Summary
Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.
Abstract
Agrobacterium SP., es uno de los métodos más utilizados para obtener plantas transgénicas, ya que tiene la capacidad de transferir e integrar su propio T-ADN en genoma de la planta. Aquí, presentamos dos sistemas de transformación para modificar genéticamente las plantas de papa (Solanum tuberosum). En la transformación de a. tumefaciens , hojas están infectadas, las células transformadas se seleccionan y se regenera una planta transformada completa nueva con fitohormonas en 18 semanas. En la transformación de a. rhizogenes , tallos son infectados por las bacterias de la inyección con una aguja, las nuevas raíces peludas transformadas emergidas se detectan usando un marcador fluorescente rojo y se eliminan las raíces no-transformado. En 5-6 semanas, la planta resultante es un compuesto de una sesión de tipo salvaje con raíces peludas transformadas completamente desarrolladas. Para aumentar la biomasa, las raíces pilosas transformadas pueden ser suprimidas y uno mismo-propagar. Aplicamos ambos métodos de transformación de Agrobacterium -mediado para obtener las raíces que expresan el gen reportero GUS conducido por un promotor de genes biosintéticos de suberina. El procedimiento de tinción GUS se proporciona y permite la localización celular de la inducción del promotor. En ambos métodos, las raíces de papa transformada demostraron la coloración en el suberized de la endodermis y exodermis y además, en las raíces de a. rhizogenes transformó la actividad de GUS GUS también se detectó en el surgimiento de raíces laterales. Estos resultados sugieren que a. rhizogenes puede ser una herramienta rápida alternativa para estudiar los genes que se expresan en las raíces.
Introduction
Aparte de interés económico, la generación de plantas transgénicas tiene su propia importancia en la investigación para demostrar la función última de los genes y a comprender mejor la fisiología de las plantas y el desarrollo. El más utilizado método de inserción de ADN de la planta es Agrobacterium-mediado transformación. Agrobacterium tumefaciens es capaz de generar agallas de corona en el tejido infectado de muchas especies de plantas por la acción de su plásmido inductor de tumor de (Ti). El plásmido contiene una región de ADN de T con un conjunto de genes que se integrará en el genoma de la planta e inducir diferenciación de tejido1,2. El intercambio de estos genes dentro del ADN de T por el transgén ha permitido la generación de modificaciones de la planta específica evitando efectos fenotípicos3. Para facilitar el transgén de clonación en el T-ADN, la región T-DNA ha sido suprimida en un plásmido independiente llamado un plásmido binario, mientras que el resto de los genes del plásmido Ti (los genes de virulencia que permiten los mecanismos de transferencia y de inserción de T-DNA) han sido situado en un plásmido helper. Para la investigación de biotecnología vegetal, transformación por a. tumefaciens tiene varias ventajas: no necesita dispositivos costosos, es capaz de generar transformación de planta estable y transitoria y bajo número de gene copias están integradas en la cromosoma4. Sin embargo, para la mayoría de las plantas, pero no, de Arabidopsis la generación de los transformantes estables requiere regeneración de plantas de una sola o unas pocas células mediante fitohormonas exógenas, haciendo este proceso laborioso y desperdiciador de tiempo. A. rhizogenes es capaz de modificar el genoma de la planta, produciendo las raíces pilosas o raíces adventicias en los sitios de infección debido a la expresión de los genes rol (root locus) codificado en la inducción de raíz (Ri) plásmido5. Aunque menos estudiado que a. tumefaciens, a. rhizogenes también se utiliza para la obtención de raíces transgénicas. En este caso, el a. rhizogenes contiene el original T-ADN en el plásmido Ri y un plásmido binario con un segundo T-DNA llevando el transgén. Cuando el sitio de infección en tallo o hipocotilos, una planta compuesta se puede obtener, con nuevas raíces transgénicas peludas surgen brotes de tipo salvaje. Alternativamente, peludas raíces transformadas pueden desarrollarse autónomamente en vitro en los medios de comunicación con las entradas de fuente de carbono. El uso de a. rhizogenes en lugar de a. tumefaciens a producir tejido transgénico está ganando relevancia cuando la raíz es el órgano Diana, porque no es necesaria la regeneración de plantas y por lo tanto es más rápido y menos costoso. Estudios anteriores han demostrado que esta metodología apropiada para la caracterización fenotípica de raíz genes específicos6,7,8,9.
La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto más importante cultivo en el mundo según la organización para la agricultura de las Naciones Unidas (FAO) y la alimentación ya que el tubérculo tiene importancia nutricional para el consumo humano por ser una buena fuente de vitaminas y minerales. Por eso, Papa se ha colocado en el foco de la biotecnología agrícola y también se considera como un buen modelo biológico genético y desarrollo de estudios de10,11. Transformación de la papa contribuyó significativamente a la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes los tejidos suberized a través de la caracterización de los genes implicados en suberina y cera biosíntesis12,13,14 ,15,16,17, monómero del suberin transporte Reglamento18 y transcripción19. El gen de la transferasa suberin feruloyl, FHT, es uno de estos genes biosintéticos caracterizados; su regulación a la baja da lugar a un fuerte deterioro de la protección de la peridermis, que se correlaciona con una disminución fuerte en ferulate ésteres de suberina y ceras en tubérculos de patata14. Concomitante, en raíces y semillas de Arabidopsis, el nocaut de su supuesta orthologue (ASFT/RWP1) también demostró su papel en la producción de ferulates Alquilo en suberina20,21. En Papa, la línea de reportero transcripcional FHT y el anticuerpo FHT demostraron respectivamente que se encuentran en la exodermis, endodermis, phellogen-derivados y en los tejidos heridos15la actividad del promotor y la proteína.
En este trabajo, detallamos un protocolo usando a. rhizogenes para producir transgénicas raíces peludas que se mantienen en una sesión de tipo salvaje, compuesto patata plantas generadoras o suprimido para crecer autónomamente en vitro. También ofrecemos el protocolo utilizando a. tumefaciens para obtener plantas de papa transgénicas completa. Como caso de estudio, a. rhizogenes y a. tumefaciens transformado con el mismo vector binario se utilizan para obtener las raíces con el promotor FHT conducción expresión de gen reportero GUS . Los resultados son registrados y comparados.
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Protocol
El protocolo de transformación de a. rhizogenes fue adaptado y modificado de cuerno et al7 y el genotipo probado fue S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). El protocolo de transformación de a. tumefaciens fue adaptado y modificado de Banerjee et al22 y los genotipos probados fueron S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) y S. tuberosum SSP. andigena. Los pasos principales de ambos procedimientos se resumen en la figura 1 y figura 2, respectivamente.
Nota: En todos los pasos del procedimiento realizar transferencias en vitro , hacerlo rápidamente y, cuando sea posible, mantener las placas o potes cerrados, minimizando así la exposición de la planta al aire para evitar el marchitamiento y la contaminación. Indique lo contrario, todas las incubaciones de planta se realizaron en gabinetes en las condiciones de 12 h de luz/12 h de 24 ° C 20 ° C oscuro y 67 μmol m-1 s-1. Indique lo contrario, llevar a cabo todas las bacterias manipulación de vitro planta transferencias y en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. Todas las recetas de medios de cultivos vegetales Agrobacterium y en vitro se proporcionan en la Tabla S1.
PRECAUCIÓN: Depositar todas las bacterias genéticamente modificadas y las plantas para el depósito de residuos apropiado.
1. culturas de Agrobacterium utilizadas para la transformación
Nota: La cepa empleada para la transformación de a. rhizogenes fue el C58C1:Pri15837 (proporcionado amablemente por el Dr. Inge Broer) y que para a. tumefaciens fue el GV2260 (proporcionado amablemente por el Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes se transformó con el vector binario PK7GWIWG2_II-ya sean (VIB-Departamento de Biología de sistemas de planta en Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) que contiene una T-DNA con un marcador de transformación para monitorear la raíz melenuda formación. Para comparar las raíces transformadas de a. rhizogenes y a. tumefaciens, ambos fueron transformados con la pKGWFS7 de vector binario que contiene un ADN de T lleva el promotor FHT conducir el gen reportero β-glucoronidase (GUS) y el gen de resistencia a kanamicina como marcador seleccionable15.
- Elegir una colonia de Agrobacterium y crecer durante la noche (O/N) en 5 mL de medio YEB suplementado con antibióticos (Tabla S1) en un tubo de centrífuga de 50 mL a 28 ° C con agitación a 200 rpm.
- Para la transformación de a. tumefaciens , medir la densidad óptica, que debe ser OD600 = 0.6-1.0.
- Si la densidad óptica es superior, realizar un subcultivo bajando a OD600 = 0.3 con medios frescos y espere hasta que la cultura llegue a OD600 = 0.6-1.
- Centrifugar 1 mL de cultivo de Agrobacterium a 3.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a temperatura ambiente.
- Quite el sobrenadante mediante pipeteo y resuspender las células en 1 mL de medio YEB fresco sin antibióticos. Repita este paso para asegurar la eliminación completa de los antibióticos.
- Para la transformación de a. tumefaciens , en la resuspensión último añadir el volumen adecuado de YEB para obtener una densidad óptica final de OD600 = 0.8.
- Mantener las células en hielo mientras se preparan las plantas infectadas.
2. material para la transformación de la planta
- Hacer uno o dos esquejes de tallo de nodo ya sea con el apical o los brotes auxiliares de estéril en vitro patata plantas (donante); crecen en medio sólido 2MS en macetas de 3 a 4 semanas (figura 1A y figura 2A).
3. planta de transformación con a. rhizogenes (figura 1)
Nota: Este procedimiento permite la obtención de raíces pilosas transformadas. Para evaluar la expresión del transgen, se necesita un control negativo. Para preparar el control negativo, siga el procedimiento utilizando una cepa de a. rhizogenes transformaciones o transformadas con el vector vacío que incluye el gen marcador de transformación.
- Utilizar placas de medio fresco; por otra parte, las placas pueden conservarse a 4 ° C con el lado de la tapa, bien selladas con la película transparente para evitar la deshidratación de los medios de comunicación. Para preparar las placas de medios cuadrados, pendiente a ~ 15°, 40 mL de MS, se llenan y deje solidificar. Esto reducirá al mínimo el contacto de la parte aérea de la planta con el medio.
- Transferencia muy cuidadosamente una planta donante desde el medio de 2MS a una placa cuadrada de 120 x 120 mm.
- Inyectar a la un madre entrenudo 3 μL de la cultura de a. rhizogenes utilizando una aguja quirúrgica y repetirlo dos veces por planta de entrenudos diferentes cuando sea posible.
Nota: Considerar cada inyección como un evento de transformación independientes (figura 1B). - Transferir inmediatamente la planta entera a una placa cuadrada con sólida MS suplementado con 0,1 mM acetosiringona. Capacidad para 2 plantas por placa.
Nota: La solución stock de 1 M acetosiringona está preparada en DMSO y puede ser almacenada a-20 ° C. - Selle la placa con cinta quirúrgica y organizar verticalmente dentro de un gabinete de crecimiento durante 4 días.
- Transferencia de la planta a un nuevo plato cuadrado con medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL] a . rhizogenes.
- Después de 10-12 días, las raíces pilosas empezarán a aparecer (figura 1,D 1). A continuación, suprimir las raíces nativas de la planta y la planta de transferencia a un nuevo plato cuadrado con medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL].
Nota: Raíces peludas transformadas pueden comprobarse por fluorescencia roja cuando se utiliza un marcador de transformación DsRed (figura 3D). - Para obtener una planta compuesta (Figura 1E), permita que las raíces pilosas transgénicas crecen durante 3-4 semanas en medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL] (cambiar el medio cada semana).
- Según el propósito, difundir las raíces pilosas transgénicas y los controles negativos como sigue.
- Transferencia de la planta entera compuesta para un cultivo hidropónico (Tabla S2) o medio de suelo para permitir un desarrollo masivo.
- Para propagar individualmente las raíces pilosas transformadas, con un bisturí corta las raíces que expresan el marcador rojo transformación fluorescente (proteína DsRed) cuando son 4-8 cm de largo (Figura 1E) y transferirlas a una placa Petri con medio sólido Gamborg B5 suplementado con 2% sacarosa y cefotaxime sódico [500 μg/mL]. Sellar las placas con película de plástico de laboratorio y crecer en la oscuridad a 20 ° C.
Nota: Las raíces pueden ser manipuladas bajo un estereomicroscopio equipado para detectar la fluorescencia bajo condiciones estériles (véase Tabla de materiales). - Para la producción de biomasa (es decir, análisis de expresión génica), cortar una raíz de 5 cm largo peludo y propagar en un erlenmeyer de 150 mL con 20 mL de Gamborg B5 líquido suplementado con 2% sacarosa y cefotaxime sódico [500 μg/mL]. Crecer durante 6 semanas en la oscuridad a 20 ° C y 60 rpm.
Figura 1: Línea de tiempo para obtener patatas transgénicas raíces pilosas con a. rhizogenes. Se muestran las semanas acumuladas para llegar a cada etapa del proceso de transformación y los pasos subsiguientes para crecer las raíces pilosas. Muestran imágenes representativas de diferentes etapas: la iniciación del proceso con 3 semanas de edad en vitro de las plantas (A), entonces la infección de las plantas mediante la inyección de a. rhizogenes (B), la formación de la proliferativa tejido (C, flechas) con raíces peludas emergentes (D) y las raíces pilosas desarrolladas expresar el marcador de la transformación fluorescente rojo DsRed (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. planta de transformación con a. tumefaciens (figura 2)
Nota: Este procedimiento permite la obtención de plantas transformadas. Para evaluar el efecto del transgén, se necesita un control negativo. Una opción es seguir el procedimiento con una a. tumefaciens transformadas con el vector vacío. Alternativamente, pueden utilizarse las plantas de tipo silvestre.
- Corte y coloque una hoja de las plantas 3-4 semanas de edad (figura 2A) en una placa Petri. Con un bisturí excluir el peciolo y realizar cortes transversales (1-3 dependiendo del tamaño de la hoja) desde el centro de la hoja en los bordes evitando cortarlos apagado (figura 2B).
- Coloque la hoja flotando en 10 mL de 2 ms fresco medios líquidos en caja Petri con el lado abaxial inmediatamente y cerrar la placa. Repita el paso con capacidad hasta 15 hojas de CV Désirée y 25 hojas para SSP. unndigena (dependiendo del tamaño de la hoja).
- Inmediatamente añadir 80 μl del cultivo de a. tumefaciens a OD600 = 0,8 en los medios líquidos y homogeneizar la placa manualmente durante 1 minuto para la distribución de la solución bacteriana.
- Cuidadosamente sellar con lacre de la película, cubrir con papel de aluminio e Incube por 2 días en una cámara a 24 ° C dejar que la transformación ocurra.
- Transferir las hojas manteniendo lado abaxial hasta medio CIM (figura 2B) e incube durante una semana en un gabinete de crecimiento.
- Raspe el medio CIM con las pinzas para que las hojas se pueden acomodar mejor en los medios de comunicación.
- Transferir las hojas manteniendo lado abaxial hasta medio SIM (figura 2) e Incube en un crecimiento del gabinete, refrescante al medio cada 7-10 días, hasta que los brotes son unos 2 cm de altura.
- Raspe el medio SIM con las pinzas para que las hojas pueden ser completamente rodeadas por los medios de comunicación. Cuando los brotes emergidos a la tapa, trabajar con altura de Petri (100 x 20 mm, altura x diámetro).
Nota: El callo se formará después de 2-3 semanas en medio de SIM (Figura 2D) y los brotes después 6-7 semanas (Figura 2E). Los brotes se considerarán como eventos independientes transformación cuando emergen de callo formado a partir de heridas independiente.
- Raspe el medio SIM con las pinzas para que las hojas pueden ser completamente rodeadas por los medios de comunicación. Cuando los brotes emergidos a la tapa, trabajar con altura de Petri (100 x 20 mm, altura x diámetro).
- Corte tres brotes emergido de cada callo (considerado como el evento mismo de la transformación) (Figura 2E), para frascos de cultivo con medio de MG suplementados con Cefotaxima sódica [250 mg/L] para permitir la transferencia de enraizamiento, etiqueta el subconjunto con un número y Incubar en un crecimiento del gabinete para 3-4 semanas o hasta que los brotes son vigorosos (figura 2F).
Nota: Cuando corte los brotes, eliminar bien el callo de lo contrario la raíz no se formará.- Repetir tantas veces como líneas independientes son necesarias. Hasta 5 transformación diferentes eventos se pueden colocar en un matraz de cultivo con un diámetro de 8 cm para trabajar en la plena confianza que no se mezclan las plantas de diferentes eventos.
- Seleccione la planta más vigorosa de cada evento, cortar el segmento apical de los brotes con entrenudos 3-4 y colocarlo en un nuevo frasco de cultura con 2 ms suplementado con Cefotaxima sódica [250 mg/L].
Nota: En 3-6 semanas que la planta crecerá de forma eficiente, desarrollando una sesión vigorosa y raíces.- Traer de vuelta a la cámara de los brotes no seleccionados hasta que la planta seleccionada ha desarrollado completamente.
- Cortar segmentos de tallo de la planta con mínimo un entrenudo o con la yema apical y transferirlos a nuevo medio de 2 ms suplementado con cefotaxima [250 mg/L]. Les Incube en el gabinete de crecimiento.
- Repetir cada 3-4 semanas para establecer las líneas en vitro transformado.
Nota: La Cefotaxima sódica es necesaria en al menos tres las transferencias posteriores al medio de 2MS para asegurarse para matar al de a. tumefaciens; Luego, si se observa un crecimiento excesivo de a. tumefaciens , transferir las plantas otra vez a 2MS medios suplementados con Cefotaxima sódica.
- Repetir cada 3-4 semanas para establecer las líneas en vitro transformado.
- Para caracterizar el fenotipo de la planta, transferencia de plantas al suelo para su caracterización completa o al cultivo de hidroponía para la inspección de la raíz.
- Mantener los tubérculos producidos en suelo para propagar y mantener las líneas establecidas.
Figura 2: Línea de tiempo para obtener patatas transformadas plantas utilizando a. tumefaciens. Se muestran las semanas acumuladas para llegar a cada etapa del proceso de transformación y los pasos subsiguientes para crecer las plantas. Muestran imágenes representativas de diferentes etapas: la iniciación del proceso utilizando las hojas de 3 - semanas de edad en vitro las plantas (A), el traslado de los heridos y los infectados deja a los medios CIM (B), las hojas cuando transfiere a Medio SIM (C), la visualización de las callosidades alrededor de las áreas heridas después de 2-3 semanas en los medios de comunicación (D), la formación sesión después 9-11 semanas en medios SIM (E) y los brotes después de ser trasladado a los medios de comunicación MG (F) SIM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. cultivo hidropónico cultivo
- Preparar solución de Hoagland a una fuerza media (0,5 x) (Tabla S2) en un cubo de 10 L.
- Sumerja una bomba de acuario para mantener la homogeneidad y las condiciones de oxígeno adecuado.
- Cubren las paredes de la cubeta con papel de aluminio para crecer las raíces en condiciones de oscuridad.
- Evitando el daño de la raíz, la transferencia en vitro plantas para cultivo hidropónico.
Nota: Retire cualquier resto medio en vitro de raíces para evitar la proliferación de microorganismos durante la incubación agitando cuidadosamente las raíces sumergidas en agua. - Cubrir las plantas con la película transparente como un invernadero para permitir una aclimatación adecuada e Incube en el cuarto de crecimiento.
- Hacer agujeros en la película después de 3 días y quitar completamente una semana después.
- Reemplazar con medio fresco cada 10 días.
6. ensayo de genética de reportero histoquímica de GUS
Nota: En nuestro caso el GUS se realizó análisis con raíces de 2 a 3 semanas en hidroponía o in vitro.
- Fijar las raíces con acetona al 90% frío (v/v) e incubar durante 20 minutos en hielo.
- Realizar dos lavados con agua destilada.
- Añadir GUS fresco, coloración de la solución (tabla 1) y aplique vacío (-70 Pa) durante 20 minutos.
- Incubar a 37 ° C en oscuridad para proteger al GUS fotosensible durante 4 horas o hasta que aparezca un color azul.
Nota: La presencia de ferri y ferrocianuro en solución de GUS minimizar la difusión de productos de la reacción y proporcionar una ubicación más precisa.
PRECAUCIÓN: Utilice una campana de humos y usar ropa protectora al manipular los derivados tóxicos de cianuro en la solución de GUS (Ferricianuro de potasio y de ferrocianuro de potasio). El sustrato de GUS y el material de desecho deberán ser eliminados con seguridad. - Retire la solución de tinción GUS y descartar en contenedores apropiados.
- Realizar dos lavados con etanol 70% (v/v).
- Observar bajo un microscopio de campo brillante.
Nota: GUS la coloración es estable por varias semanas; sin embargo, durante la primera semana, la señal de GUS es claro y menos a las vecinas las células difunde. Para un almacenaje más largo, sellar el tubo y almacenar a 4 ° C.
Tabla 1: Receta de solución tinción GUS.
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Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -mediada por la transformación de la papa
En este manuscrito, se presenta el procedimiento paso a paso para obtener raíz transformada con a. rhizogenes . Figura 1 presenta un resumen del procedimiento, que en conjunto toma alrededor de 5-6 semanas (de la inyección de a. rhizogenes para obtener raíces peludas completamente desarrolladas). Entonces, la planta puede ser estudiada como un compuesto (sesión de tipo salvaje, raíz de transgénico) o la raíz melenuda transgénica clones pueden ser suprimidos y cultivados autónomamente en medio Gamborg B5 sólido suplementado con sacarosa al 2%. Alternativamente, las raíces pilosas pueden ser masivamente propaga utilizando el medio de Gamborg B5 líquido. El procedimiento presentado se ha realizado con S. tuberosum spp tuberosum (CV Désirée).
El método para monitorear el procedimiento y para obtener patatas las raíces pilosas transgénicas ha sido validado usando un vector binario con la DsRed como un marcador de transformación (PK7GWIWG2_II-ya sean de VIB-Departamento de Biología de sistemas de planta en Universiteit Gent). Esto permitió la distinción de raíces pilosas transgénicas no transgénicas por la fluorescencia roja. Según eso, en la figura 3 las raíces pilosas transformadas exhiben fluorescencia roja cuando se ilumina con la luz verde. El control negativo utilizando la transformadas Agrobacterium no demostró ninguna fluorescencia roja (figura 3), General que indica la idoneidad de la pistola de transformación DsRed para identificar las raíces pilosas transgénicas (figura 3D). Otros marcadores de transformación tales como resistencia a los antibióticos pueden utilizarse según lo descrito por otros autores23,24; sin embargo, los antibióticos en los medios de comunicación pueden producir un retraso en el crecimiento de raíces transgénicas que contienen el marcador.
Figura 3: Fluorescentes transgénicas peludas raíces de papa (variedad Désirée) transformadas por a. rhizogenes. Las raíces pilosas se obtuvieron utilizando un no-transformado a. rhizogenes (cepa C58C1: pRI1583) (A y C) y con a. rhizogenes (cepa C58C1:pRI1583) transformadas con el vector vacío pK7GWIWG2_II-rojo-raíz llevando un Marcador de la transformación DsRed (B y D). Se forman las raíces pilosas en ambas infecciones (A, B) pero fluorescencia roja es sólo observado en raíces peludas transformadas con la a. rhizogenes , que contiene el vector binario. Las imágenes fueron tomadas con un estereomicroscopio equipado con una lámpara y un filtro específico para visualizar la fluorescencia roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tumefaciens de la agrobacteria -mediada por la transformación de la papa
El segundo protocolo se describe en este manuscrito está configurado para obtener paso a paso, una planta completa de papa transformada con a. tumefaciens. Figura 2 presenta un resumen del procedimiento, que toma en conjunto entre 15-18 semanas (infección de la hoja con a. tumefaciens a la obtención de plantas completamente regeneradas). La parte más desperdiciadora de tiempo del procedimiento es la regeneración de plantas por organogénesis. Este paso en particular hace que este método sea más laborioso que el uso de a. rhizogenes. El procedimiento se ha realizado con S. tuberosum spp tuberosum (CV Désirée) y S. tuberosum SSP. andigena, la antigua ser menos dependiente de las condiciones de días cortos para inducir la tuberización.
En a. tumefaciens-transformación mediada, en contraste con el a. rhizogenes -mediado transformación, las plantas regeneradas son organismos transgénicos completamente. Sin embargo, aunque las plantas transgénicas se regeneran en un medio selectivo de kanamicina, no todas las líneas expresan eficientemente el transgén. Por lo tanto, es necesaria la validación de la expresión del transgén.
Comparación de la actividad de promotor FHT en raíces obtenidos mediante A. tumefaciens y a. rhizogenes
Los procedimientos antes mencionados se aplicaron para producir raíces expresando el gen GUS bajo el promotor del gen FHT . La completa transformado plantas con a. tumefaciens fueron previamente divulgados15, utilizando el pKGWFS7 de vector binario que contiene el promotor FHT . Ahora, este vector binario se ha utilizado para producir nuevas raíces peludas transformadas para comparar los tejidos donde el promotor está activo y por lo tanto para probar el sistema de raíz melenudo como una herramienta para estudiar la activación del promotor.
La figura 4 muestra GUS manchas en las raíces de las plantas transgénicas obtenidas por a. tumefaciens (Figura 4AB) y las raíces pilosas transgénicas obtenidas por a. rhizogenes (figura 4D, E, F), respectivamente. Como puede verse, las raíces transformaron con a. tumefaciens y crecido en vitro muestran coloración azul en el endodermis (Figura 4A), una capa de células entre la corteza y el cilindro vascular. En los más desarrollados las raíces, la etiqueta azul es desigual en la capa externa corresponde a la exodermis (Figura 4B). En raíces peludas transformadas cultivadas en hidroponía, el marcador GUS fue localizado específicamente en el endodermis (figura 4E), en el surgimiento de raíces laterales (figura 4E), en las áreas heridas (figura 4E ) y en la exodermis (figura 4F). Las raíces no mostró ninguna mancha de GUS en controles negativos que eran bien peludas raíces sin las raíces de cassette o de tipo salvaje de PromFHT:GUS T-ADN.
Figura 4: Observación histoquímica de las raíces de la patata transgénica expresando el gen reportero GUS impulsado por el promotor de FHT. Las raíces de las plantas transgénicas completas obtenidas por azul de mostrar de la transformación (A-B) de a. tumefaciens (S. tuberosum SSP. andigena) tinción en el (A) de endodermis y exodermis (B). Las raíces pilosas transgénicas obtenidas por a. rhizogenes (S. tuberosum SSP. tuberosum CV Désirée) transformación (C-F) mostrar a tinción GUS en el endodermis (C y E), en la raíz lateral aparición (D y E), en la zona de cicatrización (E) y en la exodermis (F). Endodermis (EN); Exodermis (EX); Xilema (XL); Primordios de raíz lateral (LR). La flecha roja indica el área herido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla S1: Recetas de medios de comunicación utilizan para crecimiento bacterias y en vitro plantas. Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla
Tabla S2: Solución de media fuerza Hoagland para el cultivo de plantas de papa en hidroponía. Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla
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Discussion
En Papa, el sistema más común para obtener plantas transgénicas completas estables utiliza la transformación por cepas de Agrobacterium tumefaciens que requieren organogénesis con fitohormonas exógenas. Aunque los protocolos de Agrobacterium base tiene el potencial para integrar el vector T-DNA secuencia25, esta metodología es aún más fácil y menos costoso para transformar plantas de patata. Durante los últimos años, el interés en a. rhizogenes-transformación mediada ha conseguido la atención de los investigadores que permita obtener las raíces transgénicas en períodos más cortos que el uso de a. tumefaciens. A. rhizogenes conserva el plásmido (Ri) inductores de raíz que lleva un conjunto de genes que codifican las enzimas para la biosíntesis fitohormona auxina citocinina y control y codificación para opina26. Una vez que el Ri T-ADN se inserta en el ADN genómico de host, el nuevo equilibrio hormonal desregula las células infectadas inducen la formación de raíces de proliferación, llamado las raíces pilosas, emergentes en los puntos de infección27. Cuando un vector binario adicional se utiliza para la integración de un ADN extraño, la preservación del plásmido Ri confiere la posibilidad de obtener raíces peludas transformadas sin la necesidad de la organogénesis con fitohormonas exógeno aplicado28. Las raíces pilosas pueden mantenerse conectado a la sesión de tipo salvaje generando una planta compuesta o pueden ser auto propagadas. Esta capacidad de las raíces pilosas al uno mismo-propagar está siendo explotada para producir en las raíces pilosas de varias plantas como un sistema biológico para producir metabolitos valiosos o proteínas extrañas, generando intereses en farmacia y fitorremediación incluso áreas ( Ver informe29,30). En Papa (var. Kufri Bahar), plantas transgénicas completas fueron infectadas con la cepa de a. rhizogenes de tipo salvaje para producir raíces pilosas expresar la Hepatitis B antígenos de superficie (HBsAg)23. Como alternativa, puede obtener una planta transgénica completa regenerada a partir de raíces pilosas, pero planta de papa y tubérculos mostraron un desarrollo distinto en comparación con los controles no transformados. Estas diferencias en el fenotipo son debido al original Ri T-ADN integrado en el genoma31,32.
En este trabajo, los procedimientos detallados para obtener transgénicos estable raíces pilosas con a. rhizogenes y plantas transgénicas estables utilizando a. tumefaciens se presentan (figura 1 y figura 2). Se obtuvieron las raíces peludas transgénicas totalmente desarrolladas en 5-6 semanas, mientras las raíces transgénicas utilizando a. tumefaciens necesario 15-18 semanas debido al requisito de la organogénesis de las células transformadas y la selección y propagación de plantas transformadas. En nuestras manos, el procedimiento de transformación de a. tumefaciens trabaja eficientemente en S. tuberosum SSP. andigena y SSP. tuberosum (CV Désirée), con una eficiencia de transformación divulgado alrededor de 35%22 y 48% 12, respectivamente. El descrito procedimiento de transformación de a. rhizogenes es basado en lo reportado por cuerno7, que demostró una alta (80-100%) eficiencia de transformación en la variedad Désirée y otras variedades de tres Papa (Albatros, Sabina y Saturna).
Presentar a. rhizogenes como un sistema alternativo de transformación para el Papa los estudios funcionales y para indicar que si la presencia inicial de Ri T-DNA fue motivo de preocupación, utilizamos ambos sistemas para transformar las raíces de la patata con el mismo binario vector contiene un ADN de T con un promotor de un gen de biosíntesis de suberina (FHT) conduce la expresión del gen reportero GUS . El análisis histoquímico reveló que en a. tumefaciens transformó las plantas, la actividad del promotor FHT en las capas suberized interiores y exteriores de las raíces (endodermis y exodermis, respectivamente) (Figura 4A,B ) y también en las áreas de heridas de la hoja, tallo y tubérculo15. En las raíces pilosas a. rhizogenes transformado, la actividad también fue detectada en la endodermis y exodermis y en las áreas de heridas de la raíz (figura 4E). La co-ocurrencia de la actividad de promotor de suberina en ambos tipos de raíces transformadas indica que la Ri integrado T-ADN no afecta a los procesos de desarrollo relacionados con la suberization por lo menos en estos tejidos de la raíz. En raíces transformadas de peludo también detectamos actividad del promotor FHT en las áreas que rodean la aparición de las raíces laterales (figura 4,E). Esto coincide con la actividad de promotor por otros genes implicados en el transporte de monómeros de suberina como ABCG11 / WBC1133,34,35,36 o el regulador de StNAC103 19. la transformación de la papa por a. rhizogenes para estudiar un gen suberin ya ha sido reportada recientemente37 y también en ese caso peludas raíces han permitido demostrar la activación del promotor de CYP86A33, un ácido graso Ω-hidroxilasa. Sin embargo, GUS tinción de raíces fue a granel cuantificado utilizando un ensayo fluorométrico, por lo tanto, sólo se presume la expresión específica en los tejidos suberized.
En conjunto estos resultados evidencia que a. rhizogenes transformación una herramienta alternativa más para explorar la activación del promotor específicas del tipo celular de genes relacionados con la suberina en las raíces, que pueden extenderse a estudios basados en otros procesos que se producen en las raíces. De acuerdo, algunos otros estudios genéticos funcionales han tenido éxito en el uso de a. rhizogenes en Papa, tomate y eucalipto para demostrar el gen función6,7,8,9, para el estudio de la respuesta hormonal38,39 o el promotor actividad40,41. Sin embargo, esta estrategia todavía puede presentar limitaciones, especialmente cuando se estudian procesos de desarrollo firmemente controlado que pueden ser desregulados por Ri T-ADN o cuando la planta entera o los tubérculos u otros órganos diferentes de raíces quieren estudiarse. En estas situaciones, el sistema de transformación de a. tumefaciens es aún recomendado:.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, beca FPI para PB), el Ministerio de Economía y Competitividad, FEDER fondos (36725 AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) y la Universidad de Girona (beca de doctorado a SF y grant SING11/1). Los autores agradecemos al Dr. Inge Broer (Instituto para el uso de la tierra, Universidad de Rostock, Rostock, Alemania) y Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, España) a. rhizogenes y la cepa de a. tumefaciens , respectivamente y el Dr. Marçal Soler y el Dr. Anna Plasencia por la ayuda y el apoyo recibido en la iniciación de los experimentos de transformación de a. rhizogenes (Universidad Toulouse III Paul Sabatier, CNRS, laboratorio de investigación de planta (LRSV), Castanet Tolosan, Francia). Los autores agradecen a Sara Gómez (Departamento de biología, UdG, Girona) por su valiosa asistencia en la realización del trabajo de laboratorio y cuidar de las plantas y Ferran Fontdecaba y Carla Sánchez quien ayudó con algunos de los experimentos mientras que estaban haciendo sus proyectos final de carrera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
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