Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Retrograd transporten av proteiner från cellytan till Golgi är viktigt att upprätthålla membran homeostas. Här, beskriver vi en metod för att analysera biokemiskt cell surface-till-Golgi transport av rekombinanta proteiner med functionalized nanobodies i HeLa cells.

Abstract

Transport av proteiner och membran från cellytan till Golgi och därefter är viktigt för homeostas, organell identitet och fysiologi. För att studera retrograd protein trafik, har vi nyligen utvecklat en mångsidig nanobody-baserade verktyg för att analysera transport från cellytan till Golgi komplexet, antingen genom fasta och levande cell imaging, genom elektronmikroskopi eller biokemiskt. Vi konstruerade functionalized anti grönt fluorescerande protein (GFP) nanobodies – små, monomer, hög affinitet protein bindemedel — som kan tillämpas på cellinjer som uttrycker membranproteiner intresse med en extracellulär GFP biexponentiellt. Derivatized nanobodies bunden till GFP reportrar är specifikt internaliserats och transporteras piggyback längs de reportrarna sortering rutter. Nanobodies var functionalized med fluorophores att följa retrograd transport genom fluorescensmikroskopi och leva imaging, med askorbat peroxidas 2 (APEX2) att undersöka ultrastrukturella lokaliseringen av reporter-nanobody komplex av elektron Mikroskopi, och med tyrosin sulfatering (TS) motiv att bedöma kinetik av trans-Golgi nätverk (TGN) ankomst. I denna metodologiska artikel beskriva vi det allmänna förfarandet för att bacterially express och rena functionalized nanobodies. Vi illustrerar den kraftfulla användningen av vårt verktyg använder de mCherry - och TS-modifierat nanobodies att analysera endocytic upptag och TGN ankomsten av last proteiner.

Introduction

Retrograd trafik av proteiner och lipider från cellytan till olika intracellulära fack är avgörande för underhåll av membran homeostas motvikt sekretion och att återvinna komponenter anterograd transport maskinerier1 , 2. efter internalisering via clathrin-beroende eller -oberoende endocytos, protein och lipid last först fylla tidigt endosomes från där de är ytterligare Omdirigerad antingen längs endo-lysosomala systemet, återvinns till plasmamembranet, eller riktade till nätverkets trans-Golgi (TGN). Återvinning från endosomes eller cellytan till TGN är en del av funktionell cykel av ett antal anterograd transmembrana last receptorer som katjon-beroende och katjon-oberoende mannos-6-fosfat receptorerna (CDMPR och CIMPR) att leverera Nyligen syntetiseras lysosomala hydrolaser från TGN till sena endosomes och lysosomer3,4,5, sortilin och SorLA6,7, och Wntless (WLS) transportera Wnt ligander till cellytan 8 , 9 , 10 , 11. andra proteiner som Hämtad tillbaka till TGN är TGN46 och dess relaterade isoformer12,13,14, snaror (lösliga N- ethylmaleimide-känslig fusion faktor fastsättning receptorer) 15 , 16 , 17, amyloid prekursor protein (APP)18,19, progressiv fixation (ANK) protein20, metall transportörer såsom ATP7A/B eller DMT121,22, och transmembrana bearbetning enzymer inklusive karboxypeptidas D, furin eller BACE123,24,25. Förutom dessa kroppsegna proteiner kapa bakteriell och växt toxiner (t.ex. Shiga och kolera toxin, ricin och abrin) retrograd transport maskinerier för att nå ER för retrotranslocation in i det cytosol26,27, 28,29.

För att direkt analysera retrograd trafik, har vi tidigare utvecklat en nanobody-baserad verktygslåda för att märka och följ last proteiner från cellytan till intracellulär fack30. Nanobodies representerar en ny familj av protein bindemedel härrör från homodimeric heavy-kedja-bara antikroppar (hcAbs) som förekommer naturligt i kameldjur och broskfiskar31,32. De utgör variabeln heavy-kedjan domän (VHH) hcAbs och har många fördelar jämfört med konventionella antikroppar (t ex IgG): de är monomer, små (~ 15 kDa), lättlösligt, saknar disulfide obligationer, kan bacterially uttryckt och valts för hög affinitet bindande33,34,35,36. För att göra vår nanobody verktyg mångsidigt och brett tillämpliga, anställt vi functionalized anti-GFP nanobodies till ytan-etikett och spår proteiner taggade med GFP på sin extracellulära/lumenal domän. Av funktionalisering av nanobodies med mCherry, askorbat peroxidas 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfatering (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrana last proteiner kan analyseras genom att antingen fast och leva cell imaging, genom elektronmikroskopi, eller biokemiskt. Eftersom tyrosin sulfatering medieras av tyrosylprotein sulfotransferaser (TPST1 och TPST2) är en posttranslationell modifiering är begränsad till de trans-Golgi/TGN, kan vi direkt studera transport och kinetik av proteiner av intresse från cellytan till detta intracellulära Golgi fack38,39,40.

I den här metoder artikeln beskriver vi lättheten av produktion av functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry och derivat) lämpad för ett antal applikationer att analysera retrograd transport i däggdjursceller30. Vi fokuserar huvudsakligen på användningen av TS webbplats-modifierat nanobody för analys av intracellulära trafik från cellytan till utrymmet av sulfatering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bakteriell omvandling med Functionalized Nanobodies

Obs: Detta protokoll har optimerats för uttryck, rening och analys av functionalized anti-GFP nanobodies som tidigare beskrivits30. Derivatisering med andra protein beståndsdelarna kan kräva en ändring av denna standard protokoll.

  1. Tina chemocompetent bakterier (~ 100 µL) lämpad för proteinuttryck (t.ex. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) genom att placera dem på isen.
    Obs: Förbered chemocompetent bakterieceller enligt standard lab förfaranden. Alternativt kan kemiskt behöriga bakterieceller köpas kommersiellt.
  2. Tillsätt 50 ng av en plasmid kodning functionalized nanobodies. För att tillåta tillräcklig platsspecifika biotinylation av nanobody reporter under bakteriella uttryck, även lägga till ett trefaldigt överskott (150 ng) för en bakteriell uttryck plasmid kodning biotin ligase BirA (se även tabell 1 plasmid information). Pipettera försiktigt upp och ner.
    Obs: Om nanobody biotinylation är inte nödvändigt eller nanobody reportrar saknar en biotin acceptor peptid (BAP), krävs inte samtidig omvandling med en plasmid kodning BirA.
  3. Inkubera bakteriecellerna i 30 min på is.
  4. Värme chock bakteriecellerna genom att placera dem för 1 min på 42 ° C i ett vattenbad eller ett värmeblock.
  5. Tillsätt 1 mL rumstempererat (RT) Luria buljong (LB) medium och inkubera transformerad bakterier i en thermoshaker för 1 h vid 37 ° C att tillåta fenotypisk expression av antibiotikaresistensgener. För att förbereda 1 L LB medium, balans 5 g jäst extrakt, 10 g trypton och 10 g NaCl, fyll upp med vatten och sterilisera i autoklav. Om den functionalized nanobody har varit subcloned i ett uttryck vektor som innehåller resistens mot ampicillin/carbenicillin, kan steg 1,5 utelämnas.
  6. Pellet bakterierna vid 11 000 x g i 1 min och återsuspendera i 100 µL av färska LB medium.
  7. Tallrik svävande bakterier på LB plattor som innehåller respektive antibiotika (t ex med 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL carbenicillin när bakterierna har varit co omvandlas med nanobody reporter och BirA som nämnts ovan (steg 1.2)).
  8. Placera LB plattorna i en inkubator vid 37 ° C och låt växa övernattning (O/N).
    Obs: Protokollet kan pausas här genom att lagra LB plattan med odlade kolonier vid 4 ° C. Använda parafilm för att försegla LB plattor.

2. flytande bakterieodling och induktion av Functionalized Nanobody uttryck

  1. Plocka en bakteriell koloni som innehåller vektorn av intresse från plattan och låt den växa i en mätkolv som innehåller 20 mL LB medium kompletteras med antibiotika O/N i en skakande inkubator vid 37 ° C (se även steg 1,7 angående val av antibiotika).
  2. Nästa dag, späd den odlade 20 mL bakteriella kulturen i en mätkolv som innehåller 1 L LB medium med val av antibiotika.
  3. Fortsätta att Inkubera bakteriella kulturen vid 37 ° C tills den når en OD600 av 0,6-0,7. Låt kulturen svalna till RT innan inducerande proteinuttryck.
  4. Inducera proteinuttryck functionalized nanobodies och BirA genom tillsats av 1 mL 1 M isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) till en slutkoncentration av 1 mM av induceraren (1:1, 000 utspädning). Också lägga till 10 mL av en 20 mM d-biotin stamlösning resulterar i 200 µM d-biotin i odlingsmedium för att biotinylation av den BAP epitop närvarande i functionalized nanobodies (se även tabell 1 plasmid information)
    Obs: D-biotin stamlösning bereds i ddH2O och förs in lösning av och tillägg av 500 mM NaH2PO4. Alternativt, d-biotin kan också upplösas i DMSO. Att producera nanobodies smält till APEX2 (VHH-APEX2), LB medium måste kompletteras dessutom med 1 mM 5-aminolevulinsyra syra (dALA) hydrochloride att främja heme inkorporering. dALA är beredd som 100 mM stamlösning i ddH2O.
  5. Inkubera IPTG-inducerad 1 L bakteriella kulturen vid 30 ° C i 4 h för VHH-2xTS, vid 20 ° C eller RT O/N för VHH-APEX2 eller vid 16 ° C O/N för VHH-mCherry (se även tabell 1 plasmid information).
    Obs: Uttrycket villkor för en ny nanobody konstruktion måste optimeras genom experimenter.
  6. Överföra den bakteriella kulturen från kolven i en 1 L centrifugering flaska och pellet cellerna på 5 000 x g vid 4 ° C för 45 min. Dekantera supernatanten och fortsätta med rening.
    Obs: Protokollet kan pausas här genom att lagra den bakteriella pelleten vid-80 ° C på obestämd tid. Pelleten för VHH-APEX2 eller VHH-mCherry är vanligen brunaktig (på grund av den inbyggda heme) eller rosa, respektive.

3. rening av Functionalized Nanobodies

  1. Om nödvändigt, Tina den frysta bakteriella pelleten på is (se även steg 2,6).
  2. Tillsätt 30 mL iskall bindande buffert (20 mM Imidazol i 1 x PBS) till bakteriell cellpelleten och resuspendera genom pipettering upp och ner. Över återsuspenderade bakterier till en märkt 50 mL tub.
  3. Tillägg 30 mL bindningen buffert med 200 µg/mL lysozym, 20 µg/mL DNAS jag 1 mM MgCl2 , 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) och inkubera först för 10 min vid RT, och sedan för 1 h vid 4 ° C på en över slut shaker.
  4. Mekaniskt lysera bakterieceller i en 50 mL tub genom att placera en tip någon sonikator i suspensionen. Tillämpa konstant 3 x 1 min pulser med 1 min kylning perioder däremellan.
  5. Centrifugera bakteriella lysate vid 15 000 x g vid 4 ° C i 45 min till pellet det skräp och intakta celler. Överför den sonicated bakteriell cellen lysate endera in en lämplig centrifugering flaska för centrifugering eller dela upp den lysate i flera 5 mL rör för bordsskiva centrifugering.
  6. Överför supernatanten till en ny 50 mL tub och kassera pelleterat skräp.
  7. Lagra den rensade lysate på is medan du förbereder rening av immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC). För att isolera histidin-taggade functionalized nanobodies, anställa engångsbruk hans kolumner (se Tabell för material) möjliggör snabb och enkel gravitation flöde rening.
    Obs: Alternativt, batch rening i stället för kommersiella kolumner kan också användas.
  8. Montering hans kolumner i en metall monter.
    1. Smalna av kolumnernas lagringslösning och temperera hans kolumn med 10 mL bindande buffert (20 mM Imidazol i 1 x PBS).
    2. Tom av gravitation flöde (genomströmmande kan kastas).
  9. Gradvis ladda den rensade bakteriell lysate (~ 30 mL) på kolumnen. Tom av gravitation flöde (genomströmmande kan kastas).
  10. Tvätta hans kolumn 2 x med 10 mL bindande buffert (20 mM Imidazol i 1 x PBS).
  11. Eluera nanobodies med 2 mL eluering buffert (500 mM Imidazol i 1 x PBS) i en 2 mL rör och tillämpa en buffert exchange.
  12. Buffert Exchange.
    1. Temperera en avsaltning kolumn (se Tabell för material) placeras i en 50 mL tub kolumn adapter 5 gånger med 5 mL 1 x PBS.
    2. Tillåta att bufferten ange packade sängen. Kassera genomflöde.
    3. Efter den femte PBS Jämviktstiden, snurra kolumnen vid 1 000 x g i 2 min.
    4. Kassera genomflöde.
    5. Placera kolumnen med adaptern på en ny 50 mL tub. Ladda de 2 mL av functionalized eluerat nanobody (från steg 3.11) till PBS-jämviktas avsaltning kolumn och snurra på 1 000 x g i 2 min och samla eluatet.
      Obs: I stället för kommersiella avsaltning kolumner, kan dialys användas för att utbyta buffert sammansättning.
  13. Bestämma protein (nanobody) koncentrationen av eluatet med hjälp av bicinchoninic (BCA) eller Bradford assay enligt tillverkarens anvisningar.
    Obs: För nanobody upptag analyser av GFP reporter cellinjer är ett lager koncentration på 2 – 10 mg/mL optimal.

4. validering av Functionalized Nanobody uttryck (Coomassie färgning)

  1. Förbereda 10-12,5% geler för sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) enligt standardprotokoll.
    Obs: Du kan också använda kommersiellt tillgängliga förtillverkade gradient geler.
  2. Pipettera 20 µg av renat functionalized nanobody in i en 1,5 mL tub och koka i provet buffert vid 95 ° C i 5 min.
    Obs: Som ett exempel, Lägg till 10 µL av 2 mg/mL nanobody stamlösning i ett 1,5 mL rör med 10 µL 2 x provet buffert. Om volymen är för liten, späd ytterligare nanobody i PBS innan du lägger till provet buffert.
  3. Ladda den renade nanobody kokt i provet buffert på en SDS-Polyakrylamidgelen och kör enligt standardprotokollet sida referens färgen (t.ex. bromofenolblått) har kommit till slutet av Separerande gel, följt av Coomassie färgning och avfärgning.
  4. Coomassie Gel färgning och avfärgning.
    1. Uncast gelen och färga det med Coomassie färglösningen (5% av en 10 g/L Coomassie stamlösning i 10% ättiksyra och 45% metanol i ddH2O) för 20-30 min på RT på en rörlig skakar plattform. Gelen bör vara helt täckt i färglösningen.
    2. Avfärga gelen 2 - 3 gånger med Avfärga lösningen (7,5% ättiksyra och 15% metanol i ddH2O) för 1 h varje på RT, innan du lämnar gelen O/N för ytterligare avfärgning.
      Obs: Överskott Coomassie kan vara effektivt sugit upp genom att placera kök pappershanddukar runt gelen.
  5. Bild gelen med imager eller kamera val.
    Obs: Nanobody uttryck kan verifieras ytterligare av immunoblot analys med antikroppar riktade dess epitoper (se även figur 1A).

5. upptag av Functionalized Nanobodies av odlade celler för fluorescens färgning

  1. I en cell kultur huva, utsäde ~ 400.000 till 500.000 HeLa cells stabilt uttrycker ett GFP-märkta reporter protein på 18-mm glas coverslips (nr 1,5 H) i 35-mm rätter eller 6-väl kluster med komplett medium innehållande antibiotika DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle medium, kompletterad med 10% fetalt kalvserum (FCS), 100 enheter/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin och 1,5 µg/mL puromycin).
    Obs: Här, använder vi HeLa cells stabilt uttrycker andra-Calnexin, andra-CDMPR och TfR-andra i illustrationssyfte. Bortsett från stabil cellinjer, kan också övergående transfekterade HeLa celler användas. Stabil cellinjer kan odlas tillsammans på detta steg med föräldrarnas icke-sensorik HeLa cells, för direkt jämförelse.
  2. Inkubera cellerna O/N vid 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator föröka.
    Obs: Cellerna bör ha en konfluens ~ 80% nästa dag.
  3. Pipettera 2 µL av 2 mg/mL nanobody stamlösning till en 15 eller 50 mL tub innehållande 2 mL komplett medium (denna volym är tillräcklig för att täcka en 35 mm maträtt eller en brunn i ett 6-väl kluster, justera volymen på medium och nanobody proportionellt för att inkludera mer cell kultur d Herren eller kluster).
    Obs: För illustration använder vi här VHH-mCherry, eftersom ingen ytterligare antikropp färgning krävs att se nanobody internaliseras av andra reportrar (se figur 2 c).
  4. Ta bort odlingsmedium från cellerna och tillsätt 2 mL av förvärmd komplett medium innehållande 2 µg/mL functionalized nanobody per 35 mm maträtt eller 6-väl enhet.
  5. Inkubera cellerna för 1 h vid 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator att tillåta reporter-medierad nanobody upptag.
    Obs: Beroende på planerade experimentet behöver tiden för nanobody upptag justeras. För experimentet visas här, är 1 h tillräckligt för att nå steady state av nanobody upptag av andra-CDMPR och TfR-andra.
  6. Ta bort mediet och tvätta cellerna 2 - 3 gånger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  7. Fixa cellerna med 1 mL 3% paraformaldehyd (PFA) i 10 min på RT.
  8. Ta bort PFA lösning och släcka resterande fixativ med 1 mL 50 mM NH4Cl i 1 x PBS för 5 min på RT.
    Obs: 3% PFA skall kasseras separat som fixativ avfall.
  9. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  10. Permeabilize cellerna med 1 mL 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS för 10 min vid RT.
    Obs: Även om inga permeabilisering krävs, är andra och mCherry fluorescens bättre när efteråt cellerna är inbäddade i monteringsmedium.
  11. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  12. Placera coverslips med pincett på en droppe (~ 100 µL) av 1% BSA i 1 x PBS som innehåller 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol) för 5 min på RT.
  13. Placera coverslips tillbaka i skålen/brunnen och tvätta 3 gånger med 1 mL 1 x PBS på RT.
  14. Märka glasskivor och montera cellerna med Fluoromount-G. Låt den monteringsmedium harden i mörkret för 3-4 h och lagra glas glasen vid 4 ° C under ljus skydd.
  15. Bild färgning mönster med Mikroskop val (t.ex. punkt skanning Confocal upprätt Mikroskop).

6. upptag av Functionalized Nanobodies av odlade celler (för sulfatering analys)

  1. I en cell kultur huva, utsäde ~ 400.000 till 500.000 HeLa cells stabilt uttrycker ett GFP-märkta reporter protein i 35 mm rätter eller på 6-väl kluster med komplett medium innehållande antibiotika (Dulbeccos modifierade Eagle medium, DMEM, kompletterad med 10% fostrets kalv serum (FCS), 100 enheter/mL streptomycin, 2 mM l-glutamin och 1,5 µg/mL puromycin).
    Obs: Som nämnts ovan, använder vi här HeLa cells stabilt uttrycker andra-Calnexin, andra-CDMPR och TfR-andra i illustrationssyfte. Bortsett från stabil cellinjer, kan också övergående transfekterade HeLa användas.
  2. Inkubera cellerna O/N vid 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator föröka.
    Obs: Cellerna bör ha en konfluens ~ 80% nästa dag.
  3. Ta bort komplett medium, tvätta 2 gånger med 1 x PBS på RT och svälta cellerna med sulfatfria medium (SFM) för 1 h vid 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator.
    Obs: SFM bereds genom tillsats av 10 mL av MEM aminosyror (50 x) lösning, L-glutamin (200 mM), 5 mL vitamin lösning (100 x), och 900 µL av CaCl2·2H2O 5 mL till 500 mL örnens balanserad salter. Passera genom ett 0,22 µm filter och delprov.
  4. I en ventilerad huva eller bänk som utsetts för radioaktivitet arbete, förbereda sulfat märkning medium innehållande 0,5 mCi/mL [35S] sulfat som natriumsalt i SFM.
    Varning: Noggrant hantera alla lösningar som innehåller radioaktivitet. Fungera endast i utsedda huvar eller bänkar. Alla material (tips, rör, plattor, etc.) eller tvätta buffertar i kontakt med radioaktivitet måste samlas in och bortskaffas separat. Gör detta för alla stegen nedan (steg 6,5-6.20) samt.
  5. Tillsätt VHH-2xTS i 1 x PBS i sulfat märkning medium till en slutlig koncentration på 2 µg/mL.
    Obs: Som kontroll, även VHH-std eller en annan nanobody saknar TS platser för att påvisa specifik märkning.
  6. Ersätta SFM 0,7 ml av sulfat märkning medium innehållande 0,5 mCi/mL [35S] sulfat och 2 µg/mL VHH-2xTS och inkubera cellerna för 1 h vid 37 ° C i en 7,5% CO2 inkubator utsetts för arbete med radioaktivitet.
    Obs: Beroende på planerade experimentet behöver tiden för nanobody sulfatering justeras. Dessutom, för att avgöra TGN ankomst kinetik, utförs märkning för olika tidpunkter (t.ex. 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
  7. Ta bort märkning medium och tvätta cellerna 2 - 3 gånger med iskall 1 x PBS på en kyla plattan eller is.
  8. Tillsätt 1 mL lyseringsbuffert (PBS som innehåller 1% Triton x-100 och 0,5% deoxicholat) kompletteras med 2 mM PMSF och 1 x proteashämmare cocktail och inkubera cellerna för 10-15 min på en gungande plattform vid 4 ° C.
  9. Skrapa och överföra den lysate i ett 1,5 mL rör, vortex den lysate, och plats för 10-15 min på en över slut rotator vid 4 ° C.
  10. Förbereda en postnuclear lysate genom centrifugering vid 10 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
  11. Använda en ny 1,5 mL tub, förbereda 20-30 µL av en slurry av Nickel pärlor i en 1,5 mL tub och tvätta en gång med 1 x PBS av försiktigt pelletering dem vid 1 000 x g i 1 min.
    Obs: Istället för Nickel kan pärlor, streptividin pärlor (om nanobody är biotinylerade) eller protein A pärlor med en IgG mot en epitop av nanobody (T7 - eller HA-tag) användas.
  12. Överföra den postnuclear lysate i ett 1,5 mL rör som innehåller Nickel pärlor och inkubera i 1 h vid 4 ° C på en över slut rotator att isolera nanobodies. Ta bort en alikvot (50-100 µL) av den postnuclear lysate och koka i SDS prov buffert för efterföljande immunoblot analys av totala cell-associerade nanobody, GFP reporter och lastning kontroll.
  13. Tvätta pärlor 3 gånger med 1 x PBS eller Lys buffert genom att försiktigt pelletering vid 1 000 x g i 1 min.
    Obs: Strängare tvätt av pärlor, kan 20 mM Imidazol inkluderas i PBS eller Lys buffert.
  14. Försiktigt bort alla tvätt buffert från pärlorna, tillsätt 50 μl av 2 x provet buffert och koka i 5 min vid 95 ° C.
  15. Laddar både kokt pärlor på en midi 12,5% SDS-PAGE gel och kör enligt standardprotokollet sida referens färgen (t.ex. bromofenolblått) har kommit till slutet av Separerande gel.
    Obs: Immunoblot analys av totala cell-associerade nanobody, GFP reporter och lastning kontroll kan också utföras med hjälp av en mini 12,5% SDS-PAGE eller förtillverkade gradient gel.
  16. Fixa Separerande gelen i ~ 30 mL fixering buffert (10% ättiksyra och 45% metanol i ddH2O) för 1 h på RT, tvätta gel tre gånger med ~ 50 mL avjoniserat vatten och förbereda för gel torkning.
  17. Snabbtorkande SDS-PAGE geler.
    1. Noggrant placera fast gelen på sträckt plastfilm och täck den med färdigskurna filterpapper.
    2. Placera gelen med pappersfiltret ner ovanpå snabbtorkande plattformen, placera locket vakuum och slå på vakuumpumpen gel torkas. Torka gelen för 3-5 h.
    3. Ta bort plastfilm och placera torkade gelen i en autoradiografi kassett utrustad med en fosfor-skärm.
  18. Bild autoradiograph använder en fosfor skärmen Imager. Följ instruktionerna från tillverkaren.
    Obs: Beroende på styrkan på signalen, torkade geler behöver utsättas längre med Phosphor skärmar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att undersöka retrograd proteintransport till olika intracellulära destinationer, har vi nyligen etablerat ett anti-GFP nanobody-baserat verktyg för att märka och följ rekombinant fusionsproteinerna från cell surface30. Här visar vi bakteriell produktion av sådan derivatized nanobodies och demonstrera sin ansökan att studera endocytic upptag av fluorescensmikroskopi immunoblotting, samt deras användning att undersöka TGN ankomst genom sulfatering analys. Sistnämnda ansökan är metodologiska fokus i detta protokoll.

Vi har genererat en verktygslåda med olika functionalized anti-GFP nanobodies med gemensamma funktioner av standard molekylär kloning30. Vår enklaste (standard) nanobody, VHH-std, innehåller domänen VHH, en T7 och en HA epitop för efterföljande identifiering av specifika antikroppar, en carboxyterminal hexahistidine (His6)-tagg för rening och en biotin acceptor peptid (BAP) sekvens för biotinylation och hög affinitet streptividin nedrullningsbara experiment (figur 1A). Derivatisering VHH-STD ger olika nanobody varianter för att undersöka endocytic upptag och retrograd transport biokemiskt, genom fasta och levande cell imaging och elektronmikroskopi.

Att bedöma protein trafik från plasmamembranet till de trans-Golgi/TGN, vi drog fördel av den exklusiva lokaliseringen av tyrosylprotein sulfotransferaser i dessa avdelningar och därmed modifierad VHH-std med en tandem tyrosin sulfatering webbplats (2xTS) härrör från råtta procholecystokinin41. Medan ändring av VHH-std med mCherry tillåter direkt visualisering av retrograd transport av fasta och levande cell imaging, funktionalisering med ett peroxidas, såsom APEX237, möjliggör elektronmikroskopi studier, cytochemical fack ablation eller närhet-beroende biotinylation reaktioner. Införandet av en klyvning webbplats kan för tobaken etch virus (TEV) proteas dessutom biokemiskt skilja mellan intracellulära och surface-bundna nanobodies (figur 1A). Vi har tidigare använt VHH-tev för att övervaka endocytic återvinning kinetik av nanobody-bundna andra-CDMPR och TfR-andra30. Nanobody återkommer på cellytan efter upptag kunde bedömas helt enkelt genom att jaga med extracellularly tillämpad rekombinant TEV proteas orsakar en inverterad förlust av den nanobody carboxyterminal epitop kassett. Inklusive en klyvning webbplats i mCherry eller APEX2 nanobody fusion är användbart att studera återvinning kinetik av andra reportrar genom levande cell imaging på ett liknande sätt som VHH-tev eller att begränsa cytochemical reaktioner på intracellulär fack, respektive. Funktionalisering med andra protein domäner (t.ex. andra fluorophores eller enzymer) eller målet sekvenser för andra posttranslationell ändringar kan uppnås enkelt genom subkloning en respektive Infoga i plasmiden vektor kodning VHH-std (se även Tabell 1 plasmid information) med hjälp av tillgängliga SpeI och mina begränsning platser.

Använder protokollet enligt ovan, kan alla nanobodies illustreras här isoleras till hög renhet och avkastning (figur 1B). Endast mCherry fusioner visade mindre klippning av protein domäner efter rening (figur 1B, se körfält 7-8). I avsaknad av BirA uttryck fick vi normalt 25-35 mg VHH-std, VHH-2xTS och deras motsvarigheter i tev-modifierade, eller ~ 20 mg för VHH-APEX2 och VHH-mCherry och deras tev-innehållande derivat. Vår erfarenhet visar att BirA coexpression sänker nanobody avkastning med en tredjedel till hälften.

För att illustrera reporter-medierad nanobody upptag, har vi använt HeLa cellinjer stabilt uttrycker andra-Calnexin (CNX), andra-CDMPR och TfR-andra (figur 2A och B). ANDRA var fixerade till extracellulära/lumenal slutet av varje protein (dvs. mellan signal och reporter sekvensen av CNX eller CDMPR), och att carboxyterminus av TfR, lämnar de cytosoliska sortering signalerna obehindrad. Alla dessa andra-taggade last molekyler har olika intracellulära människohandel resvägar efter ER målgrupp. Eftersom andra-Calnexin bor i ER och normalt når inte post-Golgi fack, fungerar den som en negativ kontroll för potentiella och ospecifik nanobody upptag. Däremot både andra-CDMPR och TfR-andra har transport funktioner utöver Golgi och därmed visas stadigt på plasmamembranet. Som förväntat, när VHH-mCherry lades till en blandad befolkning av oförändrad HeLa och celler som stabilt uttrycker andra-CNX, kunde ingen nanobody internalisering observeras i båda fallen. Men både andra-CDMPR och TfR-andra fångas VHH-mCherry på cellytan och transporterade dem piggyback till reportern målsökande fack (figur 2 c).

VHH-mCherry colocalization bosatta TGN markör kan användas i princip för att bedöma TGN ankomst. Ändå, vi etablerat ett biochemical tillvägagångssätt baserat på tyrosin sulfatering. För att kunna utnyttja denna ändring inträffar i den trans-Golgi/TGN, nanobodies var functionalized med TS platser (figur 1A). För att demonstrera den specificitet och funktionalitet i dessa protein bindemedel, inkuberas vi oförändrade HeLa celler och celler som stabilt uttrycker andra-CNX, andra-CDMPR och TfR-andra med VHH-std eller VHH-2xTS för 1 h i närvaro av radioaktiva sulfat. Radiolabeling av VHH-2xTS uppstår endast när en reporter transporterar nanobody retrogradely till den TGN där det är utsatt till tyrosin sulfatering maskineriet. HeLa uttrycker andra-CNX och deras föräldrars celler visar ingen nanobody upptag och således ingen sulfatering. Både andra-CDMPR och TfR-andra internaliserade nanobodies, den senare betydligt mer än det förra. Dock bara andra-CDMPR orsakade VHH-2xTS att vara sulfaterade (figur 3A). Detta bekräftar effektiv retrograd transport av CDMPR från cellytan till TGN och ger bevis mot TfR återvänder till TGN (som har föreslagits i vissa studier42,43).

Kinetik av internalisering och TGN ankomsten av reporter proteiner kan också bestämmas genom att analysera cell lysates efter olika tider på nanobody upptag och sulfatering. Använda andra-CDMPR som reporter, Vi hittade sulfatering att starta förrän efter en fördröjning på ~ 15 min och nå mättnad efter > 75 min (figur 3B, körfält 1-6, och C, fyrkantig symboler). Upptag och sulfatering kinetik verkade skiftade med nästan 30 min, reflekterande transporten till TGN. Metoden ger dessutom, för att undersöka den sortering maskinen deltar i MPR transporter av farmakologiska störningar eller protein ljuddämpning metoder såsom knockdown, knockout eller knocksideways. Här, brukade vi brefeldin A (BFA), en hämmare av guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) av flera Arf GTPases, allmänt störa retrograd transport till TGN. När de behandlades med BFA, avskaffades sulfatering helt, medan upptag förblev opåverkad både i kinetik och i vilken utsträckning (figur 3B, körfält 7-12, och C, runda symboler).

Figure 1
Figur 1: Design och produktion av functionalized nanobodies för att spåra andra modifierade cell ytproteiner. (A) Schematisk bild av den derivatized nanobodies. Den standard nanobody består av GFP-specifika VHH domänen, T7 och HA epitop Taggar, en BAP och en hexahistidine (His6) rening tagg. Andra nanobodies omfattar dessutom två TSs, APEX2 eller mCherry, var med eller utan en klyvning webbplats för TEV proteas (tev). Skalstapeln är i aminosyror (aa). (B) uttryckt Bacterially och renade nanobodies (50 μg) var analyseras av gradient SDS-gel-elektrofores och fläckade Coomassie. Markör proteiner med molekylvikt i kDa visas till vänster. Endast VHH-mCherry och VHH-tev-mCherry visade minimal distorsion mellan VHH och mCherry domäner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: upptag och intracellulär lokalisering av VHH-mCherry av olika andra reporter proteiner. (A) Schematisk bild av andra fusionsproteinerna. Sekvenser som härrör från sekretoriska membranproteiner visas i svart med N-terminala signal peptider och interna transmembrana segment i gult, och andra illustreras i grönt. ANDRA var smält fullängds CDMPR, TfR och Calnexin (CNX). Skalstapeln i aminosyror (aa). ANDRA-CDMPR och TfR-andra har varit beskrivs30. (B) HeLa celler som stabilt uttrycker andra reporter proteiner skördats lyserat och analyseras av SDS-gel elektrofores och immunoblotting använder anti-GFP och anti aktin antikroppar. Molekylärt samlas i kDa anges till höger. (C) HeLa cells stabilt uttrycker den andra-taggade reporter proteiner blandades med föräldrarnas HeLa cells, inkuberas med 5 μg/mL VHH-mCherry (~ 100 nM) för 1 h vid 37 ° C och bearbetade för fluorescensmikroskopi. Skalstapeln = 10 μm. Upptag sker endast genom celler som uttrycker en reporter med andra utsatta på cellytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: sulfatering analys och kinetik retrograd transport till den TGN använda TS-taggade nanobodies. (A) Föräldrakontroll och HeLa celler som stabilt uttrycker andra modifierade reporter proteiner var märkt med 0,5 mCi/mL [35S] sulfate för 60 min med 2 μg/mL VHH-std eller VHH-2xTS. Nanobodies var isolerade med Nickel pärlor, åtskilda på en 12,5% SDS-PAGE följt av autoradiografi. Alikvoter av cell lysates samlades innan Nickel pull down och immunoblotted för cell-associerade nanobody (His6), andra och aktin. (B och C) HeLa cells stabilt uttrycker andra-CDMPR var märkt med 0,5 mCi/mL [35S] sulfate för upp till 75 min i närvaro av 2 μg/mL VHH-2xTS med och utan 2 μg/mL BFA före analys som i (A). Kvantitering av VHH-2xTS upptag och sulfatering från tre oberoende experiment visas i procent av värdet utan BFA efter 75 min (medelvärde och SD). Svarta rutor, utan BFA; grå cirklar, med BFA; Öppna symboler, upptag; fylld symboler, sulfatering. Denna siffra har modifierats och utökad från Buser et al., 2018, PNAS30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: proteinsekvenser av den functionalized nanobodies som visas i denna studie. T7 epitop i grått, VHH i svart, HA epitop i blå, BAP sekvens i orange, hexahistidine (His6) i röd, TEV proteas klyvning webbplats i lila, myc epitop i magenta, den tyrosin sulfatering sekvens i gult, APEX2 i grönt och mCherry i rosa. Uttryck vektorerna kodning dessa functionalized anti-GFP nanobodies har deponerats (se även tabell 1 plasmid information). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies representerar en framväxande klass av proteinet binder ställningar med många fördelar jämfört med konventionella antikroppar: de är små, stabil, monomer, kan väljas för hög affinitet och brist disulfide obligationer33,35, 44 , 45. de används i ett antal applikationer, såsom i cellsystem kultur och organismer i utvecklingsbiologi46,47,48,49, som kristallisering chaperones till stabilisera konfirmerande staterna i strukturbiologi50,51,52,53, som hämmare eller aktivitet modulatorer av enzymer54,55, 56, som immunhistokemisk reagenser för biokemiska analyser57eller som ”sekundär nanobodies” att upptäcka antimus och anti-kanin immunglobuliner på immunoblots och immunofluorescens58. I vår tidigare studie, har vi utvecklat och tillämpad functionalized nanobodies producerad av bakteriell uttryck till ytan-etikett proteiner och spåra deras intracellulära rutt till olika fack, i synnerhet till TGN30. Vi använde en anti-GFP nanobody att göra verktyget mångsidig, möjlighet till fusion målproteiner med extracellulära GFP, YFP eller mCerulean som kanske redan tillgängliga och kännetecknas. Modifiering av anti-GFP nanobodies med mCherry, APEX2 eller TS webbplatser som får oss att övervaka reporter upptag av fasta och levande cell imaging, till ultrastructurally visualisera retrograd transport fack, att avlägsna dessa avdelningar, eller att studera transport kinetik till TGN. En nackdel med vårt verktyg är att rekombinant ändring av målet cellinjer (stabilt uttryck eller endogena taggning) krävs innan functionalized anti-GFP nanobodies kan tillämpas. Funktionalisering kan naturligtvis tillämpas också på det snabbt ökande antalet nanobodies riktad mot otaggade endogena målproteiner som fastställts av animaliskt immunisering eller av Ribosomen-display och phage-display urval av syntetiska VHH bibliotek59. Använder nanobodies modifierad med TS platser (t.ex. VHH-2xTS), kan vi mäta direkt transport och kinetik av TGN ankomsten av olika andra modifierade målproteiner. Vi har tillämpat VHH-2xTS för att studera bidraget av adapter protein complex 1 (AP-1) i retrograd transport av MPRs av direkt kinetisk analys i knocksideways celler möjliggör snabb inaktivering av given transport maskiner30. Nanobody sulfatering och därmed retrograd transport av andra-märkt MPRs blockerades delvis, men inte helt. Våra nanobody-baserat tillvägagångssätt och använda sulfatering som TGN ankomst sensor bekräftade tidigare resultat från andra laboratorier som visar en funktionell bidrag för AP-1 i retrograd endosome-till-TGN transport17,60, 61. Sulfatable nanobodies kan således ge ett användbart biokemiska verktyg för att dissekera bidrag av andra retrograd transport maskinerier, såsom epsinR, Rab9/TIP47 eller SNX-BAR/retromer komplex, på last proteiner av genomiska, genetiska eller kemiska manipulationer. Det protokoll som presenteras här ger en grund för hur man kan göra användning av functionalized nanobodies i allmänhet att avgöra målet fack, vägar, och transport kinetics i odlade celler.

Andra grupper har redan utnyttjat TS platser att följa transport från cellen ytbehandlar till TGN. Ricin, Shiga eller kikhosta toxin subenheter ändrats tidigare med sulfatering platser att demonstrera en transportled genom den TGN62,63,64,65,66. Dessutom hade TS peptider också varit kemiskt kopplad till IgG till assay retrograd transport av GFP-CIMPR och endogena TGN46 till TGN67,68. Våra sulfatable nanobodies har fördelen av enkel och reproducerbara bakteriell produktion och en 1:1 stökiometri med Målproteinet. Tvärtom, det är till exempel välkänt att tvåvärda protein bindemedel, t ex IgG, kan crosslink cell ytproteiner och förändra deras intracellulära människohandel till lysosomer efter endocytos69,70, belyser den betydelsen av monomer protein bindemedel med avseende på befintliga metoder. Ett avgörande steg i vår teknik är att hantering med radioaktivitet är skyldig att utföra sulfat märkning av nanobodies. Vårt verktyg av functionalized nanobodies med TS platser att studera TGN ankomst får dock tillämpas potentiellt utan radioaktivitet med anti-sulfotyrosine antikroppar.

Vår tidigare studie antyder att nanobody sulfatering inte är mycket effektiv, eftersom sulfatering av MPRs inte hade ännu nått maximalt efter 75 min, även om nanobody upptag var mättad efter 45 min30. Screening för andra naturområden TS kan förbättra sulfatering. Alternativt, för att eventuellt förbättra sulfatering effektivitet, komponenter av sulfatering maskiner själv, såsom TPST1 och TPST2, kan vara i ökad utsträckning. Faktiskt, det har tidigare visat att överuttryck av transportörerna att leverera 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (LIKALEDES), substrat för TPSTs, från cytosolen till lumen av Golgi kunde ändra statusen sulfatering av proteoglykaner 71.

Förutom sulfatable nanobodies tillåta andra derivatizations också spårning transport genom endocytic fack och till TGN. APEX2 kan tillämpas som en promiskuös märkning enzym för närhet-beroende biotinylation för proteomiska analys av retrograd transport. APEX2 nanobody som är internaliserad av en last reporter av intresse kommer märka proteiner i närheten inom delar av målet. Jämförande proteomik bör tillåta för att identifiera andra endogena proteiner i olika typer av endosomes och den TGN som nanobody har åtkomst till. Många varianter av nanobodies i kombination med dess Målproteinet är tänkbara. En färsk rapport, till exempel tillämpas en inverterad strategi som den som beskrivs här: derivatized GFP användes för att studera och fälla cellularly uttryckt anti-GFP nanobody-taggade vakuolär sortering receptorer i anterograd och retrograd fack av anläggningen endomembrane system72. Likaså kan functionalized nanobody-fällor utformas i däggdjursceller kultur system för att fånga och samla andra modifierade reportrar i olika fack under retrograd transport.

Vår här presenteras metod och protokollet med fokus på TS webbplats-taggade nanobodies möjliggör kvantitativa och kvalitativa spårning av last proteiner från cellytan till endocytic fack och TGN hos odlade däggdjursceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Grant 31003A-162643 av den schweiziska National Science Foundation. Vi tackar Nicole Beuret och Basels Imaging Core Facility (IMCF) för support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

Immunologi och infektion fråga 144 nanobodies retrograd transport Golgi komplexet tyrosin sulfatering bakteriell uttryck radiolabeling andra HeLa celler
Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter