Summary
Vi præsenterer her, to protokoller for at omdanne kartoffelplanter. Agrobacterium tumefaciens transformation fører til et komplet transgene anlæg mens Agrobacterium rhizogenes producerer transgene behårede rødder i en vildtype skyde, der kan være selvstændige opformeret. Vi registrerer promotor aktivitet af GUS farvning i de transformerede rødder.
Abstract
Agrobacterium sp. er en af de mest anvendte metoder til at opnå transgene planter, som det har evnen til at overføre og integrere sine egne T-DNA i plantens genom. Vi præsenterer her, to transformation systemer til genetisk ændre kartoffelplanter (Solanum tuberosum). I A. tumefaciens transformation, bladene er inficeret, de transformerede celler er markeret og en ny komplet transformerede anlæg er regenereres ved hjælp af Phytohormoner i 18 uger. I A. rhizogenes transformation, stængler er smittet ved at indsprøjte bakterier med en nål, de nye opstået transformerede behårede rødder er opdaget ved hjælp af en rød fluorescerende markør og ikke-transformeret rødderne er fjernet. I 5-6 uger er den deraf følgende anlægget sammensat af en vildtype skyde med fuldt udviklede transformerede behårede rødder. For at øge biomassen, kan de transformerede behårede rødder skåret ud og selv opformeret. Vi anvendte begge Agrobacterium -medieret transformation metoder for at opnå rødder udtrykker GUS reporter gen drevet af en suberin biosyntetiske gen promotor. GUS farvnings-procedure er fastsat og tillader celle lokalisering af promotor induktion. I begge metoder viste de transformerede kartoffel rødder GUS farvning i korkagtige endodermis og exodermis, og derudover i A. rhizogenes omdannet rødder GUS aktivitet blev også fundet i fremkomsten af laterale rødder. Disse resultater tyder på, at A. rhizogenes kan være en hurtigt alternative redskab til at studere de gener, der udtrykkes i rødder.
Introduction
Bortset fra økonomiske interesse har generation af transgene planter sin egen relevans i forskning at vise den ultimative funktionen af gener og bedre forstå plantefysiologi og udvikling. Mest udbredte metode til plante DNA indsættelse er Agrobacterium-medieret transformation. Agrobacterium tumefaciens er i stand til at generere crown galls i det inficerede væv af mange plantearter ved hjælp af dens tumor-overtalelse (Ti) plasmid. Plasmidet indeholder en T-DNA region med et sæt af gener, der vil blive integreret i anlægget genom og fremkalde væv dedifferentiation1,2. Udvekslingen af disse gener inden for T-DNA af transgenet har tilladt generation af specifikke anlæg ændringer undgå fænotypisk virkninger3. For at lette transgenet kloning ind i T-DNA, T-DNA-regionen har været skåret ud i en uafhængig plasmid kaldet en binær plasmid, mens resten af gener for Ti-plasmidet (virulens gener, der giver mulighed for T-DNA overførsel og indsættelse mekanismer) har været placeret i en helper plasmid. For plante bioteknologi forskning, transformation af A. tumefaciens har flere fordele: det behøver ikke dyre enheder, er i stand til at generere både stabile og forbigående plante transformation og lavt antal gen kopier er integreret i den kromosom4. Men for de fleste planter, men ikke Arabidopsis, generation af stabile transformants kræver planten regenerering fra en enkelt eller et par celler ved hjælp af eksogene Phytohormoner, hvilket gør denne proces, besværlige og tidskrævende. A. rhizogenes er også i stand til Rediger genomet plante producerer behårede rødder eller utilsigtet rødder på infektion steder på grund af udtryk af rol (root loci) gener kodet i root-inducerende (Ri) plasmid5. Selv om mindre undersøgt end A. tumefaciens, bruges A. rhizogenes også til at opnå transgene rødder. I dette tilfælde indeholder A. rhizogenes den oprindelige T-DNA i Ri plasmid og en binær plasmid med en anden T-DNA transporterer transgenet. Når webstedet infektion er i stængler eller hypocotyls, kan en sammensat plante fås, med nye behårede transgene rødder opstår fra vildtype skyder. Alternativt, behårede transformerede rødder kan vokse autonomt in vitro- medier med carbon source indgange. Brugen af A. rhizogenes i stedet for A. tumefaciens at producere transgene væv vinder relevans når roden er målorgan, fordi anlægget regenerering er ikke nødvendig og derfor er det hurtigere og billigere. Tidligere undersøgelser har vist denne metode tilegnet til fænotypisk karakterisering af roden specifikke gener6,7,8,9.
Kartoffel (Solanum tuberosum) er den fjerde vigtigste afgrøde i verden Ifølge Levnedsmiddel- og Landbrugsorganisation af de Forenede Nationer (FAO), da knolden ernæringsmæssig relevans til konsum for at være en god kilde til vitaminer og mineraler. Derfor, kartoffel er blevet placeret i søgelyset for landbrugs bioteknologi og også betragtes som en god biologisk model for genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser10,11. Kartoffel transformation bidraget væsentligt til forståelsen af molekylære mekanismer underliggende korkagtige væv gennem karakterisering af gener involveret i suberin og voks biosyntesen12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 og transskription forordning19. Suberin feruloyl-transferase-genet, FHT, er en af disse karakteriseret biosyntetiske gener; dens downregulation giver anledning til en stærk forringelse af periderm beskyttelse, som er korreleret med en stærk nedgang i ferulate estere af suberin og voks i kartoffel knolde14. Samtidig, i rødder og frø af Arabidopsis demonstreret knockout af dens formodede orthologue (ASFT/RWP1) også sin rolle i at producere alkyl ferulates i suberin20,21. I kartoffel viste FHT transcriptional reporter linje og FHT antistof henholdsvis at promotor aktivitet og protein er placeret i exodermis, endodermis, phellogen-derivater og sårede væv15.
I dette arbejde detalje vi en protokol bruger A. rhizogenes til at producere transgene behårede rødder, der vedligeholdes i en vildtype skyde, generere sammensatte kartoffelplanter eller skåret ud til at vokse autonomt in vitro. Vi leverer også protokollen ved hjælp af A. tumefaciens for at opnå komplet transgene kartofler. Som case bruges A. rhizogenes og A. tumefaciens omdannet med den samme binære vektor til at få rødder med FHT promotor kørsel GUS reporter gen expression. Resultaterne indberettes og sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. rhizogenes transformation protokol blev tilpasset og ændret fra Horn et al.7 og genotype testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens transformation protokol blev tilpasset og ændret fra Banerjee et al.22 og genotyper testet blev S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena. De vigtigste trin i begge procedurers er sammenfattet i figur 1 og figur 2, henholdsvis.
Bemærk: I alle trinene i den procedure, der udfører in vitro- overførsler, gøre det hurtigt, og når det er muligt, opretholde plader eller gryder lukket, hvilket minimerer plante eksponering for luft til at undgå visnen og forurening. Andet er angivet, blev alle plante inkubationer udført i skabene under de 12 h på 24 ° C lys/12 h til 20 ° C mørke og 67 µmol m-1 s-1. Andet er angivet, udføre alle de bakterier manipulation og in vitro- plante overførsler under aseptiske forhold i en laminar flow hætte. Alle medier opskrifter for Agrobacterium og in vitro- plant kulturer er fastsat i Tabel S1.
Forsigtighed: Deponere alle genetisk modificerede bakterier og planter til den bevilgede spildbakken.
1. Agrobacterium kulturer bruges til transformation
Bemærk: Den stamme, der anvendes til A. rhizogenes transformation var C58C1:Pri15837 (venligst leveret af Dr. Inge Broer) og det for A. tumefaciens var GV2260 (venligst leveret af Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes blev omdannet med den binære vektor PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Institut for Plantebiologi systemer på Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) der indeholder en T-DNA transporterer en transformation markør for at overvåge den behårede rod dannelse. Hvis du vil sammenligne de transformerede rødder genereret af A. rhizogenes og A. tumefaciens, blev begge omdannet med den binære vektor pKGWFS7, som indeholder en T-DNA transporterer FHT initiativtageren kørsel β-glucoronidase (GUS) reporter gen og Kanamycin resistens gen som en valgbar markør15.
- Vælge en koloni af Agrobacterium og dyrke det natten over (O/N) i 5 mL af YEB medium suppleret med antibiotika (Tabel S1) i et 50 mL centrifugeglas på 28 ° C under omrystning på 200 rpm.
- For A. tumefaciens transformation, måle den optiske tæthed, som skal være OD600 = 0,6-1,0.
- Hvis ekstinktionen er højere, gøre en subkultur, sænke det til OD600 = 0,3 med friske medier og vent indtil kulturen når OD600 = 0,6-1.
- Der centrifugeres 1 mL af Agrobacterium kultur på 3.000 x g i en Bordcentrifuge i 10 min ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten ved pipettering, og pelleten celler i 1 mL frisk YEB medie uden antibiotika. Gentag dette trin for at sikre en fuldstændig fjernelse af antibiotika.
- For A. tumefaciens transformation, i den sidste resuspension tilføje den passende YEB volumen for at opnå en endelig Ekstinktionen af OD600 = 0,8.
- Hold celler på is mens de forbereder planterne for at være inficeret.
2. plante materiale til transformation
- Gøre en eller to node stængelstiklinger enten indeholdende den apikale eller hjælpeansatte knopper fra sterile i vitro kartoffelplanter (donor planter); dyrke dem i solid 2MS medium i potter i 3-4 uger (figur 1A og figur 2A).
3. plante transformation ved hjælp af A. rhizogenes (figur 1)
Bemærk: Denne procedure giver mulighed for opnåelse af transformerede behårede rødder. For at evaluere udtrykket transgen, er en negativ kontrol nødvendig. For at forberede den negative kontrol, skal du følge proceduren ved hjælp af en A. rhizogenes stamme enten untransformed eller omdannet med tomme vektoren, der omfatter markørgen transformation.
- Bruge friske medier plader; Alternativt, pladerne kan opbevares ved 4 ° C med låg side op, tætsluttende med gennemsigtig film at undgå media dehydrering. For at forberede de firkantede media plader, bøje dem. ~ 15°, fyld med 40 mL af MS, og lad dem størkne. Dette vil minimere kontakt med den antenne del af anlægget med medium.
- Overføre meget omhyggeligt en donor plante fra 2MS medium til en 120 mm x 120 mm firkantet plade.
- Injicere til en stilk internodium 3 μL af A. rhizogenes kultur ved hjælp af en kirurgisk nål og gentage det to gange pr. plante i forskellige stængelled når det er muligt.
Bemærk: Overveje hver injektion som en uafhængig transformationsbegivenhed (figur 1B). - Overfør straks hele anlægget til en firkantet plade med solid MS medium suppleret med 0,1 mM acetosyringone. Rumme 2 planter pr. plade.
Bemærk: 1 M acetosyringone stamopløsning fremstilles i DMSO og kan opbevares ved-20 ° C. - Forsegle pladen ved hjælp af kirurgisk tape og arrangere det lodret inde i et skab vækst i 4 dage.
- Overføres anlægget til et nyt firkantet plade med MS medium suppleret med cefotaxim natrium [500 µg/mL] at dræbe A. rhizogenes.
- Efter 10-12 dage, vil behårede rødder begynde at vises (figur 1 c,1 D). Derefter, punktafgifter indfødte rødderne af anlægget, og overføre anlægget til et nyt firkantet plade med MS medium suppleret med cefotaxim natrium [500 µg/mL].
Bemærk: Transformeret behårede rødder kan kontrolleres af røde fluorescens, når du bruger en DsRed transformation markør (figur 3D). - For at opnå en sammensatte plante (figur 1E), lad de transgene behårede rødder vokse til 3-4 uger i MS medium suppleret med cefotaxim natrium [500 μg/mL] (ændre medium hver uge).
- Afhængigt af formålet, udbrede de transgene behårede rødder og de negative kontroller som følger.
- Overføre hele sammensatte anlægget til en hydroponiske (Tabel S2) eller jord medium at give mulighed for en massiv udvikling.
- Individuelt overført de transformerede behårede rødder, ved hjælp af en skalpel skåret rødderne udtrykker rødt fluorescerende transformation markør (DsRed protein) når de er 4-8 cm lang (figur 1E) og overføre dem til en petriskål med Gamborg B5 solid medium suppleret med 2% saccharose og cefotaxim natrium [500 μg/mL]. Forsegle plader med plast laboratorium film og dyrke dem i mørke ved 20 ° C.
Bemærk: Rødderne kan manipuleres under et stereomikroskop udstyret til at opdage fluorescens under sterile forhold (Se Tabel af materialer). - For produktion af biomasse (dvs. gen expression analyse), skåret en 5 cm lang behårede rod og udbrede det i et 150 mL Erlenmeyer-kolbe med 20 mL af Gamborg B5 flydende medium suppleret med 2% saccharose og cefotaxim natrium [500 µg/mL]. Dyrke det i 6 uger i mørke ved 20 ° C og 60 rpm.
Figur 1: Tidslinjen for at opnå kartoffel transgene behårede rødder ved hjælp af A. rhizogenes. De kumulative uger at nå frem til hver fase af transformationsprocessen og de efterfølgende trin at dyrke de behårede rødder er vist. Repræsentative billeder af forskellige faser er afbildet: indledning af processen ved hjælp af 3-uge-forhenværende in vitro- planter (A), derefter infektion af planter ved at indsprøjte A. rhizogenes (B), dannelsen af den proliferative væv (C, pile) med nye behårede rødder (D), og de udviklede behårede rødder udtrykker rødt fluorescerende transformation markør DsRed (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. plante transformation ved hjælp af A. tumefaciens (figur 2)
Bemærk: Denne procedure giver mulighed for opnåelse af transformerede planter. For at evaluere den transgene effekt, kræver det en negativ kontrol. En mulighed er at følge proceduren ved hjælp af en A. tumefaciens omdannet med den tomme vektor. Alternativt, vildtype planter kan bruges.
- Skær og sted et blad fra 3-4 uge gamle planter (figur 2A) i en petriskål. Ved hjælp af en skalpel udelukke stilk og gøre tværgående snit (1-3 afhængigt af blad størrelse) fra midten af bladet til kanterne undgå afskære dem (figur 2B).
- Umiddelbart placerer bladet flyder på 10 mL frisk 2MS flydende medier i en petriskål med den abaxial side op og lukke pladen. Gentag trinnet imødekommende op til 15 blade for cv. Désirée og 25 blade for ssp. enndigena (afhængigt af blad størrelse).
- Straks tilsættes 80 µL af A. tumefaciens kultur på OD600 = 0,8 i den flydende medier og homogeniseres plade manuelt for 1 min til at distribuere den bakterielle løsning.
- Omhyggeligt forsegle med forsegling film, dæk med aluminiumsfolie og inkuberes i 2 dage i et kammer på 24 ° C at lade forvandlingen ske.
- Overføre bladene holder abaxial side op til CIM-medium (figur 2B) og Inkuber dem i en uge i et skab vækst.
- Skrab CIM medium med pincet, så bladene kan imødekommes bedre på medierne.
- Overføre bladene holder abaxial side op til SIM-medium (figur 2 c), og der inkuberes dem i et kabinet, forfriskende medium hver 7-10 dage, indtil skuddene er omkring 2 cm høj vækst.
- Skrab SIM medium med pincet, så bladene kan være helt omgivet af medierne. Når de opstod skud når låget, arbejde med høje petriskåle (100 x 20 mm, højde x diameter).
Bemærk: Callus vil danne efter 2-3 uger i SIM-medium (figur 2D) og skyder efter 6-7 uger (figur 2E). Skuddene vil blive betragtet som uafhængige transformationsbegivenheder når de dukker op fra callus dannet fra uafhængige sår.
- Skrab SIM medium med pincet, så bladene kan være helt omgivet af medierne. Når de opstod skud når låget, arbejde med høje petriskåle (100 x 20 mm, højde x diameter).
- Klip tre skud opstod fra hver hård hud (betragtes som den samme transformationsbegivenheden) (figur 2E), overføre dem til kultur kolber med MG medium suppleret med cefotaxim natrium [250 mg/L for] at tillade rodnet, mærke delmængden med et nummer og Inkuber i et skab i 3-4 uger eller indtil skuddene er energisk (figur 2F) vækst.
Bemærk: Når du skærer skuddene, fjerne godt hård hud ellers roden ikke vil danne.- Gentag trin så mange gange som uafhængige rederier er nødvendigt. Op til 5 forskellige transformation kan begivenheder placeres i en kultur kolbe med en diameter på 8 cm til at arbejde i fuld tillid til, at planter fra forskellige begivenheder ikke er blandet.
- Vælg den mest kraftig plante af hver event, skæres den apikale segment af skyde med 3-4 stængelled og placere det i en ny kultur kolbe med 2MS medium suppleret med cefotaxim natrium [250 mg/L].
Bemærk: I 3-6 uger planten vil vokse effektivt, udvikle en kraftig skyde og rødder.- Bringe tilbage til salen ikke-valgte skuddene indtil udvalgt plante er fuldt udviklet.
- Skær stilken segmenter fra planten med mindst én internodium eller med den apikale bud og overføre dem til nye 2MS medium suppleret med cefotaxim [250 mg/L]. Inkuber dem i vækst kabinet.
- Replikere hver 3-4 uger for at oprette linjerne i vitro omdannet.
Bemærk: Cefotaxim natrium er nødvendig i mindst tre efterfølgende overførsler til 2MS medium være sikker på at dræbe A. tumefaciens; bagefter, hvis A. tumefaciens overvækst er observeret, overføre planterne igen til 2MS media suppleret med cefotaxim natrium.
- Replikere hver 3-4 uger for at oprette linjerne i vitro omdannet.
- For at karakterisere plante fænotype, overføre planter til jord til deres fulde karakterisering eller til hydroponics kultur for root inspektion.
- Holde knoldene produceret i jord til at udbrede og opretholde de etablerede linjer.
Figur 2: Tidslinjen for at opnå kartoffel omdannet planter ved hjælp af A. tumefaciens. De kumulative uger at nå frem til hver fase af transformationsprocessen og de efterfølgende trin til at vokse planter er vist. Repræsentative billeder af forskellige faser er afbildet: indledning af processen ved hjælp af blade fra 3 - uger gamle in vitro- planter (A), overførsel af den sårede og inficerede blade til CIM-medier (B), bladene når overført til SIM-medier (C), visualisering af hård hud omkring de sårede områder efter 2-3 uger i SIM-medier (D), skyde dannelsen efter 9-11 uger i SIM-medier (E) og skyder efter overføres til MG medier (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. hydroponiske kultur
- Forberede den Hoagland løsning til en halv styrke (0,5 x) (Tabel S2) i en 10 L spand.
- Fordybe et akvarium pumpe til at opretholde ensartethed og ordentlig ilt betingelser.
- Dække væggene i spand med aluminiumsfolie at vokse rødderne i mørke omgivelser.
- Undgå rod skader, overføre in vitro- planter til hydroponiske kultur.
Bemærk: Fjern eventuelle resterende in vitro- medium fra rødder til at undgå mikroorganisme spredning under inkubation ved omrystning omhyggeligt rødder nedsænket i vand. - Dække planterne med gennemsigtig film som et væksthus til at give tilstrækkelig akklimatisering og Inkuber i den voksende afdeling.
- Laver huller i filmen efter 3 dage og fjerne det helt en uge efter.
- Erstat med friske medier hver 10 dage.
6. GUS histokemiske reporter gen assay
Bemærk: I vores tilfælde GUS analyse blev udført med rødder af 2-3 uger vokset i hydroponics eller in vitro.
- Løse rødderne med 90% kølet acetone (v/v) og inkuberes det i 20 minutter på is.
- Udføre to vask med destilleret vand.
- Tilføj frisk GUS farvning løsning (tabel 1) og anvende vakuum (-70 Pa) i 20 min.
- Der inkuberes ved 37 ° C i mørke til at beskytte den lysfølsomme GUS i 4 h, eller indtil en blå farve er synlig.
Bemærk: Tilstedeværelsen af ferri- og kaliumferrocyanid i GUS løsning minimere diffusion af reaktionsprodukter og give mere præcise lokalisering.
Forsigtig: Brug et stinkskab og bære beskyttelsesdragt ved håndtering af giftige cyanid derivater i GUS løsning (kalium Ferricyanid og kaliumferrocyanid). GUS substrat og bortskaffelse materiale skal bortskaffes sikkert. - Fjern GUS farvning løsning og kassér den i passende beholdere.
- Udføre to vask med ethanol 70% (v/v).
- Observere under lysfelt mikroskop.
Bemærk: GUS farvning er stabil for et par uger; men i den første uge, GUS signal er klart og diffunderer mindre til omkringliggende celler. For længere opbevaring, forsegling røret og opbevares ved 4 ° C.
Tabel 1: GUS farvning løsning opskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -medieret kartoffel transformation
I dette manuskript præsenteres den trinvise procedure sat op til at få transformeret rod med A. rhizogenes . Figur 1 viser en oversigt over den procedure, som helt tager ca 5-6 uger (fra injektion af A. rhizogenes at opnå fuldt udviklede behårede rødder). Derefter kan anlægget studeres som en sammensat (vildtype skyde, transgene root) eller transgene behårede roden kloner kan være skåret ud og vokset selvstændigt i solid Gamborg B5 medium suppleret med 2% saccharose. Alternativt, de behårede rødder kan massivt formeres ved hjælp af de flydende Gamborg B5 medier. Proceduren fremlagt foretaget med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée).
Metoden til at overvåge proceduren og få kartoffel transgene behårede rødder er valideret ved hjælp af en binær vektor med DsRed som transformation markør (PK7GWIWG2_II-RedRoot fra VIB-Institut for Plantebiologi systemer på Universiteit Gent). Dette tillod skelnen af transgene behårede rødder fra ikke-transgene af den røde fluorescens. Forhold til det, i figur 3 udstillet transformerede behårede rødderne røde fluorescens når belyst med grønt lys. Den negative kontrol ved hjælp af den untransformed Agrobacterium viste ingen røde fluorescens (figur 3 c), samlet med angivelse af egnetheden af DsRed transformation markør til at identificere de transgene behårede rødder (figur 3D). Andre transformation markører såsom antibiotisk resistens kan bruges, som beskrevet af andre forfattere23,24; dog, antibiotika i medierne kan producere en vækst forsinkelse i transgene rødder indeholdende markør.
Figur 3: Fluorescerende transgene behårede rødder af kartoffel (cv. Désirée) transformeret af A. rhizogenes. De behårede rødder blev opnået ved hjælp af en ikke-transformeret A. rhizogenes (stamme C58C1: pRI1583) (A og C) og med A. rhizogenes (stamme C58C1:pRI1583) transformeret med tomme vektor pK7GWIWG2_II-rød-roden bærer en DsRed transformation markør (B og D). De behårede rødder dannes i begge infektioner (A, B) men røde Fluorescens er kun observeret i behårede rødder omdannet med A. rhizogenes indeholdende den binære vektor. Billederne blev taget med et stereomikroskop udstyret med en lygte og en specifik filter til at visualisere den røde fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Agrobacterium tumefaciens -medieret kartoffel transformation
Den anden protokol, der er beskrevet i dette håndskrift er konfigureret til at hente, trinvis, en komplet kartoffelplanten omdannet med A. tumefaciens. Figur 2 viser en oversigt over den procedure, som helt tager mellem 15-18 uger (fra blad infektion med A. tumefaciens at opnå fuldt folier planter). Den mest tidskrævende del af proceduren, er anlægget regenerering af organogenesis. Dette særlige trin gør denne metode mere besværlige end ved hjælp af A. rhizogenes. Proceduren, der er blevet udført med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena, de førstnævnte er mindre afhængige af short-day forhold til at fremkalde tuberization.
I A. tumefaciens-medieret transformation, i modsætning til den A. rhizogenes -medieret transformation, folier planterne er helt transgene organismer. Men selvom de transgene planter regenereres i et Kanamycin selektivt medie, ikke alle linjer effektivt express transgenet. Derfor, validering af transgenet udtryk er nødvendig.
Sammenligning af FHT promotor aktivitet i rødder fremstillet ved hjælp af A. tumefaciens og A. rhizogenes
De ovennævnte procedurer blev anvendt til at producere rødder udtrykker GUS genet promotor af FHT gen. Den komplette omdannet planter med A. tumefaciens var tidligere rapporteret15, ved hjælp af binær vektor pKGWFS7 indeholdende FHT promotor. Nu, denne binære vektor har været brugt til at producere nye transformerede behårede rødder for at sammenligne væv hvor selskabet er aktive og derfor til at teste den behårede rodsystem som et redskab til at studere promotor aktivering.
Figur 4 viser GUS farvning i rødderne af transgene planter fremstillet af A. tumefaciens (figur 4AB) og transgene behårede rødder fremstillet ved A. rhizogenes (figur 4 cD, E, F), henholdsvis. Som det kan ses, rødder omdannet med A. tumefaciens og dyrkes in vitro- Vis blå farvning i endodermis (figur 4A), en cellelag mellem cortex og stele. I mere udviklede rødder, blå mærkning er uensartet i de ydre lag svarende til exodermis (figur 4B). I transformerede behårede rødder vokset i hydroponics, var GUS markør specifikt placeret i endodermis (figur 4 cE), i fremkomsten af laterale rødder (figur 4DE), i de sårede områder (figur 4E ) og i exodermis (figur 4F). Rødderne viste ingen GUS pletten i negative kontroller, der var enten behårede rødder uden PromFHT:GUS T-DNA kassette eller vildtype rødder.
Figur 4: Histokemiske observation af transgene kartofler rødder udtrykker GUS reporter gen drevet af selskabet i FHT. Rødderne fra komplet transgene planter fremstillet af A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) transformation (A-B) Vis blå farvning i endodermis (A) og exodermis (B). Transgene behårede rødderne fremstillet af A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. Désirée) transformation (C-F) vise GUS farvning i endodermis (C og E), i den laterale rod fremkomsten (D og E), i zonen sårheling (E) og exodermis (F). Endodermis (da); Exodermis (EX); Vedvævet (XL); Primordia af en lateral rod (LR). Den røde pil angiver det sårede område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel S1: Media opskrifter bruges til voksende bakterier og in vitro- planter. Venligst klik her for at downloade denne tabel
Tabel S2: Halv styrke Hoagland løsning til voksende kartoffelplanter i hydroponics. Venligst klik her for at downloade denne tabel
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I kartoffel bruger de mest almindelige system at opnå stabile komplet transgene planter omdannelsen af Agrobacterium tumefaciens stammer, der kræver organogenesis ved hjælp af eksogene Phytohormoner. Selv om protokollerne Agrobacterium baseret har potentiale til at integrere ikke-T-DNA vektor sekvens25, er denne metode stadig den letteste og mindre dyre tilgængelige at omdanne kartoffelplanter. I løbet af sidste år, interesse i A. rhizogenes-medieret transformation har fået opmærksomheden af forskere for at tillade at opnå transgene rødder i kortere perioder end ved hjælp af A. tumefaciens. A. rhizogenes stadig bevarer det root-inducerende (Ri) plasmidet, som bærer et sæt af gener kodning enzymer til phytohormone auxin kontrol og cytokinin biosyntesen, og kodning opines26. Når Ri T-DNA er indsat i den vært genomisk DNA, indstillingen den nye hormonbalance de inficerede celler inducere dannelse af prolifererende rødder, kaldet behårede rødder, emerging på punkterne i infektion27. Når en flere binære vektor bruges til at integrere en fremmed DNA, giver bevarelse af Ri plasmid mulighed for at få transformeret behårede rødder uden behov for organogenesis ved hjælp af eksogent anvendes Phytohormoner28. De behårede rødder kan opretholdes knyttet til vildtype skyde genererer en sammensatte plante eller kan være selvstændige opformeret. Denne evne af behårede rødder til selvstændige udbrede udnyttes til at producere i flere planter behårede rødder som et biologisk system til mass-producing værdifulde metabolitter eller fremmede proteiner, generere interesser i farmaci og endda phytoremediation områder ( Se for anmeldelse29,30). I kartoffel (var. Kufri Bahar), var transgene komplette anlæg smittet med vildtype A. rhizogenes stamme til at producere behårede rødder udtryk for Hepatitis B overflade antigen (HBsAg)23. Alternativt, et komplet transgene anlæg fra behårede rødder kan opnås, men kartoffelplanten og knolde viste markant udvikling i forhold til den untransformed kontrol. Disse forskelle i fænotype er på grund af den oprindelige Ri T-DNA integreres i genom31,32.
I dette værk, de detaljerede procedurer at opnå transgene stabile behårede rødder ved hjælp af A. rhizogenes og transgene stabil planter ved hjælp af A. tumefaciens præsenteres (figur 1 og figur 2). De fuldt udviklede transgene behårede rødder er fremstillet i 5-6 uger, mens transgene rødder ved hjælp af A. tumefaciens nødvendige 15-18 uger på grund af organogenesis krav fra transformerede celler, og de udvalg og opformering af transformerede planter. I vores hænder fungerer A. tumefaciens transformation procedure effektivt i S. tuberosum ssp. andigena og ssp. tuberosum (cv. Désirée), med en rapporteret transformation effektivitet omkring 35%22 og 48% 12, henholdsvis. Den beskrevne A. rhizogenes transformation procedure er baseret på, rapporteres af Horn7, som viste en høj (80-100%) transformation effektivitet i cv. Désirée og andre tre kartoffel kultivarer (Albatros, Sabina og Saturna).
At præsentere A. rhizogenes som en alternativ transformation system for kartoffel funktionelle studier og til at angive, om den første tilstedeværelse af Ri T-DNA var anledning til bekymring, vi brugte vektor begge systemer til at omdanne kartoffel rødder med det samme binært indeholdt en T-DNA med en fortaler for en suberin biosyntetiske gen (FHT) kørsel GUS reporter gen expression. De histokemiske analyse afslørede, at i A. tumefaciens omdannet planter, aktiviteten af FHT initiativtageren var i de indre og ydre korkagtige lag af rødder (endodermis og exodermis, henholdsvis) (figur 4A,B ) og også i de sårede områder af de blade, stængel og knold15. I A. rhizogenes omdannet behårede rødder, blev aktiviteten også fundet i endodermis og exodermis og de sårede root områder (figur 4E). Samtidig forekomsten af suberin promotor aktivitet i begge typer af transformerede rødder angiver at Ri integreret T-DNA ikke påvirker de udviklingsmæssige processer relateret til suberization i det mindste i disse root væv. I transformerede behårede rødder registreret vi også aktivitet i FHT promotor i områderne omkring fremkomsten af laterale rødder (figur 4D,E). Det er enigt med promotor aktivitet indberettet af andre gener, som er involveret i transport af suberin monomerer ABCG11 / WBC1133,34,35,36 eller regulator StNAC103 19. kartoffel transformation af A. rhizogenes at studere et suberin gen er allerede blevet rapporteret for nylig37 og også i dette tilfælde behårede rødder har lov til at vise promotor aktivering af CYP86A33, en fedtsyre Ω-hydroxylase. Men GUS farvning i rødder var bulk kvantificeres ved hjælp af en fluorometriske assay, derfor den specifikke udtryk i korkagtige væv var kun formodninger.
Helt processer disse resultater beviser at A. rhizogenes transformation er et hurtigere alternativ værktøj til at udforske celle type-specifikke promotor aktivering af suberin-relaterede gener i rødder, som kan udvides til at omfatte undersøgelser baseret på andre forekomme i rødder. Enig, er nogle andre funktionelle genetiske undersøgelser lykkedes ved hjælp af A. rhizogenes i kartoffel, tomat og eucalyptus for at demonstrere gen-funktion6,7,8,9, at studere hormonel reaktion38,39 eller promotor aktivitet40,41. Denne strategi kan stadig fremsætte begrænsninger, især når man studerer stramt kontrolleret udviklingsprocesser, der kan dereguleres af Ri T-DNA eller når hele planten eller knoldene eller andre organer, der er forskellig fra rødder vil blive undersøgt. I disse situationer er A. tumefaciens transformation system stadig foretrukne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI tilskud til PB), Ministerio de Economía y Competitividad og FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) og universitetet i Girona (Ph.d.-stipendium til SF og tilskud SING11/1). Forfatterne er taknemmelig for, at Dr. Inge Broer (Institut for arealanvendelse, Universitet i Rostock, Rostock, Tyskland) og Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) for at give A. rhizogenes og A. tumefaciens stamme, henholdsvis, og Dr. Marçal Soler og Dr. Anna Plasencia for den hjælp og støtte modtaget i indledningen A. rhizogenes transformation eksperimenter (Toulouse III Paul Sabatier Universitet — CNRS, plante Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan Frankrig). Forfatterne takke Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) for hendes værdifulde bistand i udførelsen af laboratoriearbejde og pasning af planter, og Ferran Fontdecaba og Carla Sánchez der bistået med nogle af eksperimenterne, mens de gjorde deres endelige grad projekter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
