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Biochemistry

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

Introduction

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.

직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.

이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

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Protocol

1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies

참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다.

  1. 해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에 그들을 배치 하 여.
    참고: Chemocompetent 표준 실험실 절차에 따라 세균 셀을 준비 합니다. 또한, 화학적으로 유능한 세균성 세포는 상업적으로 구입할 수 있습니다.
  2. 추가 50 기능성된 nanobodies 인코딩 플라스 미드의 ng. 충분 한 사이트 biotinylation nanobody 기자의 세균성 식 중, 또한 추가 삼 배 초과 (150 ng) 인코딩 biotin 리가 BirA 세균성 식 플라스 미드의 (참조 표 1 플라스 미드 정보). 부드럽게 피펫으로 위쪽 및 아래쪽입니다.
    참고: Nanobody biotinylation는 필요 하지 않습니다 또는 nanobody 기자 biotin 수락자 펩 티 드 (BAP) 없는, 인코딩 BirA 플라스 미드와 공동 변환 필요 하지 않습니다.
  3. 얼음에 30 분 동안 세균성 세포를 품 어.
  4. 열 물 목욕 또는 열 블록에 42 ° C에서 1 분 동안 그들을 배치 하 여 세균성 세포를 충격.
  5. 실내 온도 (RT)의 1 mL을 추가 Luria 국물 (파운드) 매체와 저항 유전자의 phenotypic 표정 있도록 37 ° C에서 1 시간에 대 한 thermoshaker에서 변형 된 박테리아를 품 어. 1 L 파운드 준비 중간, 균형의 효 모 5 g, 추출 10 g tryptone의 10 g의 NaCl, 물으로 채워 및 압력가 마로 소독 하 여 소독. 기능성된 nanobody 암 피 실린/carbenicillin에 저항을 포함 하는 식 벡터에 subcloned 되었습니다, 단계 1.5를 생략할 수 있습니다.
  6. 11000 x g 1 분 동안에 박테리아를 작은 고 신선한 파운드 매체의 100 µ L에서 resuspend.
  7. (예:,)와 함께 50 µ g/mL 대 50 µ g/mL carbenicillin 박테리아 (1.2 단계) 위에 말한 대로 공동 BirA nanobody 기자와 변형 되었을 때 각각 항생제를 포함 하는 파운드 플레이트에 일시 중단 된 박테리아 접시
  8. 37 ° C에서 인큐베이터에서 파운드 접시를 놓고 성장 하자 하룻밤 (O/N).
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 4 ° c.에 성장된 식민지와 파운드 플레이트를 저장 하 여 Parafilm를 사용 하 여 파운드 접시를 봉인.

2. 세균성 액체 문화 및 기능성된 Nanobody 식의 유도

  1. 접시에서 벡터를 포함 하는 세균성 식민지를 선택 하 고 포함 된 항생제 O/N 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 보충 파운드 매체 20 mL 플라스 크에 성장 하자 (선택 항생제에 관한 1.7 단계 참조).
  2. 다음 날, 선택 항생제로 파운드 매체의 1 L를 포함 하는 플라스 크에 성장된 20 mL 세균성 문화를 희석.
  3. 계속 그것은 0.6-0.7의600 세 도달할 때까지 37 ° C에서 세균성 문화를 품 어. 유도 하는 단백질 식 전에 rt 진정 문화를 허용 한다.
  4. 유도 1 M 이소프로필-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) 유도 (1:1, 000 희석)의 1 m m의 최종 농도에 1 mL의 추가 의해 공업화 nanobodies 및 BirA 단백질 표정. 또한 BAP epitope 기능성된 nanobodies (참조 표 1 플라스 미드 정보)에의 biotinylation 수 있도록 성장 매체에서 200 µ M d-biotin 결과 20 m m d biotin 재고 솔루션의 10 mL를 추가하시오
    참고: D-biotin 재고 솔루션 ddH2O에서에서 준비 하 고 500 mM NaH2포4의 drop-wise 추가 솔루션으로 가져온. 또는 d biotin 또한 DMSO에 녹아 수 있습니다. Nanobodies APEX2 융합 생산 (VHH-APEX2), LB 매체 1 m m 5-aminolevulinic 산 (달라) 염 헤 법인 홍보와 또한 보완 해야 합니다. 달라는 ddH2o. 100 m m 재고 솔루션으로 준비
  5. IPTG 유도 1 L 세균성 문화 VHH 2xTS 4 h 30 ° C, 20 ° C 또는 RT O/N VHH-APEX2, 또는 16 품 어 ° C O/N VHH mCherry (참조 표 1 플라스 미드 정보).
    참고: 새로운 nanobody 구문 식 조건에서 실험에 의해 낙관 되어야 한다.
  6. 1 L 원심 병에 플라스 크에서 세균성 문화를 전달 하 고 45 분 Decant는 상쾌한 4 ° C에서 5000 x g 에서 셀 작은 정화를 계속.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기 무기한-80 ° C에서 세균성 펠 렛을 저장 하 여. VHH APEX2 또는 VHH mCherry 펠 릿은 일반적으로 (때문에 법인된 헤) 갈색 또는 분홍색, 각각.

3입니다. 기능성된 Nanobodies의 정화

  1. 필요한 경우 녹여 얼음에 냉동된 세균 펠 릿 (단계 2.6 참조).
  2. 세균성 세포 pellet을 30 mL의 얼음 처럼 차가운 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 resuspend. 레이블이 지정 된 50 mL 튜브에 resuspended 박테리아를 전송 합니다.
  3. 30 mL 바인딩 나, 1 mM MgCl2 와 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 200 µ g/mL lysozyme, 20 µ g/mL DNase 버퍼링 하 고 RT에서 10 분 동안 처음 그리고 끝 이상 통에 4 ° C에서 1 시간을 품 어 보충.
  4. 기계적으로 팁 sonicator는 서 스 펜 션에 배치 하 여 50 mL 튜브에 세균성 세포를 lyse. 일정 3 x 1 분 펄스 1 분 냉각 기간 사이 함께 적용 합니다.
  5. 45 분 작은 파편과 그대로 셀 4 ° C에서 15000 x g 에서 lysate 박테리아 원심 원심 분리에 대 한 적절 한 원심 병으로 하나 sonicated 세균성 세포 lysate를 전송 하거나은 lysate 탁상 원심 분리에 대 한 여러 5 mL 튜브로.
  6. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 수송과 파편을 삭제.
  7. 삭제 저장 lysate 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 정화를 준비 하는 동안 얼음에. 기능성된 nanobodies 히스티딘 태그를 격리 하려면 고용 단일 사용 ( 재료의 표참조) 그의 열 수 있도록 신속 하 고 간단한 중력 흐름 정화.
    참고: 또는 상업 열 대신 일괄 처리 정화는 또한 사용 될 수 있습니다.
  8. 그의 열 금속 스탠드에 장착.
    1. 열 스토리지 솔루션을 테이퍼 하 고 그의 equilibrate 열 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)의 10 mL와 함께.
    2. (흐름을 통해 삭제 될 수 있습니다) 중력 흐름에 의해 빈.
  9. 점차적으로 허가 세균성 lysate (~ 30 mL) 열에 로드 합니다. (흐름을 통해 삭제 될 수 있습니다) 중력 흐름에 의해 빈.
  10. 그의 씻어 열 2 바인딩 버퍼 (1 x PBS에 이미 20 m m)의 10 mL x.
  11. 2 mL 튜브에 차입 버퍼 (1 x PBS에 이미 500 m m)의 2 개 mL와 nanobodies을 elute 고 버퍼 교환 적용 합니다.
  12. 버퍼 교환입니다.
    1. Equilibrate는 담 열 5 번과 1 x PBS의 5 mL 50 mL 튜브 열 어댑터에 배치 ( 재료의 표참조).
    2. 버퍼 층을 입력을 허용 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    3. 다섯 번째 PBS 평형 후 1000 x g 2 분 동안에 열을 회전 합니다.
    4. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    5. 새로운 50 mL 튜브에 어댑터와 열을 배치 합니다. 2 mL PBS equilibrated 염 열에 2 분 동안 1000 x g 에서 스핀 (3.11 단계)에서 eluted 기능성된 nanobody의 로드와 eluate 수집 합니다.
      참고: 상업적인 염 열 대신 투 석 교환 버퍼 구성에 적용할 수 있습니다.
  13. Bicinchoninic (BCA) 또는 제조업체의 지침에 따라 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 eluate의 단백질 (nanobody) 농도 결정 합니다.
    참고: Nanobody GFP 기자 셀 라인에 의해 이해 분석 실험, 2-10 mg/mL의 농도 재고 최적입니다.

4. 기능성된 Nanobody 식 (Coomassie 얼룩)의 유효성 검사

  1. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 따라 표준 프로토콜에 대 한 10-12.5% 젤을 준비 합니다.
    참고: 또는 상용 부품된 그라데이션 젤 사용.
  2. 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 버퍼에 종으로 정화 기능성된 nanobody의 피펫으로 20 µ g.
    참고: 예를 들어, 2 x 샘플 버퍼의 10 µ L 1.5 mL 튜브에 2 mg/mL nanobody 재고 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다. 볼륨이 너무 작은 경우에, 견본 버퍼를 추가 하기 전에 nanobody PBS에 희석 추가.
  3. SDS polyacrylamide 젤에 샘플 버퍼에 삶은 순화 nanobody을 로드 하 고 참조 염료 (예를 들어, bromophenol 블루) Coomassie 얼룩 다음, 분리 젤의 끝에 도달 했습니다 때까지 표준 페이지 프로토콜에 따라 실행 하 고 destaining.
  4. Coomassie 젤 얼룩 및 Destaining입니다.
    1. Uncast 젤 하 고 움직이는 떨고 플랫폼에 RT에서 20-30 분 Coomassie 얼룩 솔루션 (10 g/L ddH2O 10% 초 산 및 45% 메탄올에서 Coomassie 재고 솔루션의 5%)으로 얼룩. 젤 얼룩 솔루션에 완전히 처리 되어야 합니다.
    2. Destain 젤 번 2-3와 destain 솔루션 (7.5% 아세트산 및 15% 메탄올 ddH2O) RT에 각 1 시간 추가 destaining 젤 O/N 떠나기 전에.
      참고: 초과 Coomassie 수 수 효율적으로 젖 었 젤 주위 부엌 종이 타 올을 배치 하 여.
  5. 이미지 영상 또는 카메라 선택의 젤.
    참고: Nanobody 식 immunoblot 분석의 epitopes를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 ( 그림 1A참조)에 의해 더 확인 수 있습니다.

5. 형광 착 색에 대 한 경작된 한 세포에 의해 공업화 Nanobodies의 이해

  1. 셀 문화 후드, 씨 ~ 400000 500000 HeLa 세포 안정적으로 항생제 (Dulbecco의 수정이 글 매체, DMEM 포함 하는 완전 한 매체와 18 m m 유리 coverslips (제 1.5 H) 35 m m 요리 또는 6-잘 클러스터에 GFP 태그 기자 단백질을 표현 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 단위/mL 스, 2 m m l-글루타민, 및 1.5 µ g/mL puromycin 보충).
    참고: 여기, 우리는 안정적으로 표현 EGFP Calnexin, EGFP CDMPR TfR EGFP 용도로 HeLa 세포를 사용 합니다. 안정적인 셀 라인, 외도 뚜렷이 transfected HeLa 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 셀 라인 공동 부모의 비 불리고 HeLa 세포와, 직접 비교를 위해이 단계에서 재배 하실 수 있습니다.
  2. 셀 O/N 37 ° c에 7.5% CO2 배양 기에서 품 어.
    참고: 셀 ~ 80%의 confluency 다음날 있어야 합니다.
  3. 피펫으로 2 µ L의 완전 한 중간의 2 개 mL를 포함 하는 15 또는 50 mL 튜브에 2 mg/mL nanobody 재고 솔루션 (이 볼륨은 35mm 접시 또는 6-잘 클러스터의 한 잘 커버, 매체와 비례적으로 더 많은 셀 문화 d를 포함 하는 nanobody의 볼륨을 조정 하기에 충분 ishes 또는 클러스터)입니다.
    참고: 그림을 위해 우리가 여기 VHH-mCherry, 이후 추가 항 체 얼룩이 지 EGFP 기자 ( 그림 2C참조)에 의해 내 면 nanobody를 참조 하는 데 필요한 사용 합니다.
  4. 세포에서 성장 매체를 제거 하 고 35 m m 접시 또는 6-잘 단위 당 2 µ g/mL 기능성된 nanobody를 포함 하는 prewarmed 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
  5. 기자 중재 nanobody 통풍 관을 허용 하도록 7.5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어.
    참고: 계획 된 실험에 따라 nanobody 통풍 관의 시간 조정 될 필요가 있다. 여기에 표시 된 실험에 대 한 1 시간 EGFP CDMPR와 TfR EGFP nanobody 통풍 관의 정상을 도달 하기 충분 하다.
  6. 매체를 제거 하 고 2-3 시간에 실시간 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  7. 실시간에서 10 분 동안 3 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL와 함께 셀 수정
  8. PFA 솔루션을 제거 하 고 50mm NH41 x PBS 실시간에 5 분 동안에 Cl의 1 mL와 함께 잔여 정착 액을 끄다
    참고: 3 %PFA 별도로 통 쓰레기의 폐기 해야 합니다.
  9. 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  10. 0.1%의 1 mL로 세포를 permeabilize 실시간에 10 분의 1 x PBS에 트라이 톤 X-100
    참고: 없다 permeabilization 필요 하지만 EGFP 및 mCherry 형광 때 더 나은 이후에 셀 설치 매체에 포함 됩니다.
  11. 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척
  12. 실시간에서 5 분 동안 5 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)를 포함 하는 1 x PBS에서 1 %BSA 드롭 (~ 100 µ L)에 집게와는 coverslips 배치
  13. 다시 접시/우물에는 coverslips을 놓고 3 번 실시간에 1 x PBS의 1 mL로 씻어
  14. 유리 슬라이드 레이블 및 Fluoromount-G. 셀 탑재 장착 매체 3-4 h에 대 한 어둠 속에서 강화 하 고 가벼운 보호에서 4 ° C에서 유리 슬라이드를 저장 하자.
  15. 이미지 패턴 선택 (예: 포인트 검사 Confocal 똑바로 현미경)의 현미경을 사용 하 여 얼룩.

6. (Sulfation 분석)에 대 한 경작된 한 세포에 의해 공업화 Nanobodies의 이해

  1. 셀 문화 후드에서 씨 ~ 400000 500000 HeLa 세포 안정적으로 35mm 요리에서 또는 완전 한 중간 포함 항생제 (Dulbecco의 수정이 글 매체, 10% 태아 종 아리 보충 DMEM 6 잘 클러스터에 GFP 태그 기자 단백질을 표현 혈 청 (FCS), 100 단위/mL 스, 2 m m l-글루타민, 그리고 puromycin 1.5 µ g/mL).
    참고: 위에서 설명 했 듯이, 여기 HeLa 세포 안정적으로 표현 EGFP Calnexin, EGFP CDMPR TfR EGFP 용도로 사용 합니다. 안정적인 셀 라인, 외도 뚜렷이 transfected 헬러를 사용할 수 있습니다.
  2. 셀 O/N 37 ° c에 7.5% CO2 배양 기에서 품 어.
    참고: 셀 ~ 80% 다음 날의 confluency가 있어야 합니다.
  3. 완전 한 매체를 제거 하 고 RT에 1 x PBS로 2 회 세척 한 7.5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 황산 무료 매체 (SFM)와 셀을 굶 어.
    참고: SFM은 MEM 아미노산 (50 x) 솔루션, L-글루타민 (200 mM), 비타민 솔루션 (100 x)의 5 mL 및 CaCl2·2H2O의 900 µ L의 5 mL의 10 mL 500 mL이 글의 균형된 염을 추가 하 여 준비가 되어 있습니다. 0.22 μ m 필터와 약 수를 통해 전달 합니다.
  4. 통풍된 후드 또는 벤치 방사능 작업에 대 한 지정, 황산 0.5 mCi/mL [35S] 황산 나트륨 소금 SFM에 포함 하는 매체 라벨을 준비 합니다.
    주의: 신중 하 게 처리 하는 방사능을 포함 하는 모든 솔루션. 지정 된 후드 또는 벤치에만 작동 합니다. 모든 재료 (팁, 튜브, 접시, 등) 또는 방사능 접촉 워시 버퍼 수집을 별도로 처리 해야. 이렇게 모든 단계 (단계 6.5-6.20) 아래도.
  5. 황산 2 µ g/mL의 최종 농도에 매체를 라벨에 1 x PBS에서 VHH-2xTS를 추가 합니다.
    참고: 제어, VHH 성병 또는 다른 nanobody TS 사이트 없는 특정 라벨 설명 포함.
  6. 황산 중간 포함 0.5 mCi/mL [35S] 황산 및 2 µ g/mL VHH 2xTS 라벨의 0.7 mL에 의해 SFM을 장착 하 고 방사능 작업에 대 한 지정 7.5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어.
    참고: 계획 된 실험에 따라 nanobody sulfation 시간 조정 될 필요가 있다. 또한, TGN 도착 속도 론을 확인 하려면 라벨 수행 됩니다 (예: 10 분, 20 분, 30 분, 등) 서로 다른 시간에 대 한.
  7. 라벨 매체를 제거 하 고 2-3 시간 냉각 플레이트 또는 얼음 얼음 1 x PBS 가진 세포를 씻어.
  8. 세포의 용 해 버퍼 (PBS 포함 1% 트라이 톤 X-100 및 0.5 %deoxycholate) 2 밀리미터 PMSF와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1 보충의 1 mL을 추가 하 고 10-15 분 4 ° c.에 락 플랫폼에 대 한 셀을 품 어
  9. 긁어 1.5 mL 튜브, lysate, 소용돌이로 lysate 전송 및 4 ° c.에 이상 끝 회전에 10-15 분을 위한 장소
  10. 준비는 postnuclear에서 10000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 lysate
  11. 새로운 1.5 mL 튜브를 사용 하 여, 1.5 mL 튜브에 니켈 구슬의 슬러리의 20-30 µ L를 준비 하 고 부드럽게 1000 x g 1 분 동안에 그들을 산으로 1 x PBS로 한 번 씻어.
    참고: 니켈 대신 구슬, streptavidin 구슬 (nanobody biotinylated 경우) 또는 nanobody (T7-또는 HA-태그)의 피토 프에 대 한 IgG과 단백질 A 구슬 사용할 수 있습니다.
  12. postnuclear 전송 lysate 1.5 mL 튜브에 포함 된 니켈 구슬과는 nanobodies를 분리 하는 이상 끝 회전에 4 ° C에서 1 시간에 품 어. 약 수 (50-100 µ L)는 postnuclear의 lysate를 제거 하 고 총 셀 관련 nanobody, GFP 기자와 컨트롤을 로드의 후속 immunoblot 분석에 대 한 SDS 샘플 버퍼에 종 기.
  13. 부드럽게 1000 x g 1 분 동안에 산에 의해 3 회 PBS 또는 세포의 용 해 버퍼 x 1와 구슬을 씻어.
    참고: 구슬의 더 엄격한 세척에 대 한 20 mM 이미 PBS 또는 세포의 용 해 버퍼에 포함할 수 있습니다.
  14. 조심 스럽게 구슬에서 모든 세척 버퍼를 제거, 샘플 버퍼, x 2의 50 µ L을 추가 하 고, 95 ° c.에 5 분 삶아
  15. 부하 두 삶은 midi에 구슬 12.5 %SDS 페이지 젤과 참조 염료 (예를 들어, 블루 bromophenol) 분리 젤의 끝에 도달 했습니다 때까지 표준 페이지 프로토콜에 따라 실행 합니다.
    참고: 총 셀 관련 nanobody, GFP 기자 및 컨트롤 로드 Immunoblot 분석 또한 수행할 수 있습니다 미니 12.5%를 사용 하 여 SDS 페이지 또는 캐스트 그라데이션 젤.
  16. 분리 젤 고정 버퍼 (10% 초 산 및 45% 메탄올 ddH2O) RT에 1 시간 ~ 30 mL에 수정, 3 번 ~ 50 mL의 이온된 수와 젤을 세척 하 고 젤 건조에 대 한 준비.
  17. SDS 페이지 젤을 건조.
    1. 조심 스럽게 고정된 젤 뻗어 집착 필름에 놓고 규격에 맞게 자르는 필터 종이 함께 그것을 커버 합니다.
    2. 필터 종이 젤 아래로 건조 플랫폼 위에, 진공 커버 장소 놓고 젤 건조 진공 펌프에 전환 합니다. 3-5 h를 위한 젤을 건조.
    3. 집착 영화를 제거 고 말린된 젤 인광 체 스크린 autoradiography 카세트 합니다.
  18. 이미지 autoradiograph 인광 체 스크린 영상 장치를 사용 하 여입니다. 제조업체의 지침을 따릅니다.
    참고: 신호 강도 따라 인광 체 스크린 이상 노출 될 필요가 젤을 건조.

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Representative Results

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보여 보여 줍니다. 후자의 응용 프로그램은이 프로토콜의 방법론 초점.

우리는 표준 분자 복제30일반적인 기능을 가진 다른 공업화 안티-GFP nanobodies의 도구 상자를 생성. 우리의 간단한 (표준) nanobody, VHH-성병, VHH 도메인, 포함 한 T7 후속 검색 하 epitope 특정 항 체, carboxyterminal hexahistidine (His6)에 의해-정화, 그리고에 biotin 수락자 펩 티 드 (BAP) 시퀀스에 대 한 태그 biotinylation 및 높은 선호도 streptavidin 풀 다운 실험 (그림 1A). Derivatization VHH 성병의 고정 및 라이브 셀 이미징 및 전자 현미경에 의해 화학적, endocytic 통풍 관 및 역행 검사을 다른 nanobody 이체를 생성 합니다.

Trans Golgi에 플라즈마 막에서 단백질 트래픽을 평가/TGN, 우리가 이러한 구획에 tyrosylprotein sulfotransferases의 독점적인 지역화의 이용 했다 하 고 따라서 수정 VHH 성병 파생 탠덤 티로신 sulfation 사이트 (2xTS) 쥐 procholecystokinin41. MCherry와 수정 VHH 성병의 고정 및 라이브 셀 이미징,37, APEX2 같은 과산화 효소와 기능화에 의해 역행 수송의 직접적인 시각화 수 있습니다 전자 현미경 연구를, cytochemical 구획 절제, 또는 근접 종속 biotinylation 반응입니다. 또한, 분열 사이트의 삽입 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소에 대 한 수 있습니다 화학적 세포와 표면 바인딩된 nanobodies (그림 1A)를 구분 하. 이전 VHH tev nanobody 바인딩된 EGFP CDMPR TfR EGFP30의 endocytic 재활용 활동을 모니터링 하는 데 사용 했습니다. 통풍 관 후 세포 표면에 Nanobody 재현 extracellularly 적용된 재조합 TEV 프로 테아 제 nanobody의 carboxyterminal epitope 카세트의 역 손실의 원인이 함께 추격 하 여 간단 하 게 사정 될 수 있습니다. VHH tev에 유사한 방법으로 라이브 셀 이미징에 의해 EGFP 기자 들의 재활용 활동 공부를 하거나 세포내 구획, cytochemical 반응을 각각 제한 하 유용 mCherry 또는 APEX2 nanobody 융해에서 분열 사이트를 포함 합니다. 다른 단백질 도메인 (예: 다른 fluorophores 또는 효소) 또는 대상 시퀀스와 기능화에 다른 posttranslational 수정 플라스 미드에 각각 삽입 subcloning 의해 쉽게 달성 될 수 있다 벡터 인코딩 VHH-성병 (참고 표 1 플라스 미드 정보에 대 한) 사용할 수 있는 SpeI와 EcoRI 금지 사이트를 사용 하 여.

위에서 설명한 대로 프로토콜을 사용 하 여, 여기에 설명 된 모든 nanobodies 높은 순도 수율 (그림 1B)에 격리 수 있습니다. 만 mCherry 융해 단백질 도메인의 사소한 클리핑 보였다 게시 정화 (그림 1B, 레인 7-8 참조). BirA 식의 부재, 우리 일반적으로 얻은 VHH 성병, VHH 2xTS 및 그들의 tev 수정 대응, 25-35 mg 이나 ~ 20 mg VHH APEX2 VHH mCherry 및 그들의 tev 포함 된 파생 상품. 우리의 경험은 BirA coexpression 반에 세 번째에 의해 nanobody 수익률을 낮추고 보여줍니다.

기자-중재 nanobody 통풍 관을 설명 하기 위해 안정적 EGFP Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR, 및 TfR EGFP (그림 2A , B)를 표현 하는 HeLa 세포 라인을 사용 해 왔다. EGFP cytosolic 정렬 신호 가리지 떠나 TfR의 carboxyterminus를 (즉, 사이 신호 및 기자 시퀀스 CNX 또는 CDMPR), 각 단백질의 extracellular/lumenal 끝을 융합 했다. 모두 이러한 EGFP 태그 화물 분자 응급실 타겟팅 후 다른 세포내 매매 일정을 있다. EGFP Calnexin 응급실에는 있기 때문에 일반적으로 게시물 Golgi 구획에 도달 하지 않습니다, 그것은 잠재력과 일반적인 nanobody 통풍 관에 대 한 부정적인 제어 역할. 반면, EGFP CDMPR와 TfR EGFP는 골 넘어 전송 기능을 따라서 꾸준히에 원형질 막. 으로 예상, VHH mCherry는 수정 되지 않은 헬러 EGFP CNX 안정적으로 표현 하는 셀의 혼합된 인구에 추가 될 때 어느 경우에 든 아무 nanobody 국제화 관찰 수 있었다. 그러나, EGFP CDMPR와 TfR EGFP VHH mCherry 세포 표면에서 캡처하고 피기백 기자의 귀환 구획 (그림 2C)에 그들을 수송 합니다.

주민 TGN 표시와 함께 VHH mCherry colocalization TGN 도착을 평가 하기 위해 원칙적으로 사용 될 수 있습니다. 그러나, 티로신 sulfation에 따라 생 화 확 적인 접근을 설립 했습니다. 트랜스-골에 발생 하는이 수정 사용 하기 위해/TGN, nanobodies은 공업화와 TS 사이트 (그림 1A). 이러한 단백질 바인더의 기능과 특이성을 보여 우리 incubated 수정된 HeLa 세포와 세포 안정적으로 표현 EGFP CNX, EGFP CDMPR VHH std 또는 VHH 2xTS TfR EGFP 방사성 황산 존재 1 h. Radiolabeling VHH 2xTS의만 발생 할 때 기자 수송 TGN 티로신 sulfation 기계에 노출 어디에 retrogradely nanobody. 헬러 EGFP CNX와 그들의 부모의 세포 표시 없음 nanobody 통풍 관 및 따라서 없습니다 sulfation. EGFP CDMPR와 TfR EGFP 내 면 nanobodies, 후자 상당히 더 이전 보다. 그럼에도 불구 하 고, 유일한 EGFP-CDMPR VHH-2xTS sulfated 수를 발생 (그림 3A). 이 TGN에 세포 표면에서 CDMPR의 효율적인 역행 교통을 확인 하 고 TfR (로 일부 연구42,43제안 하고있다)는 TGN에 반환에 대 한 증거를 제공 합니다.

국제화의 활동 및 TGN 도착 기자 단백질의 세포 lysates의 nanobody 통풍 관 및 sulfation 다른 시간 후 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 sulfation ~ 15 분의 지연 기간 후에 시작 하 고 채도 도달 하는 발견 EGFP-CDMPR를 사용 하 여 기자로 서, 후에 > 75 분 (그림 3B, 레인 1-6, 및 C, 사각형 기호). 통풍 관 및 sulfation 속도 론 출연 거의 30 분, 반영 된 TGN에 전송 하 여 이동. 또한, 메서드는 정렬 기계 약리 간섭 또는 단백질 최저, 녹아웃, 또는 knocksideways와 같은 접근을 입을 MPR 전송에 관련 된 조사를 수 있습니다. 여기, 우리는 일반적으로 TGN에 역행 수송을 방해 하 brefeldin A (BFA), 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (조달) 여러 Arf GTPases의 억제제를 사용. BFA로 치료 하면 sulfation 이해 속도 범위 (그림 3B, 레인 7-12, 및 C, 라운드 기호)에 영향을 받지 동안 완전히 폐지 되었다.

Figure 1
그림 1: EGFP 수정 세포 표면 단백질을 추적 하는 디자인과 기능성된 nanobodies의 생산. (A) derivatized nanobodies의 도식 적인 표현입니다. GFP 특정 VHH 도메인, T7 및 하 피토 프 태그, BAP, 및 hexahistidine (His6) 정화 태그 표준 nanobody에 의하여 이루어져 있다. 다른 nanobodies에는 또한 두 TSs, APEX2, 또는 mCherry, 각각 TEV 프로 테아 제 (tev)에 대 한 분열 사이트 없이 구성 됩니다. 눈금 막대는 아미노산 (aa)에 있다. (B) Bacterially 표현 그리고 순화 nanobodies (50 μ g) 그라데이션 SDS 젤 전기 이동 법에 의해 분석 Coomassie 물 했다. KDa에 분자 질량을 가진 마커 단백질은 왼쪽에 표시 됩니다. VHH mCherry 및 VHH tev mCherry는 VHH와 mCherry 도메인 간의 최소한의 클리핑을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 통풍 관 및 다른 EGFP 기자 단백질에 의해 세포내 국산화 VHH-mCherry. (A) EGFP 융해 단백질의 도식 적인 표현입니다. 분 비 막 단백질에서 파생 시퀀스 블랙 N 맨끝 신호 펩 티 드와 노란색, 내부 막 횡단 세그먼트에에서 표시 되 고 EGFP 그린에서 그림입니다. EGFP 전체 길이 CDMPR, TfR, 및 Calnexin (CNX)를 융합 했다. 스케일 바 아미노산 (aa)입니다. EGFP CDMPR와 TfR EGFP 설명된30되었습니다. (B) 헬러 세포 안정적 EGFP 기자 단백질을 표현 했다 수확 lysed, 그리고 SDS 젤 전기 이동 법 및 immunoblotting 안티-GFP와 반대로 말라 항 체를 사용 하 여 분석. KDa의 분자 질량은 오른쪽에 표시 됩니다. (C) 헬러 세포 단백질 5 μ g/mL VHH mCherry와 incubated 부모의 HeLa 세포와 혼합 했다 EGFP 태그 기자를 안정적으로 표현 (~ 100 nM) 37 ° C에서 h와 형광 현미경 검사 법에 대 한 처리 1. 눈금 막대 = 10 μ m. 글귀만 EGFP 세포 표면에 노출 된 기자를 표현 하는 세포에 의해 발생 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Sulfation 분석 및 TS 태그 nanobodies를 사용 하 여 TGN에 역행 수송의 활동. (A) 자녀 보호 및 HeLa 세포 단백질 2 μ g/mL VHH std 또는 VHH 2xTS 60 분 0.5 mCi/mL [35S] 황산을 사용 하 여 표시 했다 EGFP 수정 기자를 안정적으로 표현. Nanobodies 니켈 구슬, autoradiography 구분 12.5 %SDS 페이지 뒤에 사용 하 여 격리 했다. Aliquots 세포 lysates의 니켈 풀 다운 셀 관련 nanobody (His6), EGFP, 및 말라 immunoblotted 전에 수집 했다. (B 와 C) 안정적 EGFP CDMPR을 표현 하는 HeLa 세포 2 μ g/mL VHH 2xTS와 2 μ g/mL BFA (A)와 같이 분석 전에 없이 존재 최대 75 분 0.5 mCi/mL [35S] 황산으로 표시 했다. 정량의 VHH 2xTS 통풍 관 및 3 개의 독립적인 실험에서 sulfation 75 분 (평균 및 SD) 후 BFA 없이 값의 %에 표시 됩니다. BFA; 없이 검은 사각형 회색 동그라미, 졸업; 기호, 열 통풍 관; 기호, 채워진 sulfation. 이 그림은 수정 하 고 확장에서 Buser 외., 2018, PNAS30. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1:이 연구에서 공업화 nanobodies의 단백질 시퀀스. 회색, 주황색, 빨간색, 자주색에서 TEV protease 분열 사이트, 마젠타, 피토 프 myc hexahistidine (His6) 블루, BAP 순서로 블랙, 하 epitope에 VHH T7 epitope 티로신 sulfation 노란색, 녹색, APEX2 및 mCherry 핑크에서 시퀀스. 이러한 기능성된 안티-GFP nanobodies 인코딩 식 벡터 입금 되었습니다 (참조 표 1 플라스 미드 정보). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,49, 결정 화도 보호자를 같은 응용 프로그램의 숫자에 사용 됩니다 억제제 또는 효소54,55의 활동 변조기로 구조 생물학50,,5152,53, 구조적 상태를 안정화 56, 생 화 확 적인 분석57, immunohistochemical 시 약 또는 "보조 nanobodies" immunoblots 및 면역 형광58에 반대로 마우스, 반대로 토끼 면역 글로불린을 검출 하기 위하여. 우리의 이전 연구에서 우리는 개발 하 고 적용된 기능성된 nanobodies 세균성 식 표면 레이블 단백질 생성 TGN30특히 다양 한 구획을 그들의 세포내 경로 추적. 우리 사용 안티 GFP nanobody 도구 다재 다능 한, 수 대상 융합 단백질 extracellular GFP, YFP, 또는 mCerulean 이미 사용 가능 하 고 특징이 있을 수 있습니다. 수정 안티-GFP nanobodies mCherry, APEX2, 또는 TS의 사이트 기자 이해 하 여 모니터링 고정 및 라이브 셀 이미징에 ultrastructurally 수 있었습니다 시각화 역행 수송 구획, 이러한 구획을 ablate 또는 전송 연구 TGN에의 속도 론 우리의 도구에의 한 단점은 기능성된 안티-GFP nanobodies 적용 될 수 있다 하기 전에 대상 셀 라인 (안정적인 식 또는 생 태그)의 재조합 수정이 필요. 기능화 물론 또한에 적용할 수 있는 nanobodies 동물 예방 접종에 의해 또는 합성 VHH의 리보솜-디스플레이 및 살 균 소 디스플레이 선택에 의해 설립 된 생 대상 단백질에 대 한 감독의 급속 하 게 증가 라이브러리59. TS 사이트 (예를 들어, VHH 2xTS) 수정 하는 nanobodies를 사용 하 여, 전송 및 다양 한 EGFP 수정 대상 단백질의 TGN 도착의 활동 직접 측정할 수 있다 우리. 우리 연구의 기여 어댑터 단백질 복잡 한 1 (AP-1) 주어진된 전송 기계30의 빠른 비활성화를 허용 하는 knocksideways 세포에 직접 운동 분석 MPRs의 역행 전송에서 VHH-2xTS를 적용 했습니다. Nanobody sulfation 및 따라서 역행 EGFP 표시 MPRs의 부분적으로, 하지만 완전히 차단 되었습니다. Nanobody 기반 접근 sulfation TGN 도착 센서로 사용 하 여 역행 endosome TGN 전송17,60, AP-1의 기능적 기여를 나타내는 다른 실험실에서 이전 결과 확인 61. Sulfatable nanobodies 따라서 다른 역행 수송 기계, epsinR, Rab9/TIP47 등 SNX-바/retromer 단지, 게놈, 유전자 또는 화학적 조작에 의해 화물 단백질에의 기여를 해 부 하기에 유용한 생 화 확 적인 도구를 제공할 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 어떻게 하나 만들 수 있습니다 사용 하 여 기능성된 nanobodies의 일반적 결정 대상 구획, 통로, 수송 경작된 한 세포에 활동의 기초를 제공 합니다.

다른 그룹의 TS를 사용 하 여 만든 이미 셀에서 전송에 따라 사이트는 TGN에 표면. 리, 시가 또는 백 일 해 독 소 단위 이전 sulfation 사이트 TGN62,63,,6465,66전송 경로 설명 하기 위해 수정 되었습니다. 또한, TS 펩 티 드 했다 또한 되어 화학적 결합 GFP CIMPR 및 TGN67,68생 TGN46의 역행 수송 분석 결과를 IgGs. 우리의 sulfatable nanobodies 대상 단백질으로 1:1 산출할와 간단 하 고 재현성 세균 생산의 이점이 있다. 그와 반대로, 그것은 예를 들어 잘 알려진 divalent 단백질 바인더, IgGs, 수 crosslink 등 세포 표면 단백질을 endocytosis69,70, 후 리소좀을 그들의 세포내 매매 변경 강조는 기존 메서드에 관해 단위체 단백질 바인더의 중요성. 우리의 기술의 중요 한 단계는 방사능으로 처리 황산 nanobodies의 라벨을 수행 하는 데 필요한입니다. 그러나, 우리의 도구 TGN 도착 공부 TS 사이트와 기능성된 nanobodies의 안티-sulfotyrosine 항 체를 사용 하 여 방사능 않고 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

우리의 이전 연구 제안 sulfation MPRs의 도달 하지 않 았 아직 최대 75 분 후 nanobody 통풍 관 45 분30후 포화 되었다 하더라도 이후 그 nanobody sulfation 매우 효율적입니다. 다른 자연 TS 사이트 심사 sulfation 효율성을 높일 수 있습니다. 또는 잠재적으로 sulfation 효율 향상, sulfation 기계 자체, TPST2, TPST1 등의 구성 요소 overexpressed 될 수도 있습니다. 실제로, 그것은 이전 표시 되었습니다 그 overexpression의 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS)를 제공 하는 전송기 중 하나는 Golgi의 루멘에 cytosol에서 TPSTs에 대 한 기판 proteoglycans sulfation 상태를 변경할 수 71.

Sulfatable nanobodies 떨어져 다른 derivatizations 또한 허용 추적 전송 endocytic 구획을 통해 고는 TGN. APEX2 역행 전송의 proteomic 분석에 대 한 근접 종속 biotinylation에 대 한 무차별 라벨 효소로 적용할 수 있습니다. 관심의 화물 기자에 의해 내 APEX2 nanobody 근접 대상 구획 내에 단백질 레이블을 것입니다. 비교 proteomics endosomes TGN는 nanobody 액세스의 종류에 다른 내 인 성 단백질을 식별 하기 위해 허용 해야 합니다. 함께 그 대상 단백질 nanobodies의 많은 유사 생각할 수 있습니다. 최근 보고서는 예를 들어, 여기에 설명 된 것 거꾸로 접근을 적용: derivatized GFP 공부 하 고 cellularly 표현된 안티-GFP nanobody 태그 vacuolar 정렬에 있는 수용 체 식물의 역행 구획과 참가자를 트랩 사용 되었다 endomembrane 시스템72. 마찬가지로, 기능성된 nanobody-트랩 역행 전송 중 다른 구획에 EGFP 수정 기자를 축적을 포유류 세포 배양 시스템에서 설계 된 수 있습니다.

여기에 우리의 방법을 제시 하며 TS 사이트 태그 nanobodies에 초점을 맞추고 프로토콜 양적 및 질적 추적 화물 단백질의 세포 표면에서 endocytic 구획을 경작된 한 포유류 세포에 TGN

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

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References

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면역학 그리고 감염 문제 144 nanobodies 역행 전송 Golgi 복잡 한 티로신 sulfation 세균성 식 radiolabeling EGFP HeLa 세포
배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석
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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

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