Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/59111
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Proteinler ve membran hücre yüzeyinden Golgi ve ötesine taşıma Homeostazı, organel kimlik ve Fizyoloji için esastır. Retrograd protein Rating çalışmaya, biz son zamanlarda hücre yüzeyinden ışınlamaya Golgi kompleksi, ya sabit ve canlı hücre Imaging, elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak analiz etmek için çok yönlü bir nanobody tabanlı araç geliştirdik. Functionalized Anti-yeşil flüoresan protein (GFP) nanobodies mühendislik — küçük, monomeric, yüksek-benzeşme protein bağlayıcı — membran proteinlerinin bir hücre dışı GFP yan ile ilgi ifade hücre hatları için uygulanabilir. Derivatized nanobodies GFP gazetecilere bağlı özellikle içselleştirilmiş ve gazetecilere sıralama güzergah boyunca sırtlama nakletti. Nanobodies retrograd taşıma Floresans mikroskobu tarafından takip etmek ve askorbat peroksidaz 2 elektron tarafından muhabir-nanobody kompleksleri ultrastructural lokalizasyonu araştırmak için (APEX2) ile görüntülemede canlı fluorophores ile functionalized mikroskobu ve Kinetik trans-Golgi ağ (TGN) varış değerlendirmek için tirozin sulfation (TS) motiflerle. Bu yöntembilimsel makalede, biz bacterially hızlı ve functionalized nanobodies arındırmak için genel yordamı anahat. Biz bizim aracı endositik alımı ve kargo proteinler varış TGN analiz etmek için mCherry ve TS modifiye nanobodies kullanarak güçlü kullanımını göstermektedir.

Introduction

Proteinler ve çeşitli hücre içi bölmeleri için hücre yüzeyinden lipidler retrograd Rating membran homeostazı salgı dengelemek için ve bileşenleri anterograd taşıma makineleri1 geri dönüşüm için bakımı için önemlidir , 2. clathrin bağlı veya - bağımsız endositoz ile içselleştirilmesi, protein ve lipit kargo ilk doldurmak erken endosomes daha fazla nerede üzerinden ya plazma zarı için geri dönüşümlü endo lizozomal sistemi boyunca yönlendirildi veya hedeflenen trans-Golgi ağa (TGN). Endosomes ve/veya hücre yüzeyine gelen TGN için geri dönüşüm anterograd transmembran kargo reseptörleri ba * bağlı ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptörleri (CDMPR ve CIMPR) gibi bir dizi fonksiyonel döngüsünün bir parçası olduğunu teslim etmek Yeni sentezlenen lizozomal TGN geç endosomes ve organellerin3,4,5, sortilin ve SorLA6,7ve Wntless (WLS) Wnt ligandlar hücre yüzeyine taşınması için hidrolazlar 8 , 9 , 10 , 11. TGN46 ve onun ilgili izoformlarının12,13,14, tuzaklarına (çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı füzyon faktör eki reseptörleri) geri TGN için alındı diğer proteinler vardır 15 , 16 , 17, amiloid precursor protein (APP)18,19, ilerleyici eklem (ANK) protein20, ATP7A/B veya DMT121,22gibi ve transmembran metal taşıyıcı enzimler Karboksipeptidaz D, furin veya BACE123,24,25gibi işleniyor. Endojen bu proteinler dışında bakteriyel ve bitki toksinler (örneğin, Shiga ve kolera toksini, risin ve abrin) retrotranslocation için ER sitozol26,27ulaşmak için retrograd taşıma makineleri kaçırmak, 28,29.

Doğrudan retrograd trafiğini analiz için biz daha önce etiket ve kargo proteinler hücre yüzeyinden hücre içi bölmeleri30' a takip nanobody tabanlı bir araç geliştirdik. Nanobodies protein bağlayıcı Devegiller ve kıkırdaklı balıklar31,32içinde doğal olarak oluşan homodimeric ağır zinciri yalnızca antikorlar (hcAbs) türetilen yeni bir aile temsil eder. HcAbs değişken ağır zincir etki alanını (VHH) teşkil ve geleneksel antikorlar (örneğin, IgGs) üzerinde pek çok avantajı var: onlar monomeric, küçük (~ 15 kDa), yüksek oranda çözünür, disülfür bağları, yoksun bacterially ifade ve seçilmiş yüksek-benzeşme bağlama33,34,35,36. Bizim nanobody araç çok yönlü ve geniş uygun yapmak için functionalized anti-GFP nanobodies tagged GFP onların hücre dışı/lumenal etki ile yüzey-etiket ve parça proteinlere çalıştırmaya başladık. Nanobodies (APEX2) mCherry, askorbat peroksidaz 2 ile functionalization tarafından37veya tirozin sulfation (TS) dizileri, retrograd taşıma bonafide transmembran kargo proteinlerin sabit ya da-ebilmek var olmak çözümlemek ve hücre görüntüleme, yaşamak elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 ve TPST2) aracılı tirozin sulfation ardından bir değişiklik için trans-Golgi sınırlı olduğundan/TGN, biz doğrudan çalışma taşıma ve Kinetik bu hücre yüzeyinden ilgi proteinlerin Hücre içi Golgi yuvası38,39,40.

Bu yöntemleri makalede, biz functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry ve türevleri) memeli hücreleri30retrograd Ulaştırma analiz etmek için uygulamalar için uygun üretim kolaylığı tanımlamak. Biz esas olarak TS siteyi değiştiren nanobody kullanım için sulfation yuvası hücre yüzeyinden hücre içi trafik analiz odaklanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Functionalized Nanobodies ile bakteriyel dönüştürme

Not: Bu iletişim kuralı yukarıda açıklanan30ifade, arıtma ve functionalized anti-GFP nanobodies analizi için optimize edilmiştir. Derivatization diğer protein moieties ile bu standart protokol değişikliği gerektirebilir.

  1. Chemocompetent bakteri (~ 100 µL) protein ifade için uygun çözülme (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz yerleştirerek.
    Not: Chemocompetent standart laboratuvar yordamlara göre bakteri hücreleri hazırlayın. Alternatif olarak, kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri ticari olarak satın alınabilir.
  2. 50 ekleyin functionalized nanobodies kodlama bir plazmid ng. Yeterli siteye özgü biotinylation bir nanobody muhabir sırasında bakteriyel ifade izin vermek için Ayrıca üç aşamalı bir aşırı ekleyin (150 ng), biotin ligaz BirA kodlama bir bakteriyel ifade plazmid (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ). Yavaşça damlalıklı yukarı ve aşağı.
    Not: Eğer nanobody biotinylation gerekli değildir veya nanobody gazetecilere bir biotin alıcısı peptid (BAP) yoksun bir plazmid BirA kodlama ile ortak dönüştürme gerekli değildir.
  3. Bakteriyel hücreler buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
  4. Isı şok bakteri hücreleri bir su banyosu veya Isıtma blok 42 ° C'de 1 dk. için koyarak.
  5. Oda sıcaklığında (RT) 1 mL ekleyin Luria suyu (LB) orta ve 1 h 37 ° C'de direnç genleri fenotipik ifade izin vermek için bir thermoshaker dönüştürülen bakterilerde kuluçkaya. 1 L LB hazırlamak için orta, denge 5 g maya özü, 10 g tryptone ve 10 g NaCl, su ile doldurun ve ısıyla tarafından sterilize. Functionalized nanobody direnç Ampisilin/carbenicillin içeren bir ifade vektör subcloned adım 1.5 atlanabilir.
  6. Bakteri 11.000 x g 1 dk. için de cips ve taze LB orta 100 µL içinde resuspend.
  7. Askıya alınan bakteri (örneğin, ile 50 µg/mL sefaloridin ve bakteri (yukarıdaki adım 1.2) belirtildiği gibi nanobody muhabir ve BirA ile birlikte dönüştürülmüş zaman 50 µg/mL carbenicillin) anılan sıraya göre antibiyotik içeren LB plakalar üzerinde plaka.
  8. Kuluçka 37 ° C'de LB tabak yerleştirin ve büyümeye izin gecelik (O/N).
    Not: Protokol burada 4 ° C'de yetişkin kolonileri LB plakalı depolayarak duraklatılmış Parafilm LB plakalarının için kullanın.

2. bakteriyel sıvı kültür ve indüksiyon Functionalized Nanobody ifade

  1. Vektör plaka dan ilgi içeren bir bakteriyel koloni almak ve antibiyotik O/N 37 ° C'de titreyen bir kuluçka takıma LB orta 20 mL içeren bir balonun içinde büyümesine izin (Ayrıca bkz: adım 1.7 seçimi antibiyotik ile ilgili).
  2. Ertesi gün, Yetişkin 20 mL bakteri kültürü 1 L LB orta seçim antibiyotik içeren bir şişesi içine oranında seyreltin.
  3. 0.6-0.7 OD600 ulaşıncaya kadar 37 ° C'de bakteri kültürü kuluçkaya devam'i tıklatın. Kültür protein ifade inducing önce RT için soğumasını sağlar.
  4. Functionalized nanobodies ve BirA protein ifadesi 1 M izopropil-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) son bir konsantrasyon uyarıcı (1:1, 000 seyreltme) 1 mm için 1 mL eklenmesiyle neden. Ayrıca 10 mL 200 µM d-biotin BAP epitope functionalized nanobodies (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ) mevcut biotinylation izin vermek için büyüme orta sonuçlanan bir 20 mM d-biotin stok çözeltisi ekleyin
    Not: D-biotin hisse senedi çözüm GKD2içinde O hazırlanır ve drop-wise buna ek olarak 500 mM NaH2PO4tarafından çözümü haline getirdi. Alternatif olarak, d-biotin de DMSO içinde çözülmüş. APEX2 için erimiş nanobodies üretmek için (VHH-APEX2), LB orta ayrıca heme birleşme tanıtmak için 1 mM 5-Aminolevulinik asit (dALA) hidroklorür ile tamamlanabilir gerekir. dALA GKD2O. bir 100 mM hisse senedi çözüm olarak hazırlanır
  5. 1 L IPTG kaynaklı bakteri kültürü için VHH-2xTS için 4 h 30 ° C'de, 20 ° C veya RT O/N için VHH-APEX2 veya 16 kuluçkaya ° C O/N için VHH-mCherry (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ).
    Not: Yeni bir nanobody yapı için ifade koşullar tarafından deneyci optimize edilmiş olması gerekir.
  6. Bakteriyel kültür balonun bir 1 L Santrifüjü şişe içine aktarmak ve hücreleri 5000 x g 45 dk. Decant süpernatant için 4 ° C'de de cips ve arıtma ile devam edin.
    Not: Protokol burada-80 ° C'de bakteriyel Pelet süresiz olarak depolayarak duraklatılmış. VHH-APEX2 veya VHH-mCherry için Pelet genellikle kahverengi (nedeniyle eklenen heme) ya da pembe, sırasıyla.

3. Functionalized Nanobodies arıtma

  1. Gerekirse, buzda donmuş bakteriyel Pelet çözülme (Ayrıca bkz: adım 2.6).
  2. Buz gibi bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 30 mL bakteri hücre Pelet ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Resuspended bakteri etiketli 50 mL tüp içine aktarın.
  3. 30 mL bağlama arabellek ile 200 µg/mL lizozim, 20 µg/mL Dnaz ben, 1 mM MgCl2 ve 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ve RT, 10 min için ilk ve sonra bitti sıra shaker üzerinde 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya ek.
  4. Mekanik bir ipucu sonicator süspansiyon yerleştirerek 50 mL tüp bakteri hücreleri parçalayıcı. Sabit 3 x 1 dk darbeleri ile 1dk soğutma dönemleri arasında geçerlidir.
  5. 15.000 x g için enkaz ve sağlam hücreleri cips 45 dk 4 ° c de lysate bakteriyel santrifüj kapasitesi. Sonicated bakteri hücre lysate ya Santrifüjü için uygun aralıklarla şişe içine aktarmak veya birkaç 5 mL tüpler için masa üstü Santrifüjü lysate bölün.
  6. Süpernatant yeni 50 mL tüp içine aktarmak ve pelleted enkaz atın.
  7. Temizlenen depolamak arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından hazırlanırken buzda lysate. Functionalized nanobodies histidin öğesini izole etmek için istihdam tek kullanımlık (bkz. Tablo reçetesi) onun sütunları hızlı ve basit yerçekimi akış arıtma izin.
    Not: Alternatif olarak, toplu iş arıtma ticari sütunlar yerine de kullanılabilir.
  8. Onun sütun bir Metal stand montaj.
    1. Sütunları depolama çözümü konik ve onun equilibrate sütun bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) 10 mL ile.
    2. Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.
  9. Yavaş yavaş temizlenen bakteriyel lysate (~ 30 mL) sütuna yerleştirin. Yerçekimi akımını (akış yoluyla atılır) boş.
  10. Onun yıkama sütun 2 x 10 mL bağlama arabellek (1 x PBS 20 mM imidazole) ile.
  11. Nanobodies 2 mL elüsyon arabelleği (1 x PBS 500 mM imidazole) ile 2 mL tüp içine elute ve bir arabellek değişimi uygulayın.
  12. Arabellek Exchange.
    1. Bir desalting equilibrate sütun bir 50 mL tüp sütun bağdaştırıcısıyla 5 kere 5 mL 1 x PBS de yerleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Arabellek Paketli yatağa girmek izin. Akışı aracılığıyla atın.
    3. Beşinci PBS denge sonra 1000 x g 2 min için adresindeki sütun spin.
    4. Akışı aracılığıyla atın.
    5. Sütun yeni bir 50 mL tüp üzerine bağdaştırıcısıyla yerleştirin. (Kimden adım 3.11) eluted functionalized nanobody desalting sütun PBS equilibrated ve 1000 x g 2 min için spin üzerine 2 mL yük ve eluate toplamak.
      Not: Ticari desalting sütunları yerine, diyaliz arabellek oluşturma değişimi için uygulanabilir.
  13. Bicinchoninic (BCA) veya üreticinin yönergelerine göre Bradford tahlil kullanarak eluate protein (nanobody) konsantrasyonu belirlemek.
    Not: 2-10 mg/mL stok bir konsantrasyon GFP muhabiri hücre hatları ile nanobody alımını deneyleri için idealdir.

4. doğrulama Functionalized Nanobody ifade (Coomassie boyama)

  1. 10-%12,5 jelleri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) standart protokolleri göre hazırlayın.
    Not: Alternatif olarak, piyasada bulunan prekast degrade jelleri kullanın.
  2. Saf functionalized nanobody 1,5 mL tüp ve örnek arabelleği 95 ° c 5 min için kaynatın içine damlalıklı 20 µg.
    Not: Örneğin, bir 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm 10 µL 10 µL 2 x örnek arabelleği ile 1,5 mL tüp içine ekleyin. Birim çok küçük ise, daha fazla örnek arabellek eklemeden önce PBS nanobody sulandırmak.
  3. Örnek arabelleği bir SDS-polyacrylamide jel üzerine haşlanmış arıtılmış nanobody yüklemek ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel Coomassie boyama tarafından takip, sonuna ulaşmıştır kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak ve destaining.
  4. Coomassie boyama ve Destaining jel.
    1. Jel uncast ve Coomassie boyama çözüm (10 g/L Coomassie hisse senedi % 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O çözümde % 5) 20-30 dk RT az hareketli bir sallayarak platform üzerinde leke. Jel tamamen boyama çözümde örtülmelidir.
    2. Jel destain 2 - 3 kez ile çözüm (% 7.5 Asetik asit ve % 15 metanol GKD2O) için 1 h her RT, jel O/N daha fazla destaining için terk etmeden önce destain.
      Not: Aşırı Coomassie verimli bir şekilde mutfak kağıt havlu jel çevresinde yerleştirerek batırılmış.
  5. Jel bir Imager veya seçtiğiniz kamera ile görüntü.
    Not: Nanobody ifade daha fazla (Ayrıca bkz: şekil 1A) onun epitopları hedefleme antikorlar immunoblot analizi tarafından doğrulanabilir.

5. Functionalized Nanobodies floresan boyama için kültürlü hücreleri tarafından alımını

  1. Bir hücre kültür başlık, tohum ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri stabil bir muhabir GFP öğesini protein 18 mm cam coverslips (No 1.5 H) 35 mm yemekleri veya 6-şey kümeleri üzerinde antibiyotikler (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, DMEM içeren tam orta ile ifade etme 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir ile % 10 fetal buzağı serum (FCS)).
    Not: Burada, stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade HeLa hücreleri kullanırız. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa hücreleri kullanılabilir. İstikrarlı hücre hatları ile ebeveyn sigara transduced HeLa hücreleri, doğrudan karşılaştırma için bu adımda ortak ekili olabilir.
  2. O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.
  3. Damlalıklı 2 µL 2 mg/mL nanobody hisse senedi çözüm tam orta 2 mL içeren bir 15-50 mL tüp içine (Bu birim bir 35 mm yemeği veya bir şey, bir 6-şey kümesinin kapağı, orta ve nanobody orantılı olarak daha fazla hücre kültür d eklemek seviyesini ayarlamak için yeterli değil ishes veya kümeleri).
    Not: Gösterim amacıyla, biz burada kullanmak VHH-mCherry, yok daha fazla antikor boyama nanobody ( şekil 2Cbakınız) EGFP gazeteciler tarafından içselleştirilmiş görmek için gerekli olduğundan.
  4. Büyüme orta hücrelerdeki kaldırmak ve 35 mm çanak veya 6-de birim başına 2 µg/mL functionalized nanobody içeren prewarmed tam orta 2 mL ekleyin.
  5. Muhabir-aracılı nanobody alımını sağlamak için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bağlı olarak planlanan deneme, zaman nanobody Alım ayarlanması gerekiyor. Burada gösterilen deneme için 1 h kararlı durum nanobody Alım EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP ulaşmak yeterlidir.
  6. Orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 2 - 3 kez yıkamak
  7. % 3 paraformaldehyde (PFA) 10 dk RT. az için 1 mL ile hücreleri tamir
  8. İngiltere'de yılın çözümü kaldırmak ve 50 mM NH4Cl 1 x PBS RT., 5 min için 1 mL ile kalan sabitleştirici gidermek
    Not: %3 PFA ayrı ayrı olarak sabitleştirici kaybı atılmalıdır.
  9. Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak
  10. 1 mL %0.1 hücrelerle permeabilize Triton X-100 1 x PBS RT., 10 dk içinde
    Not: Hiçbir permeabilization gerekli olmasına rağmen daha sonra hücrelerin montaj ortamda katıştırılmış EGFP ve mCherry floresan iyidir.
  11. Bulunduğu hücreleri 1 mL 1 x PBS RT., 3 kez yıkamak
  12. Coverslips üstünde bir damla (~ 100 µL) Forseps ile % 1 BSA RT., 5 min için 5 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) içeren 1 x PBS içinde yerde
  13. Coverslips geri çanak/kuyunun içine yerleştirin ve 3 kez ile 1 mL 1 x PBS RT., yıkama
  14. Cam slayt etiket ve Fluoromount-G. hücrelerle bağlama 3-4 h için karanlıkta sertleşmesine ve cam slaytları lamba koruma altında 4 ° C'de depolama montaj orta izin.
  15. Görüntü desenleri tercih (örneğin, nokta tarama Confocal dik mikroskop) mikroskop kullanarak boyama.

6. Functionalized Nanobodies (için Sulfation analiz) kültürlü hücreleri tarafından alımını

  1. Bir hücre kültür başlık, stabil bir muhabir GFP öğesini protein 35 mm yemekler veya tam orta içeren antibiyotik (Dulbecco'nın modifiye kartal orta, % 10 fetal buzağı ile takıma DMEM, 6-şey kümelerinde ifade ~ 400.000 için 500.000 HeLa hücreleri tohum Serum (FCS), 100 adet/mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1,5 µg/mL puromisindir).
    Not: Yukarıda belirtildiği gibi biz burada HeLa hücreleri stabil EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP örnek amacıyla ifade kullanın. İstikrarlı hücre hatları dışında Ayrıca geçici transfected HeLa kullanılabilir.
  2. O/N hücrelerin prolifere için % 7,5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Hücreleri bir confluency ~ %80 ertesi gün olmalıdır.
  3. Tam orta kaldırmak, 2 kez 1 x PBS RT, yıkayın ve % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için orta (SFM) sülfat içermeyen hücrelerle açlıktan.
    Not: SFM kartal dengeli tuzları için 500 mL 10 mL MEM amino asitler (50 x) çözeltisi, 5 mL 5 mL vitamini çözeltisi (100 x) ve 900 µL CaCl2·2H2O L-glutamin (200 mM), de ekleyerek hazırlanır. Bir 0,22 µm filtre ve aliquot üzerinden geçmek.
  4. Havalandırılmış hood veya radyoaktivite iş için belirlenmiş Bank, SFM sodyum tuzu olarak 0.5 MCI/mL [35S] sülfat içeren orta etiketleme sülfat hazırlayın.
    Uyarı: Dikkatle radyoaktivite içeren tüm çözümleri ele. Yalnızca belirlenen davlumbaz veya banklar çalışmak. Bütün malzeme (ipuçları, tüpler, tabaklar, vb) veya yıkama arabellekleri radyoaktivite ile temas halinde toplanan ve ayrı ayrı bertaraf gerekiyor. Bunu tüm adımları (adım 6.5-6.20) için de.
  5. VHH-2xTS 1 x PBS sülfat orta 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon olarak etiketleme içine ekleyin.
    Not: Denetimi olarak da belirli etiketleme göstermek için VHH-std ya da başka bir nanobody yoksun TS siteleri içerir.
  6. SFM tarafından 0.7 mL orta içeren 0.5 MCI/mL [35S] sülfat ve 2 µg/mL VHH-2xTS etiketleme sülfatın değiştirin ve radyoaktivite ile iş için belirlenmiş bir % 7.5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bağlı olarak planlanan deney, nanobody sulfation zaman ayarlanması gerekiyor. Buna ek olarak, TGN varış Kinetik belirlemek için etiketleme için farklı zamanlarda (örneğin, için 10 dk, 20 dk, 30 dk, vb.) gerçekleştirilir.
  7. Etiketleme orta kaldırmak ve bulunduğu hücreleri buz gibi 1 x PBS bir soğutma plaka veya buz üzerinde 2 - 3 kez yıkayın.
  8. 1 mL 2 mM PMSF ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma lizis arabellek (PBS içeren % 1 Triton X-100 ve % 0.5 deoxycholate) ekleyin ve 10-15 dk 4 ° C'de sallanan bir platformda için hücreleri kuluçkaya
  9. Scrape ve lysate 1,5 mL tüp içine, girdap lysate, transfer ve 10-15 dk 4 ° C'de bir bitti sıra rotator üzerinde yer
  10. Bir postnuclear hazırlamak, 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından lysate
  11. Yeni 1,5 mL tüp kullanarak, bir bulamaç nikel boncuk 1,5 mL tüp içinde 20-30 µL hazırlamak ve bir kez tarafından yavaşça onları 1000 x g 1 dk. için de peletleme 1 x PBS ile yıkayın.
    Not: Nikel yerine boncuk, (nanobody biotinylated ise) streptavidin boncuk veya protein A boncuk nanobody (T7 - veya HA-etiket) bir epitope karşı bir IgG ile kullanılabilir.
  12. Postnuclear transfer lysate 1,5 mL tüp içine içeren nikel boncuk ve nanobodies izole bir bitti sıra dönme-e doğru tarih 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Bir aliquot (50-100 µL), postnuclear lysate kaldırın ve SDS örnek arabelleği toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleme sonraki immunoblot analizi için kaynatın.
  13. Boncuk 3 kez ile 1 PBS veya lizis tampon x 1000 x g 1 dk. için de hafifçe peletleme tarafından yıkayın.
    Not: Boncuk daha sıkı yıkanmasında, 20 mM imidazole PBS veya lizis arabellekte dahil edilebilir.
  14. Dikkatle tüm çamaşır arabellek boncuk kaldırmak, 2 örnek arabellek x 50 µL eklemek ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın
  15. Her iki yük bir MIDI üstündeki SDS-sayfa jel ve başvuru boya (örneğin, mavi bromophenol) ayıran jel ulaştı kadar standart sayfa protokole göre çalıştırmak % 12.5 haşlanmış.
    Not: Toplam hücre ilişkili nanobody, GFP muhabir ve denetim yükleniyor Immunoblot analizi da mini bir %12,5 kullanarak gerçekleştirilebilir SDS-sayfa veya prekast degrade jel.
  16. Ayıran jel RT, 1 h için fiksasyon arabellek (% 10 Asetik asit ve % 45 metanol GKD2O) ~ 30 mL fix, jel üç kez ~ 50 mL deiyonize su ile yıkayın ve jel kurutma için hazırlamak.
  17. SDS-sayfa jelleri kurutma.
    1. Dikkatli bir şekilde sabit jel gergin sarılmak filmde yer ve precut filtre kağıdı ile kapağı.
    2. Filtre kağıdı ile jel kurutma platformu üzerine yerleştirin, vakum kapak yerleştirin ve vakum pompası jeli kurutma için geçiş. 3-5 h için jel kuru.
    3. Sarılmak film kaldırmak ve bir fosfor ekran ile donatılmış bir autoradiography kaset kurutulmuş jel yerleştirin.
  18. Fosfor ekran Imager kullanarak görüntü autoradiograph. Üreticinin yönergeleri izleyin.
    Not: Sinyal gücünü bağlı olarak, artık bu fosfor ekranlarla maruz jelleri ihtiyaç kurumuş.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retrograd protein taşıma çeşitli hücre içi hedeflere araştırmak için biz son zamanlarda etiket ve rekombinant füzyon proteinler hücre yüzey30takip nanobody tabanlı bir anti-GFP aracı kurduk. Burada, biz böyle bakteri üretimi nanobodies derivatized ve endositik alımını Floresans mikroskobu ve immunoblotting yanı sıra TGN varış göre sulfation analizi araştırmak için bunların kullanımı eğitim için kendi uygulama göstermek göstermek. İkinci uygulama, bu iletişim kuralı metodolojik odak noktasıdır.

Farklı functionalized anti-GFP nanobodies ortak özelliklere sahip bir araç standart Moleküler klonlama30tarafından üretilip. Bizim basit (Standart) nanobody, VHH-std, VHH etki alanı, bir T7 ve bir HA epitope sonraki algılama için özel antikorlar, carboxyterminal hexahistidine (His6) tarafından içerir-etiket ve için bir biotin alıcısı peptid (BAP) serisi için biotinylation ve yüksek-benzeşme streptavidin açılan deneyler (şekil 1A). VHH-std derivatization endositik alımı ve retrograd taşıma biyokimyasal olarak, sabit ve canlı hücre görüntüleme ve elektron mikroskobu incelemek için farklı nanobody türevleri verir.

Protein trafikten plazma zarı trans-Golgi değerlendirmek için/TGN, tyrosylprotein sulfotransferases özel lokalizasyonu yararlandı bu bölmeleri ve böylece VHH-std türetilmiş tandem tirozin sulfation ile bir site (2xTS) modifiye sıçan procholecystokinin41. VHH-std modifikasyonu ile mCherry retrograd taşıma, görüntüleme functionalization APEX237gibi bir peroksidaz ile sabit ve canlı hücre ile doğrudan görselleştirme izin verirken elektron mikroskopisi çalışmaları, cytochemical bölmesi sağlar ablasyon, reaksiyonlar ya da yakınlık bağımlı biotinylation. Buna ek olarak, tütün etch için virüs (TEV) proteaz ekleme bir bölünme sitesinin biyokimyasal olarak hücre içi ve yüzey bağlı nanobodies (şekil 1A) arasında ayrım yapmak için izin verir. Biz daha önce nanobody bağlı EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP30endositik geri dönüşüm Kinetik izlemek için VHH-tev kullandık. Nanobody yeniden ortaya çıkma hücre yüzeyinde alımı sonra sadece nanobody'nın carboxyterminal epitope kaset ters bir kaybı neden extracellularly uygulanan rekombinant TEV proteaz ile takip tarafından değerlendirildi. MCherry veya APEX2 nanobody fusion bir bölünme sitesi de dahil olmak üzere, VHH-tev için benzer bir şekilde canlı hücre görüntüleme tarafından geri dönüşüm Kinetik EGFP gazetecilere çalışmaya veya hücre içi bölmeleri, cytochemical tepkiler sırasıyla sınırlamak için kullanışlıdır. Functionalization diğer protein etki alanları (örneğin, diğer fluorophores veya enzimler) veya hedef sıraları ile diğer ardından değişikliklerin kolayca plazmid ilgili bir ekleme subcloning tarafından elde edilebilir vektör kodlama VHH-std (Ayrıca bkz: Tablo 1 plazmid bilgi için) kullanılabilir SpeI ve EcoRI kısıtlama siteleri kullanarak.

Yukarıda açıklandığı gibi iletişim kuralını kullanarak, tüm nanobodies burada resimli yüksek saflıkta ve verim (şekil 1B) için ayrılmış olabilir. Sadece mCherry füzyon protein etki alanlarının küçük kırpma gösterdi arıtma (1B rakam, bkz: Şerit 7-8) sonrası. BirA ifade olmaması durumunda, biz genellikle 25-35 mg VHH-std, VHH-2xTS ve tev-modified karşılıkları için veya ~ 20 mg VHH-APEX2 ve VHH-mCherry ve tev içeren türevleri için elde. Bizim deneyim BirA coexpression üçüncüye yarım tarafından nanobody verimi düşürür gösterir.

Muhabir-aracılı nanobody alımını göstermek için HeLa hücre hatları stabil EGFP-Calnexin (CNX), EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP (şekil 2A ve B) ifade kullanmış. EGFP (yani, arasında sinyal ve muhabir dizi CNX veya CDMPR) her proteinin hücre dışı/lumenal amaçla ve TFR sitozolik sıralama sinyalleri engelsiz bırakarak carboxyterminus erimiş. Tüm kargo EGFP öğesini moleküllerin farklı hücre içi kaçakçılığı güzergahlar ER hedefleme sonra var. EGFP-Calnexin serviste ikamet ettiği ve normalde yazı-Golgi bölmeleri bulmuyor beri bir negatif kontrol potansiyel ve nonspesifik nanobody alımı için olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP Golgi ötesine taşıma işlevlere sahiptir ve böylece giderek plazma zarı görünür. VHH-mCherry unmodified HeLa ve stabil EGFP-CNX, ifade hücreleri karışık bir nüfusa eklendiğinde beklendiği gibi hiçbir nanobody içselleştirilmesi her iki durumda da gözlenen. Ancak, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP VHH-mCherry hücre yüzeyine yakalanan ve onları muhabirin izleme bölmeleri (şekil 2C) için Paketle nakli.

VHH-mCherry colocalization bir ikamet TGN marker ile prensipte TGN varış değerlendirmek için kullanılabilir. Henüz, tirozin sulfation dayalı bir biyokimyasal yaklaşım kurduk. Trans-Golgi içinde meydana gelen bu değişiklik avantajlarından yararlanmak için/TGN, nanobodies functionalized ile TS siteleri (şekil 1A). Özgüllük ve bu protein bağlayıcı işlevselliğini göstermek için değiştirilmemiş HeLa hücreleri ve stabil EGFP-CNX, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP VHH-std veya VHH-2xTS ile radyoaktif sülfat huzurunda 1 h için ifade hücreleri inkübe. Gazeteci nanobody retrogradely nerede tirozin sulfation makineleri için yararlanılır TGN için taşıma VHH-2xTS radiolabeling yalnızca oluşur. EGFP-CNX ve ebeveyn hücrelerine ifade HeLa yok nanobody alımı ve böylece hiçbir sulfation görüntüler. EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP nanobodies, ikinci önemli ölçüde daha fazla eski içselleştirilmiş. Yine de, tek EGFP-neden sülfürlü VHH-2xTS CDMPR (şekil 3A). Bu verimli retrograd taşımacılığının CDMPR hücre yüzeyinden TGN için onaylar ve (bazı çalışmalar42,43yılında sürülmüştür gibi) için TGN dönen TfR karşı kanıt sağlar.

Kinetik içselleştirilmesi ve muhabir proteinler TGN varış da cep lysates sonra nanobody alımı ve sulfation farklı zamanlarda analiz ederek belirlenebilir. EGFP-CDMPR muhabir olarak kullanarak, sulfation sadece bir gecikme süresi ~ 15 dk sonra başlatmak ve doygunluk ulaşmak için bulduk sonra > 75 dk (şekil 3B, şerit 1-6 ve C, kare semboller). Alımı ve sulfation Kinetik tarafından neredeyse 30 dk TGN aktarıma yansıtan, ötelenen ortaya çıktı. Buna ek olarak, yöntemi sıralama makine MPR taşımacılığında farmakolojik girişim veya nakavt, nakavt veya knocksideways gibi yaklaşımlar susturmak protein tarafından ilgili araştırmak için sağlar. Burada, brefeldin A (BFA), guanin nükleotid değişim faktörleri (GEFs) birkaç Arf GTPases, bir inhibitörü TGN retrograd ulaşım genellikle müdahale ederdik. Alımı kinetik ve ölçüde (şekil 3B, şerit 7-12 ve C, yuvarlak simgeler) etkilenmemiş kaldı BFA ile tedavi ederken, sulfation tamamen, kaldırıldı.

Figure 1
Şekil 1: tasarım ve üretim functionalized nanobodies EGFP-modified hücre yüzey proteinleri izlemek için. (A)derivatized nanobodies şematik gösterimi. Standart nanobody GFP özgü VHH etki alanı, T7 ve HA epitope Etiketler, bir BAP ve bir hexahistidine (His6) arıtma etiketi içerir. Diğer nanobodies Ayrıca iki TSs, APEX2, mCherry, her biri ile veya olmadan TEV proteaz (tev) için bir bölünme site oluşturmaktadır. Ölçek çubuğu amino asitler (aa) olduğunu. (B) Bacterially ifade ve saf nanobodies (50 μg) degrade SDS-Jel Elektroforez tarafından analiz ve Coomassie ile lekeli. Marker protein molekül ağırlığı kDa ile sol tarafta gösterilir. Sadece VHH-mCherry ve VHH-tev-mCherry VHH ve mCherry etki alanları arasında en az kırpma gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: alımı ve VHH-mCherry hücre içi yerelleştirme tarafından farklı EGFP muhabir proteinler. (A)EGFP füzyon protein şematik gösterimi. Salgı membran proteinlerinin türetilmiş dizileri siyah N-terminal sinyal peptidler ve sarı iç transmembran segment ile gösterilir ve EGFP yeşil renkle gösterilmiştir. EGFP tam uzunlukta CDMPR, TfR ve Calnexin (CNX) erimiş. Ölçek çubuğu amino asitler (aa). EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP açıklanan30olmuştur. (B) HeLa hücreleri stabil EGFP muhabir proteinler ifade hasat edildi, lysed ve SDS-Jel Elektroforez ve anti-GFP ve anti-aktin antikorları kullanarak immunoblotting tarafından analiz etti. Molekül ağırlığı kDa içinde sağ tarafta gösterilir. (C) HeLa hücreleri stabil EGFP öğesini muhabir proteinler 5 μg/mL ile VHH-mCherry inkübe ebeveyn HeLa hücreleri ile karışık ifade (~ 100 nM) 1 s 37 ° C'de ve floresan mikroskopi için işlenmiş. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Alım yalnızca bir muhabiri hücre yüzeyi maruz EGFP ile ifade hücreleri tarafından oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Sulfation analizi ve Kinetik retrograd taşıma nanobodies TS öğesini kullanarak TGN için. (A)ebeveyn ve HeLa hücreleri stabil EGFP-modified muhabir proteinler ile 2 μg/mL VHH-std ya da VHH-2xTS 60 dk için 0.5 MCI/mL [35S] sülfat kullanarak etiketli ifade. Nanobodies nikel boncuklar, bir %12,5 SDS-sayfa takip autoradiography tarafından ayrılmış kullanarak izole edildi. Hücre lysates aliquots nikel yıkmak ve immunoblotted hücre ilişkili nanobody (His6), EGFP ve aktin için önce toplanmıştır. (B ve C) stabil EGFP-CDMPR ifade HeLa hücreleri ile ilâ 75 dk 2 μg/mL VHH-2xTS ve 2 μg/mL BFA analiz (A) olduğu gibi önce olmadan huzurunda için 0.5 MCI/mL [35S] sülfat olarak etiketlenmiş. VHH-2xTS alımı ve sulfation üç bağımsız deneyler üzerinden Nefelometri BFA olmadan değeri yüzde 75 dk sonra (ortalama ve SD) gösterilmiştir. BFA olmadan siyah kareler; BFA olan gri daireler; semboller, açık alımı; semboller, dolu sulfation. Bu şekil değiştiren ve üzerinden Buser et al., 2018, PNAS30genişletilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Bu çalışmada gösterilen functionalized nanobodies Protein dizileri. T7 epitope gri, siyah, HA epitope turuncu, hexahistidine (His6) kırmızı, TEV proteaz bölünme sitesi mor, pembe, myc epitope mavi, BAP sırayla VHH tirozin sulfation sıra sarı, APEX2 yeşil ve pembe mCherry. Bu functionalized anti-GFP nanobodies kodlama ifade vektörel çizimler yatırılır (Ayrıca plazmid bilgi için bkz. Tablo 1 ). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanobodies protein bağlayıcı iskele geleneksel antikorlar üzerinden pek çok avantajları ile ortaya çıkan bir sınıfı temsil: Bunlar küçük, istikrarlı, monomeric,33,35, yüksek benzeşme ve eksikliği disülfür bağları için seçilen 44 , 45. hücre kültür sistemleri ve gelişim biyolojisi46,47,organizmalarda48,49, için kristalizasyon etmez gibi uygulamalar, bir takım olarak kullanılır Yapısal Biyoloji50,51,52,53, konformasyon Devletleri'nde inhibitörleri ya da etkinlik modülatörler enzimler54,55olarak stabilize etmek, 56, biyokimyasal analizler57immunohistokimyasal kimyasalları, veya "ikincil nanobodies" olarak immunoblots ve ayirt58üzerinde anti-fare ve anti-tavşan immünglobulin algılamak için. Önceki çalışma, biz geliştirdik ve uygulanan functionalized nanobodies yüzey etiketli proteinlere bakteriyel ifade tarafından üretilen ve hücre içi rotalarını çeşitli bölümler için özellikle TGN30' a izlemek. Aracın hedef füzyon proteinler hücre dışı GFP, YFP veya zaten mevcut ve karakterize olabilir mCerulean için çok yönlü, güçlü yapmak için bir anti-GFP nanobody kullanılır. Değişiklik, mCherry, APEX2 veya TS ile anti-GFP nanobodies retrograd taşıma bölmeleri, bu bölmeleri ablate veya taşıma çalışma bize muhabir alımını sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından için ultrastructurally izlemek izin verilen siteler görselleştirmek Kinetik TGN için. Bizim Aracı'nın bir dezavantajı, functionalized anti-GFP nanobodies uygulanmadan önceki hedef hücre hatları (istikrarlı ifade veya endojen etiketleme) rekombinant değişiklik gerekli olmasıdır. Functionalization tabii ki de nanobodies hayvan bağışıklama veya sentetik VHH ribozom-görüntü ve FAJ-görüntü yelpazesi tarafından kurulan etiketsiz endojen hedef proteinler karşı hızla artan sayıda uygulanabilir kitaplıkları59. TS siteleri (örneğin, VHH-2xTS) ile modifiye nanobodies kullanarak, biz doğrudan ulaşım ve Kinetik farklı EGFP-modified hedef proteinlerin TGN varış ölçebilirsiniz. Adaptör protein kompleksi 1 (AP-1) içinde katkısını MPRs retrograd taşıma izin verilen taşıma makineleri30hızlı inactivation knocksideways hücreleri doğrudan Kinetik analizi ile çalışmaya VHH-2xTS başvurdum. Nanobody sulfation ve EGFP etiketli MPRs dolayısıyla retrograd taşınması kısmen, ama tamamen engelledi. Sulfation TGN varış sensör kullanarak nanobody tabanlı yaklaşımımız ultraviyole retrograd endosome TGN taşıma17,60AP-1'in fonksiyonel bir katkı gösteren önceki sonuçlarından doğruladı, 61. Sulfatable nanobodies böylece epsinR, Rab9/TIP47 veya kargo proteinler genomik, genetik veya kimyasal işlemler tarafından üzerinde SNX-BAR/retromer kompleksleri gibi diğer retrograd taşıma makineleri katkısını incelemek için yararlı bir biyokimyasal araç sağlayabilir. Burada sunulan Protokolü nasıl bir functionalized nanobodies genel olarak hedef bölmeleri, yollar, belirlemek için kullanın ve Kinetik kültürlü hücrelere taşıma yapabilirsiniz bir temel sunmaktadır.

Diğer gruplar zaten TS kullanma yaptık siteleri taşıma hücreden takip etmek için TGN yüzey. "Risin", Shiga veya boğmaca toksini alt birimleri daha önce TGN62,63,64,65,66ile aktarım yol göstermek için sulfation siteleri ile değiştirilmiş. Ayrıca, TH peptidler de kimyasal olarak IgGs retrograd taşıma GFP-CIMPR ve endojen TGN46 TGN67,68için tahlil için birleştiğinde. Bizim sulfatable nanobodies basit ve tekrarlanabilir bakteri üretimi ve hedef protein ile 1:1 stoichiometry avantajına sahip. Aksine, örneğin de divalent protein bağlayıcı, IgGs, can crosslink gibi hücre yüzey proteinleri ve onların hücre içi organellerin için sonra endositoz69,70, kaçakçılığı alter bilindiği vurgulama monomeric protein bağlayıcı mevcut yöntemler açısından önemi. Bizim teknik önemli bir adım radyoaktivite ile işleme nanobodies sülfat etiketleme gerçekleştirmek için gerekli olmasıdır. Ancak, aracımızı TGN varış çalışmaya TS siteleri ile functionalized nanobodies, potansiyel olarak anti-sulfotyrosine antikorları kullanarak radyoaktivite uygulanabilir.

Bizim önceki çalışma nanobody alımını 45 dk30' dan sonra doymuş olsa bile MPRs sulfation henüz maksimum 75 dk sonra ulaşmıştı değil beri bu nanobody sulfation değil çok etkili olduğunu göstermektedir. Diğer doğal TS siteler için tarama sulfation verimliliği artırmak. Alternatif olarak, potansiyel olarak sulfation verimliliği artırmak için bileşenleri sulfation makine kendisi, TPST1 ve TPST2, gibi overexpressed. Gerçekten de, bu daha önce bu overexpression gösterilmiştir 3'-phoshoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) teslim taşıyıcılar birini Proteoglikanlar sulfation durumunu TPSTs için belgili tanımlık substrate sitozol Golgi Lümen için gelen alter 71.

Sulfatable nanobodies dışında diğer derivatizations da endositik bölmeleri aracılığıyla ve TGN izleme taşıma sağlar. APEX2 için yakınlık bağımlı biotinylation retrograd taşıma proteomik çözümlenmesi için önüne gelenle yatıp kalkan bir etiketleme enzim olarak uygulanabilir. Faiz bir kargo muhabir tarafından içselleştirilmiş APEX2 nanobody proteinler yakın hedef bölmeleri içinde etiketlenir. Karşılaştırmalı proteomik endojen diğer proteinler arasında endosomes ve nanobody erişen TGN farklı türde tanımlamak için izin vermelidir. Nanobodies onun hedef protein ile birlikte birçok varyasyonu akla. Bir rapora, örneğin, ters bir yaklaşım burada açıklanan bir uygulanan.: derivatized GFP çalışma ve cellularly ifade anti-GFP nanobody öğesini katmaninin sıralama reseptörleri anterograd ve bitki retrograd bölmeleri tuzak için kullanıldı endomembrane sistem72. Benzer şekilde, functionalized nanobody-tuzaklar yakalamak ve EGFP-modified gazetecilere farklı bölmeleri retrograd taşıma sırasında birikir memeli hücre kültür sistemlerindeki tasarlanmış olabilir.

Bizim burada yöntemi sunulan ve nicel ve nitel izleme kargo proteinlerin hücre yüzeyinden endositik bölmeleri ve kültürlü memeli hücrelerinde TGN TS site öğesini nanobodies odaklı iletişim kuralı sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Grant 31003A-162643 tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Nicole Beuret ve Biozentrum Imaging Core tesisi (IMCF) destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35 mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 144 nanobodies retrograd taşıma Golgi kompleksi tirozin sulfation radiolabeling EGFP HeLa hücreleri bakteri ifade
Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of … More

Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter