhængige biotinylation proteom analyse af retrograd transport. APEX2 nanobody, der er internaliseret af en last reporter interesse vil mærke proteiner i umiddelbar nærhed af inden for target rum. Sammenlignende proteomics bør gør det muligt for at identificere andre endogene proteiner i de forskellige typer af endosomes og den TGN, der har adgang til nanobody. Mange varianter af nanobodies i kombination med sine mål protein er tænkeligt. En nylig rapport, for eksempel, anvendes en omvendt fremgangsmåde beskrevet her: derivatized normal god landbrugspraksis blev brugt til at studere og fælde cellularly udtrykt anti-NGL nanobody-tagged vakuolære sortering receptorer i anterograd og retrograd rum af anlægget endomembrane system72. Functionalized nanobody-fælder kan ligeledes udformes i pattedyr celle kultur systemer til at fange og akkumulere EGFP modificerede journalister i forskellige rum under retrograd transport.

Vores her præsenteret metode og protokol med fokus på TS websted-markeret nanobodies giver mulighed for kvantitativ og kvalitativ sporing af lasten proteiner fra celleoverfladen endocytic rum og TGN i kulturperler pattedyrsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud 31003A-162643 af den schweiziske National Science Foundation. Vi takker Nicole Beuret og Biozentrum Imaging Core facilitet (IMCF) for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 144 nanobodies retrograd transport Golgi kompleks tyrosin sulfation bakteriel udtryk radiolabeling EGFP HeLa celler
Analyse af Endocytic optagelse og retrograd Transport til Trans-Golgi netværket ved hjælp af Functionalized Nanobodies i kulturperler celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter