Summary
Здесь мы представляем два протокола для преобразования растений картофеля. Agrobacterium tumefaciens преобразование приводит к полной трансгенных растений в то время как Agrobacterium rhizogenes производит трансгенных волосатые корни в стрелять дикого типа, который может быть самостоятельной распространенный. Мы затем обнаружить промоутер активность GUS пятнать в преобразованной корни.
Abstract
Agrobacterium sp. является одним из наиболее широко используемых методов для получения трансгенных растений, поскольку он имеет возможность передачи и интегрировать свой собственный T-ДНК генома растений. Здесь мы представляем два преобразования систем генетически изменить растений картофеля (Solanum tuberosum). В A. tumefaciens трансформации зараженные листья, трансформированных клеток выбираются и новый полный преобразованные завод генерируется с использованием фитогормонов в 18 недель. A. rhizogenes трансформации стебли зараженных инъекционных бактерии с помощью иглы, новых появившихся преобразованные волосатые корни обнаруживаются с помощью маркера красных флуоресцентных и корни-трансформированных удаляются. В 5-6 недель результатом завод представляет собой совокупность дикого типа стрелять с полностью развитой преобразованные волосатые корнями. Для увеличения биомассы, преобразованные волосатые корни можно подакцизным и распространяются самостоятельно. Мы применяли оба методы трансформации Agrobacterium -опосредованной получить корни, выражая GUS Репортер ген обусловлен промоутера суберин биосинтетических генов. GUS пятная процедуру предоставляется и позволяет ячейки локализации промоутер индукции. В обоих методах корни преобразованные картофеля показал, что окрашивание в suberized эндодермы и exodermis и Кроме того, а. rhizogenes преобразован корни активность GUS GUS был также обнаружен в появление боковых корней. Эти результаты показывают, что а. rhizogenes может быть быстро альтернативных инструментом для изучения генов, которые выражаются в корни.
Introduction
Помимо экономических интересов поколение трансгенных растений имеет свою собственную значимость в исследованиях продемонстрировать конечной функции генов и лучше понять физиологии растений и развития. Наиболее широко используемый метод для растений ДНК вставки Agrobacterium-опосредованной трансформации. Agrobacterium tumefaciens способен генерировать Корона галлов в инфицированных тканях многих видов растений под действием его опухоль заставить плазмида (Ti). Плазмида содержит область T-ДНК с набором генов, которые будут интегрированы в генома растений и побудить ткани дифференцировке1,2. Обмен этих генов в T-ДНК, трансген позволила поколения изменения конкретных растений, избегая Фенотипическая воздействию3. Для облегчения трансген, клонирование в T-ДНК, регионе T-ДНК был вырезан в независимой плазмида, называемый двоичной плазмида, а остальные гены плазмида Ti были (генов вирулентности, которые позволяют механизмы передачи и вставки T-ДНК) помещены в вспомогательный плазмиды. Для исследования в области биотехнологии растений, преобразование A. tumefaciens имеет ряд преимуществ: она не нужны дорогие устройства, способен генерировать как завод стабильного и переходных преобразований, так и небольшого числа генов, копии интегрированы в хромосома4. Однако для большинства растений, но не арабидопсиса, поколение стабильной трансформантов требует регенерации растений из одного или нескольких клеток с помощью экзогенных фитогормонов, делая этот процесс трудоемкий и требует много времени. A. rhizogenes также возможность изменения генома растений, производства волосатые корни или придаточных корней на сайтах инфекции из-за экспрессию генов рол ( локусовкорень), закодированы в плазмиду вызывая корень (Ri)5. Хотя менее изучены чем A. tumefaciens, а. rhizogenes также используется для получения трансгенных корни. В этом случае, а rhizogenes содержит оригинальные T-ДНК в Ри плазмиды и двоичные плазмида с второй T-ДНК, перевозящих трансген. Когда сайт инфекции в стеблях или гипокотиля, композитный растений могут быть получены, с новой волосатые трансгенных корнями, переживших побеги дикого типа. В качестве альтернативы волосатые преобразованные корни могут расти автономно в пробирке в СМИ с входными данными источника углерода. Использование A. rhizogenes вместо A. tumefaciens производить трансгенной ткани приобретает актуальность, когда корень является органом-мишенью, потому что завод регенерации не требуется, и следовательно это быстрее и менее дорогостоящим. Предыдущие исследования показали эту методологию, ассигнованных для фенотипические характеристики корневого конкретные гены6,,78,9.
Картофеля (Solanum tuberosum) является четвертым наиболее важных сельскохозяйственных культур в мире согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (ФАО), поскольку клубень имеет питания актуальность для потребления человеком за то, что является хорошим источником витаминов и минералов. По этой причине картофель был помещен в центре внимания сельскохозяйственной биотехнологии и также считается хорошим биологической модели для генетических и развития исследований в10,11. Значительный вклад в понимание молекулярных механизмов базовой suberized тканей через характеристика генов, участвующих в суберин и воск биосинтез12,13,14 трансформации картофеля ,,1516,17, суберин мономера транспорт18 и транскрипции правила19. Суберин feruloyl трансферазы генов, FHT, является одним из этих характеризуется биосинтетических генов; его Даунрегуляция порождает сильное ухудшение Перидерма защиты, которая коррелируется с сильным снижением ferulate эфиры суберин и воски в клубни картофеля14. Одновременно в корни и семена Arabidopsis, нокаут своего предполагаемого orthologue (ASFT/RWP1) также продемонстрировал свою роль в производить алкиловые ferulates в суберин20,21. В картофеля линии репортер transcriptional FHT и антитела FHT показал соответственно что промоутер активность и белка расположены в exodermis, эндодермы, phellogen производные и раненых тканей15.
В этой работе мы подробно протокол с помощью A. rhizogenes для производства трансгенных волосатые корней, которые поддерживаются в дикого типа стрелять, генерации растений композитный картофеля или вырезан самостоятельно выращивать в пробирке. Мы также предоставляем протокол, используя A. tumefaciens для получения полного трансгенные картофель растений. В качестве тематического исследования а. rhizogenes и A. tumefaciens преобразована с же бинарный вектор используются для получения корни с FHT промоутер вождения ГАС репортер экспрессии генов. Результаты сообщили и сравнить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. rhizogenes протокол преобразования был адаптирован и изменения из рога et al.7 и тестирование генотипа был S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ). A. tumefaciens преобразования протокола был адаптирован и изменения Банерджи et al.22 и генотипов испытания были S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Дезирэ) и S. tuberosum ssp. andigena. Основные этапы обеих процедур резюмируются в Рисунок 1 и 2, соответственно.
Примечание: На всех этапах процедуры, выполнение переводов в vitro сделать это быстро и когда это возможно, поддерживать пластин или горшки закрыты, таким образом минимизируя завод воздействия воздуха, чтобы избежать загрязнения и увядания. Не указано иное, все растение инкубаций были сделаны в шкафах в условиях 12 h 24 ° C свет/12 h 20 ° C темной и 67 мкмоль m-1 s-1. Иное, выполняют все бактерии манипуляции и в vitro растений трансферы в асептических условиях ламинарных капюшоном. Все рецепты СМИ для посева и в пробирке растительных культур приведены в Таблице S1.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Хранение всех генетически модифицированных бактерий и растений для выделенных контейнер для отходов.
1. Agrobacterium культур, используемых для преобразования
Примечание: Штамм, используемый для преобразования A. rhizogenes был C58C1:Pri15837 (любезно предоставлены доктором Инге Broer) и что для A. tumefaciens был GV2260 (любезно предоставлены доктором Salomé Прат). A. rhizogenes был преобразован с бинарный вектор PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-кафедра биологии растений в Гент Universiteit; http://gateway.psb.ugent.be), содержащий T-ДНК перевозящих преобразования маркера для мониторинга волосатые корень формирование. Для сравнения преобразованных корни, а. rhizogenes и A. tumefaciens, оба были преобразованы с бинарный вектор pKGWFS7, который содержит T-ДНК, перевозящих FHT промоутер, вождение репортер гена β-glucoronidase (GUS) и канамицин сопротивления ген как выбирается маркер15.
- Выберите колонии Agrobacterium и вырастить его на ночь (O/N) в 5 мл YEB среды с антибиотиками (Таблица S1) в 50 мл пластиковых пробирок на 28 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
- Для преобразования A. tumefaciens , измерения оптической плотности, которая должна быть ОД600 = 0,6-1,0.
- Если оптическая плотность выше, сделать субкультуры, опустив ее в ОД600 = 0,3 с свежими СМИ и ждать до тех пор, пока культура достигает600 OD = 0,6-1.
- Центрифуга 1 мл Agrobacterium культуры на 3000 x g в центрифугу скамейка Топ 10 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант, закупорить и Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежего YEB среды без антибиотиков. Повторите этот шаг, чтобы обеспечить полное удаление антибиотиков.
- A. tumefaciens трансформации, в прошлом ресуспендирования добавить соответствующий объем YEB для получения окончательного оптическая плотность OD600 = 0,8.
- Держите клетки на льду при подготовке растения, чтобы быть заражены.
2. растительный материал для преобразования
- Сделать один или два узла стволовых черенками либо содержащие апикальной или вспомогательные почки от стерильного в vitro растений картофеля (доноров растения); выращивать их в средне твердой 2MS в горшках для 3-4 недели (рис. 1A и 2A рисунок).
3. завод преобразования с помощью A. rhizogenes (рис. 1)
Примечание: Эта процедура позволяет получать преобразованные волосатые корней. Чтобы вычислить выражение трансген, отрицательный контроль необходим. Подготовить отрицательный контроль, следуйте процедуре, с помощью штамма A. rhizogenes непреобразованной или преобразованы с пустой вектор, который включает преобразования маркера гена.
- Использовать свежие СМИ пластины; Кроме того плиты может храниться при температуре 4 ° C с крышкой стороной вверх, плотно закрытой с прозрачной пленкой, чтобы избежать обезвоживания СМИ. Подготовить квадратный СМИ пластины, раздвиньте их ~ 15°, заливка с 40 мл МС и пусть они затвердевают. Это позволит свести к минимуму контакт воздушной части завода с носителя.
- Передавать очень тщательно доноров завод от среднего 2MS квадратные пластины 120 x 120 мм.
- Привнести в один стебель internode 3 мкл культуры а. rhizogenes , с помощью иглы хирургические и повторить его два раза в завод в различных междоузлий, когда это возможно.
Примечание: Рассмотрим каждой инъекции как независимое преобразование событие (рис. 1B). - Передавать сразу весь завод квадратные пластины с твердой питательной MS, дополняется acetosyringone 0,1 мм. Разместиться 2 растения на пластину.
Примечание: 1 M acetosyringone Стоковый раствор готовится в ДМСО и может храниться при температуре-20 ° C. - Печать пластину с помощью хирургическая лента и организовать его по вертикали внутри шкафа рост на 4 дня.
- Передача завода на новой площади пластины с MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл] убить а. rhizogenes.
- После 10-12 дней волосатые корни начнут появляться (рис. 1 c,1 D). Затем акцизный Родные корни растения и передать завод на новой площади пластины с MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл].
Примечание: Преобразованная волосатые корни могут проверяться красной флуоресценции при использовании DsRed преобразования маркера (рис. 3D). - Для получения составного завод (Рисунок 1E), пусть трансгенных волосатые корни расти на 3-4 недели в среде MS дополнена Цефотаксим натрия [500 мкг/мл] (изменить носитель каждую неделю).
- В зависимости от цели распространение трансгенных волосатые корни и негативный контроль как следовать.
- Передача всей композитный завод гидропонных (Таблица S2) или почвенной среды для массивных развития.
- Индивидуально, распространять преобразованный волосатые корни, с помощью скальпеля отрезать корни, выражая красной флуоресцентной преобразования маркера (DsRed белок) когда они длиной 4-8 см (Рисунок 1E) и перенести их в чашке Петри с твердой питательной Gamborg B5 дополнен с 2% сахарозы и Цефотаксим натрия [500 мкг/мл]. Уплотнение пластины с пластиковой Лаборатория фильм и вырастить их в темноте при температуре 20 ° C.
Примечание: Корни можно манипулировать под стереомикроскопом, оборудованных для обнаружения флуоресценции в стерильных условиях (см. Таблицу материалы). - Для производства биомассы (т.е. анализ выражения гена) сократить длинный волосатая корень 5 см и распространять ее в 150 мл колбу Эрленмейера с 20 мл жидкой среды Gamborg B5 с 2% сахарозы и Цефотаксим натрия [500 мкг/мл]. Растут на 6 недель в темноте при 20 ° C и 60 об/мин.
Рисунок 1: Временная шкала для получения картофельного трансгенных волосатые корни, с использованием а. rhizogenes. Показаны совокупные недель для достижения каждого этапа процесса трансформации и последующие шаги расти волосатые корни. Представитель изображения различных этапов изображены: начало процесса с использованием 3-недели старый в vitro растений (A), затем инфекции растений путем инъекций A. rhizogenes (B), формирование пролиферативных ткани (C, стрелки) с возникающих волосатые корни (D) и развитых волосатые корни, выражая красной флуоресцентной преобразования маркера DsRed (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. завод преобразования с помощью A. tumefaciens (рис. 2)
Примечание: Эта процедура позволяет получать трансформированных растений. Чтобы оценить эффект трансген, отрицательный контроль необходим. Одним из вариантов является следовать процедуре, с помощью A. tumefaciens преобразована с пустой вектор. В качестве альтернативы можно использовать растения дикого типа.
- Вырезать и поместите лист из 3-4-недельных растений (рисунок 2A) в чашку Петри. С помощью скальпеля исключить черешок и поперечных разрезов (1-3 в зависимости от размера листьев) от центра листа к краям, избегая отрезав их (рис. 2B).
- Сразу же месте листа, плавающей на 10 мл свежего 2MS жидких сред в чашке Петри с abaxial стороной вверх и закройте пластины. Повторите шаг, вмещающий до 15 листьев для cv. Дезирэ и 25 листья для ssp.ndigena (в зависимости от размера листьев).
- Сразу же добавить 80 мкл A. tumefaciens культуры в ОД600 = 0,8 в жидких средах и гомогенизации пластины вручную за 1 мин распространить бактериальных решение.
- Тщательно печать с пленки для запайки, накрыть алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 2 дней в камере при 24 ° C для преобразования происходят.
- Передача листья, сохраняя abaxial стороне до среднего CIM (рис. 2B) и инкубировать их на одну неделю в росте кабинета.
- Скрип среднего CIM с помощью пинцета, так что листья могут лучше разместиться на средства массовой информации.
- Передача листья, сохраняя abaxial стороне до среднего SIM (рис. 2 c) и инкубировать их в рост кабинета, освежающий носитель каждые 7-10 дней, до тех пор, пока побеги, около 2 см в высоту.
- Царапать среднего SIM с помощью пинцета, так что листья могут быть полностью окружен средств массовой информации. Когда возникла побеги достигают крышку, работать с высокими Петри (100 x 20 мм, высота х диаметр).
Примечание: После 2-3 недели в SIM среднего (Рисунок 2D) и побеги после 6-7 недель (Рисунок 2E) составят каллуса. Побеги будет рассматриваться в качестве независимых преобразования события, когда они выходят из каллуса образуются из независимых раны.
- Царапать среднего SIM с помощью пинцета, так что листья могут быть полностью окружен средств массовой информации. Когда возникла побеги достигают крышку, работать с высокими Петри (100 x 20 мм, высота х диаметр).
- Вырезать три стреляет возникла из каждого каллуса (считается один и то же событие преобразования) (Рисунок 2E), передачи их культуры колбы с мг средний дополнена Цефотаксим натрия [250 мг/Л] чтобы болеть, ярлык подмножество с номером и Инкубируйте в росте, кабинет для 3-4 недели или до тех пор, пока побеги являются энергичные (Рисунок 2F).
Примечание: Когда резка побеги, удалить также каллуса иначе корень будет не образуют.- Повторите столько раз, как независимые линии необходимы. До 5 различных преобразований события могут быть размещены в колбе культуры с диаметром 8 см для работы в полной уверенности, что растения из разных событий не смешиваются.
- Выберите наиболее энергичных завод каждого события, вырезать апикальной сегмент стрелять с 3-4 междоузлий и поместите его в новой культуры колбу с 2MS среднего дополнена Цефотаксим натрия [250 мг/Л].
Примечание: В 3-6 недель, что растение будет расти эффективно, разработке энергичной стрелять и корни.- Вернуть к камере невыбранных побеги до тех пор, пока завод выбран полностью разработаны.
- Вырезать сегменты ствола от завода с по крайней мере один между узлами или верхушечный бутон и передавать их на новый носитель 2MS дополнена Цефотаксим [250 мг/Л]. Инкубируйте их в кабинет роста.
- Реплицируйте каждые 3-4 недель для установления линии в vitro превращается.
Примечание: Цефотаксим натрия необходима в по меньшей мере три последующие переводы 2MS средний чтобы убить A. tumefaciens; Впоследствии если наблюдается разрастание A. tumefaciens , передать растения снова 2MS СМИ дополнена Цефотаксим натрия.
- Реплицируйте каждые 3-4 недель для установления линии в vitro превращается.
- Характеризовать завод фенотип, передачи растений в почву для их полной характеризации или культуре гидропоники для корня инспекции.
- Держите клубни в почве распространять и поддерживать установленные линии.
Рисунок 2: Сроки для получения картофеля преобразован растений с использованием A. tumefaciens. Показаны совокупные недель для достижения каждого этапа процесса трансформации и последующие шаги для выращивания растений. Представитель изображения различных этапов изображены: начало процесса с использованием листья от 3 - неделя старый в vitro растений (A), передача раненых и зараженные листья в CIM СМИ (B), листья при передаче СИМ СМИ (C), Визуализация каллуса вокруг раненых области после 2-3 недели в СМИ (D) SIM, формирование стрелять после 9-11 недель в SIM СМИ (E) и побеги после перевода мг СМИ (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. гидропонные культуры
- Приготовляют раствор Хоугланд половину численности (0.5 x) (Таблица S2) в ведро 10 Л.
- Погружайте в аквариум насос для поддержания однородности и условий надлежащего кислорода.
- Покрывают стены ведро с алюминиевой фольгой расти корни в условиях темноты.
- Во избежание повреждения корневой, передачи в vitro растений в культуре гидропоники.
Примечание: Удалите любые оставшиеся средства в пробирке из корней, чтобы избежать распространения микроорганизмов во время инкубации встряхнув тщательно корни в воде. - Обложка растений с прозрачной пленки как glasshouse чтобы адекватные акклиматизации и инкубировать в рост палата.
- Сделайте отверстия в фильме после 3 дней и удалить его полностью через одну неделю после.
- Замените свежим СМИ каждые 10 дней.
6. ГАС гистохимические Репортер ген пробирного
Примечание: В нашем случае ГУС был проведен анализ с корнями 2-3 недель, выращенных в гидропоники или в пробирке.
- Исправьте корни ацетоном (v/v) 90% охлажденной и проинкубируйте его за 20 минут на льду.
- Выполняют два мойки с дистиллированной водой.
- Добавить свежие ГАС, окрашивание раствора (Таблица 1) и применить вакуум (-70 Па) за 20 мин.
- Инкубируйте при 37 ° C в темноте, чтобы защитить фоточувствительные GUS за 4 ч или до тех пор, пока синий цвет является видимым.
Примечание: Присутствие и Ферри - Ферроцианид в ГАС решение свести к минимуму распространение продуктов реакции и обеспечивают более точной локализации.
Предупреждение: Использовать вытяжной шкаф и носить защитную одежду при обработке токсичных цианида производные в растворе гусь (калия Гексацианоферрат и Ферроцианид калия). GUS субстрата и утилизации материала должны быть удалены безопасно. - ГУСЬ, окрашивание раствора снимите и выбросьте его в соответствующие контейнеры.
- Выполняют два мойки с этанол 70% (v/v).
- Наблюдать под микроскопом светлые области.
Примечание: ГСУ окрашивание является стабильным в течение нескольких недель; Однако в течение первой недели, GUS сигнал ясно и рассеивает меньше на соседние клетки. Для более длительного хранения печать трубки и хранить при 4 ° C.
Таблица 1: GUS окрашивание решения рецепт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -опосредованной трансформации картофеля
В этой рукописи представлена пошаговая процедура для получения преобразованного корень с A. rhizogenes . На рисунке 1 представлен обзор процедуры, которая вообще занимает около 5-6 недель (от инъекций A. rhizogenes для получения полностью развитых волосатые корни). Затем растение можно изучать как композитный (дикого типа стрелять, трансгенных корень) или трансгенных волосатые корень клоны могут быть вырезана и самостоятельно выращенные в твердой питательной Gamborg B5 с 2% сахарозы. Кроме того волосатые корни можно массово распространяться с помощью жидких сред Gamborg B5. Процедуры, представленные был проведен с S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Дезирэ).
Метод, чтобы контролировать процедуру и получить картофеля трансгенных волосатые корни протестирован с помощью бинарный вектор с DsRed как преобразования маркера (PK7GWIWG2_II-RedRoot от VIB-кафедра биологии растений на Universiteit Гент). Это позволило различие трансгенных волосатые корни от не трансгенных по красной флуоресценцией. Согласно этому на рисунке 3 преобразованные волосатые корни выставлены красной флуоресценции при освещении с зеленым светом. Отрицательный контроль с использованием непреобразованной Agrobacterium показал не красной флуоресценции (рис. 3 c), общий, указывающее пригодности DsRed преобразования маркера для идентификации трансгенных волосатые корни (рис. 3D). Другие преобразования маркеров например антибиотикам может быть использован как описаны другие авторы23,24; Однако антибиотики в СМИ может производить задержки роста трансгенных корни, содержащий маркер.
Рисунок 3: Флуоресцентные трансгенных волосатые корни картофеля (cv. Дезирэ) преобразован а. rhizogenes. Волосатые корни были получены с помощью-трансформированных A. rhizogenes (штамм C58C1: pRI1583) (A и C) и с а. rhizogenes (штамм C58C1:pRI1583) преобразована с проведения pK7GWIWG2_II-красный-корень пустой вектор DsRed преобразования маркера (B и D). Волосатые корни образуются в обеих инфекций (A, B), но красной флуоресценцией является только наблюдаемые в волосатые корни преобразована с а. rhizogenes , содержащее бинарный вектор. Изображения были взяты с стереомикроскопом оснащен лампой и определенный фильтр для визуализации красной флуоресценцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Agrobacterium tumefaciens -опосредованной трансформации картофеля
Второй протокол, описанный в этой рукописи настроена для получения, шаг за шагом, полный картофеля завод преобразован с A. tumefaciens. На рисунке 2 представлен обзор процедуры, которая вообще принимает между 15-18 недель (от заражения листьев с A. tumefaciens для получения полной регенерации растений). Наиболее трудоемкой частью процедуры является завод регенерации органогенеза. Данный шаг делает этот метод более трудоемкий, чем при использовании A. rhizogenes. Процедура была проведена с S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Дезирэ) и S. tuberosum ssp. andigena, бывший менее зависимый от short-day условий побудить клубнеобразование.
В A. tumefaciens-опосредованной трансформации, в отличие от A. rhizogenes -опосредованной трансформации, регенерированный растения являются полностью трансгенных организмов. Однако хотя трансгенных растений восстанавливаются в канамицин селективного СМИ, не все линии эффективно выразить трансген. Следовательно необходима проверка трансген выражения.
Сравнение FHT промоутер активности в корни, полученные с помощью A. tumefaciens и а. rhizogenes
Вышеупомянутые процедуры были применены производить корни, выражая GUS гена под промоутер FHT гена. Полный преобразован растения с A. tumefaciens были сообщалось ранее15, используя бинарный вектор pKGWFS7 содержащий промоутер FHT . Теперь, этот бинарный вектор был использован производить новые преобразованные волосатые корни для сравнения в тканях где промоутер активен и поэтому для проверки волосатые корневой системы как инструмента для изучения промоутер активации.
Рисунок 4 показывает, гусь, Окрашивание корней трансгенных растений полученных A. tumefaciens (рис. 4AB) и трансгенных волосатые корни, полученные A. rhizogenes (рис. 4 cD, E, F), соответственно. Как можно видеть, корни преобразована с A. tumefaciens и выращивать в пробирке Показать голубое окрашивание эндодермы (Рисунок 4A), слоя клеток между корой и стелы. В более развитых корней, синей маркировки пятнистый в наружный слой, соответствующий exodermis (рис. 4В). В преобразованной волосатые корни, выращенных в гидропонике GUS маркер был специально в эндодермы (Рисунок 4 cE), в становлении боковые корни (Рисунок 4 dE), в районах, находящихся раненых (Рисунок 4E ) и в exodermis (Рисунок 4F). Корни, показан не ГАС пятно в негативных элементов управления, которые были либо волосатые корни без кассеты или дикого типа корни PromFHT:GUS T-ДНК.
Рисунок 4: Гистохимические наблюдения трансгенные картофель корней выражения гена репортера ГАС , движимый промоутер FHT. Корни от полного трансгенных растений, полученных A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) трансформации (A-B) шоу голубой окраски в эндодермы (A) и exodermis (B). Трансгенные волосатые корни, полученные A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. Дезирэ) трансформации (C-F) отображения ГАС пятнать в эндодермы (C и E), в корне боковой появление (D и E), в зоне заживление (E) и exodermis (F). Эндодермы (EN); Exodermis (EX); Ксилема (XL); Примордия бокового корня (LR). Красная стрелка указывает области раненых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица S1: Рецепты СМИ используется для растущего бактерии и в vitro растений. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу
Таблица S2: Половина силы Хоугланд решение для выращивания растений картофеля в гидропонике. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В картофеля наиболее распространенной системой для получения стабильной полный трансгенных растений использует преобразование Agrobacterium tumefaciens штаммов, которые требуют органогенеза с помощью экзогенных фитогормонов. Хотя у Agrobacterium на основе протоколов имеет потенциал, чтобы интегрировать вектор не T-ДНК последовательность25, эта методология еще простой и менее дорогой для преобразования растений картофеля. В последние годы интерес к A. rhizogenes-опосредованной преобразования получил внимание исследователей для позволяя для получения трансгенных корни в более короткие сроки, чем использование A. tumefaciens. A. rhizogenes по-прежнему сохраняет корень заставить плазмида (Ri), осуществляет набор генов, кодирующих ферменты для биосинтеза управления и цитокининов ауксинов фитогормона и кодирования для высказывает мнение26. После того как T-ДНК ри вставляется в принимающей геномной ДНК, новый гормональный баланс отпускает инфицированных клеток, вызывая формирование пролиферирующих корней, называется волосатые корни, возникающих в пунктах27инфекции. Когда дополнительные двоичные вектора используется для интеграции иностранных ДНК, сохранение ри плазмида предоставляет возможность получения преобразованной волосатые корни без необходимости органогенез, используя фитогормоны экзогенно прикладной28. Волосатые корни могут поддерживаться придает стрелять дикого типа, создания составного завод или может быть самостоятельной распространенный. Эта способность волосатые корни самостоятельно распространять эксплуатируется производить в нескольких волосатые корни растений как биологическая система для серийного ценные метаболитов или инородные белки, генерации интересы в фармацевтике и даже фиторемедиации областей ( Смотреть для рассмотрения29,30). В картофеля (var. куфри Bahar) полный трансгенных растений были инфицированы дикого типа A. rhizogenes штамма производить волосатые корни, выражая гепатита B поверхностные антигены (HBsAg)23. Кроме того полный трансгенных растений, регенерироваться из волосатые корни могут быть получены, но картофельный растений и клубней показал собственный развития по сравнению с непреобразованной элементов управления. Эти различия в фенотипе, благодаря оригинальной ри T-ДНК интегрированы в геном31,32.
В этой работе подробные процедуры для получения трансгенных стабильной волосатые корни, используя A. rhizogenes и стабильной трансгенных растений, используя A. tumefaciens представлены (рис. 1 и рис. 2). Полностью разработанные трансгенных волосатые корни были получены в 5-6 недель, а трансгенные корней с помощью A. tumefaciens необходимо 15-18 недель из-за требования органогенеза от трансформированных клеток и отбор и распространение трансформированных растений. В наших руках процедура преобразования A. tumefaciens эффективно работает в S. tuberosum ssp. andigena и ssp. tuberosum (cv. Дезирэ), с эффективностью сообщил трансформации около 3522 и 48% 12, соответственно. Описанные A. rhizogenes преобразования процедура основана на этом сообщает рога7, который показал высокий (80-100%) эффективность преобразования в cv. Дезирэ и другие три картофеля сорта (Альбатрос, Сабина и Saturna).
Представить A. rhizogenes качестве альтернативного преобразования системы для картофеля функциональные исследования и указать, используется ли озабоченность вызывает первоначальный присутствие ри T-ДНК, мы обе системы для преобразования картофеля корни с той же бинарный вектор содержал T-ДНК с промотором гена биосинтетических суберин (FHT) вождение экспрессии гена репортера GUS . Гистохимический анализ показал, что в A. tumefaciens преобразован растений, активность FHT промоутер в внутренний и внешний suberized слои корней (эндодермы и exodermis, соответственно) (рис. 4A,B ), а также в области раненых листьев, стебля и клубней15. В A. rhizogenes преобразован волосатые корни деятельности был также обнаружен в эндодермы и exodermis и раненых корневой районах (Рисунок 4E). Совместного наступления суберин промоутер активности в обоих типах преобразованные корни указывает, Ри интегрированных T-ДНК, не влияющих на процессы развития, связанных с опробкование по крайней мере в этих тканях корня. В преобразованном волосатые корни мы также обнаружен активность FHT промоутер в районах вокруг появление боковых корней (Рисунок 4 d,E). Это согласуется с деятельностью промоутер, сообщает других генов, участвующих в перевозках суберин мономеров, таких как ABCG11 / WBC1133,34,,3536 или регулятор StNAC103 19. трансформации картофеля, а. rhizogenes для изучения суберин ген уже сообщалось недавно37 и также в этом случае волосатые корни позволили показать промоутер активации CYP86A33, жирные кислоты Ω-гидроксилазы. Однако гусь, Окрашивание корней массовых количественно с помощью флуориметрический пробирного, поэтому только предположить конкретное выражение в suberized тканях.
В целом эти результаты доказательства того, что а. rhizogenes трансформации быстрее альтернативный инструмент для изучения конкретного типа промоутер активации клеток суберин связанных генов в корни, которые может быть распространена на исследования, основанные на других процессов происходят в корни. В соглашении некоторые другие функциональные генетические исследования были успешными в использовании A. rhizogenes картофеля, помидоров и Эвкалипт продемонстрировать гена функции6,,78,9, учиться 38,гормональной реакции39 или40,активность промоутер41. Однако эта стратегия может по-прежнему представляют ограничения, особенно при изучении жестко контролируется развития процессов, которые могут быть дерегулирование, Ри T-ДНК или когда весь завод или клубни или других органов отличается от корней хотят быть изучены. В таких ситуациях A. tumefaciens трансформации системы до сих пор предпочтение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Ministerio de Innovación y науки (AGL2009-13745, ИПИ Грант для PB), y Ministerio де Economía развитию и ФЕДЕР финансирования (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) и Жиронского университета (доктор Грант SF, и Грант SING11/1). Авторы благодарны доктором Инге Broer (Институт землепользования, университета г. Росток, Росток, Германия) и доктор Salomé Прат (Centro Nacional де биотехнология, Мадрид, Испания) для обеспечения а. rhizogenes и A. tumefaciens деформации, соответственно и доктор Marçal Солер и д-р Анна Plasencia за помощь и поддержку, полученную в инициировании трансформации экспериментов A. rhizogenes (Университет Тулуза III Поль Сабатье — CNRS, завод лабораторных исследований (LRSV), Castanet Толозан, Франция). Авторы благодарят Сара Гомес (Кафедра де Biologia, UdG, Жирона) за ее ценную помощь в проведении лабораторных работ и забота о растений и Ferran Fontdecaba и Карла Санчес, который помогал с некоторыми из экспериментов, в то время как они делают свои окончательные дипломных проектов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
