Summary
Her presenterer vi to protokoller for å transformere potet planter. Agrobacterium tumefaciens transformasjonen fører til en komplett transgene plante mens Agrobacterium rhizogenes produserer transgene hårete røtter i vill type skyte kan selv overført. Vi oppdager promoter aktivitet av GUS flekker i transformert røttene.
Abstract
Agrobacterium sp. er en av de mest brukte metodene for å få transgene planter som har evnen til å overføre og integrere sine egne T-DNA i anlegget genom. Her presenterer vi to transformasjon systemer for å endre genetisk potet (Solanum tuberosum) planter. I A. tumefaciens transformasjon, bladene er infisert, forvandlet cellene er valgt og en ny fullstendig forvandlet anlegg genereres med phyto-hormoner i 18 uker. I A. rhizogenes transformasjon stammer er infisert av sprøytebruk bakterier med en nål, nye fremkom transformert hårete røttene registreres med en rød fluorescerende markør og ikke-transformert røttene er fjernet. I 5-6 uker er resulterende anlegget sammensatt av en vill type skyte med fullt utviklet transformert hårete røtter. For å øke biomasse, kan transformert hårete røttene forbrukeravgift og selv overført. Vi brukt både Agrobacterium -mediert transformasjon metoder for å få røtter uttrykke GUS reporter genet drevet av en suberin biosyntetiske genet promoter. GUS flekker prosedyren er gitt og lar den celle lokaliseringen av arrangøren induksjon. I både metoder viste transformert potet røttene GUS flekker i suberized endodermis og exodermis, og i tillegg A. rhizogenes forvandlet røtter GUS aktiviteten ble også oppdaget i fremveksten av lateral røtter. Disse resultatene tyder på at A. rhizogenes kan være en rask verktøy å studere gener som er uttrykt i røtter.
Introduction
Bortsett fra økonomiske interesser har generering av transgene planter sin egen relevans i forskning å demonstrere den ultimate funksjonen av gener og å bedre forstå Fræna og utvikling. Mest brukte metoden for plante DNA innsettingspunktet er Agrobacterium-mediert transformasjon. Agrobacterium tumefaciens er kjøpedyktig utvikle crown galls i infiserte vev av mange plantearter av sin svulst-inducing (Ti) plasmider. Plasmider inneholder en T-DNA region med et sett av gener som vil bli integrert i anlegget genomet og indusere vev dedifferentiation1,2. Utveksling av disse genene i T-DNA av av transgene har tillatt generasjonen av bestemt plante modifikasjoner unngå fenotypiske effekter3. For å lette transgene kloning i T-DNA, regionen T-DNA har vært forbrukeravgift i en uavhengig plasmider kalt en binær plasmider, mens resten av genene for Ti plasmider (virulens-genene at T-DNA overføring og innsetting mekanismer) har vært plassert i en hjelper plasmider. For bioteknologi planteforskning transformasjon av A. tumefaciens har flere fordeler: det trenger ikke dyre enheter, stand til å generere både stabil og forbigående anlegget transformasjon, og lave antall genet kopier er integrert i det Kromosom4. Men for de fleste planter, men ikke Arabidopsis, krever generasjonen av stabil transformants anlegget gjenfødelse fra én eller noen få celler ved hjelp av eksogene phyto-hormoner, gjør denne prosessen arbeidskrevende og tidkrevende. A. rhizogenes er også endre anlegget genomet, produsere hårete røtter eller adventivskudd røtter på infeksjon steder på grunn av uttrykket av rol (roten loci) gener kodet i rot-inducing (Ri) plasmider5. Selv om mindre studert enn A. tumefaciens, er A. rhizogenes også brukt for å få transgene røtter. I dette tilfellet inneholder A. rhizogenes den opprinnelige T-DNA i Ri plasmider og en binær plasmider med en andre T-DNA bærer av transgene. Når webområdet infeksjon er i stammer eller hypocotyls, kan en sammensatt plante oppnås, med ny hårete transgene røtter fremvoksende fra vill type skudd. Alternativt, hårete transformert røtter kan vokse selvstendig i vitro i media med karbon kilde innganger. Bruk av A. rhizogenes i stedet for A. tumefaciens å produsere transgene vev er å få relevans når roten er målet orgel, fordi anlegget gjenfødelse er ikke nødvendig og derfor er det raskere og mindre kostnadskrevende. Tidligere studier har vist denne metodikken bevilget for fenotypiske karakterisering av rot, bestemte gener,6,,7,,8,,9.
Potet (Solanum tuberosum) er den fjerde viktigste avlingen i verden ifølge Food and Agriculture Organization av FN (FAO) siden tuber har ernæringsmessige relevans for menneskelig konsum for å være en god kilde til vitaminer og mineraler. Derfor potet er plassert i søkelyset for landbruksprodukter bioteknologi og også regnes som en god biologiske modell for genetiske og utviklingsmessige studier10,11. Potet transformasjon bidratt betydelig til forståelsen av molekylære mekanismer underliggende suberized vev gjennom karakterisering av gener involvert i suberin og voks biosyntesen12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 og transkripsjon regulering19. Suberin feruloyl transferase genet, FHT, er en av disse preget biosyntetiske genene; downregulation gir opphav til en sterk svekkelse av periderm beskyttelse, som er forbundet med en kraftig nedgang i ferulate estere av suberin og voks i potet knoller14. Samtidig, i røtter og frø av Arabidopsis vist fortrengingen i sin antatte orthologue (ASFT/RWP1) også sin rolle i å produsere alkyl ferulates i suberin20,21. I potet viste FHT transcriptional reporter linjen og FHT antistoffer henholdsvis at arrangøren aktiviteten og protein er plassert i exodermis, endodermis, phellogen-derivater og såret vev15.
I dette arbeidet detalj vi en protokoll bruke A. rhizogenes å produsere transgene hårete røtter som vedlikeholdes i en vill type skyte, genererer sammensatt potet planter eller forbrukeravgift for å vokse selvstendig i vitro. Vi tilbyr også protokollen bruker A. tumefaciens for å få komplett transgene potet planter. Som en casestudie brukes A. rhizogenes og A. tumefaciens forvandlet med samme binære vektoren til å få røtter med FHT arrangøren kjøring GUS reporter genuttrykk. Resultatene rapporteres og forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. rhizogenes transformasjon protokollen ble tilpasset og endret Horn et al.7 og genotype testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens transformasjon protokollen ble tilpasset og endret fra Banerjee et al.22 og genotyper testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena. De viktigste trinnene i begge prosedyrer oppsummeres i figur 1 og figur 2, henholdsvis.
Merk: Alle trinnene i fremgangsmåten utfører i vitro overføringer, gjøre det raskt og når opprettholde plater eller Potter lukket, således minimere anlegget eksponering til luft å unngå wilting og forurensning. Annet er oppgitt, ble alle anlegg incubations gjort i skap under vilkår av 12 h 24 ° C lys/12 h 20 ° C mørke og 67 µmol m-1 s-1. Annet er oppgitt, utføre alle bakterier manipulasjon og i vitro anlegget overføringer i aseptiske forhold i laminær strømning hette. Alle medier oppskrifter for Agrobacterium og i vitro anlegget kulturer er gitt i Tabellen S1.
Forsiktig: Sette inn alle genmodifiserte bakterier og planter appropriated avfallsbeholderen.
1. Agrobacterium kulturer brukes for transformasjon
Merk: Påkjenningen brukes for A. rhizogenes transformasjon ble C58C1:Pri15837 (vennlig levert av Dr. Inge Broer) og for A. tumefaciens var GV2260 (vennlig levert av Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes ble forvandlet med binære vektoren PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Institutt for plante Systems Biology på UGent, http://gateway.psb.ugent.be) som inneholder en T-DNA bærer merketråd transformasjon for å overvåke hårete roten formasjon. Hvis du vil sammenligne transformert røttene generert av A. rhizogenes og A. tumefaciens, ble begge forvandlet med binære vektor-pKGWFS7 som inneholder en T-DNA bærer FHT arrangøren kjøring β-glucoronidase (GUS) reporter genet og Kanamycin motstand genet som en valgbar markør15.
- Velg en koloni av Agrobacterium og vokse den natten (O/N) i 5 mL av YEB medium med antibiotika (Tabell S1) i et 50 mL sentrifuge rør på 28 ° C med skjelvende på 200 rpm.
- For A. tumefaciens transformasjon, måle optisk densitet, som må være OD600 = 0.6-1.0.
- Hvis optisk densitet er høyere, gjør en subkultur senke den til OD600 = 0,3 med fersk media og vent til kultur når OD600 = 0,6-1.
- Sentrifuge 1 mL av Agrobacterium kultur på 3000 x g i en benk toppen centrifuge for 10 min ved romtemperatur.
- Fjerne nedbryting av pipettering og resuspend celler i 1 mL av fersk YEB medium uten antibiotika. Gjenta dette trinnet for å sikre fullstendig fjerning av antibiotika.
- Legg riktig YEB volumet for å få en endelig optisk tetthet OD600 for A. tumefaciens transformasjon, i den siste rørets = 0,8.
- Holde celler på is klargjøring plantene er infisert.
2. plantemateriale for transformasjon
- Gjør ett eller to noden stilk borekaks enten som inneholder apikale eller Aux knoppene fra sterilt i vitro potet planter (donor planter); vokse dem i solid 2MS medium i potter for 3 til 4 uker (figur 1A og figur 2A).
3. plante transformasjon bruker A. rhizogenes (figur 1)
Merk: Denne prosedyren kan oppnå transformert hårete røtter. For å evaluere transgene uttrykket, kreves en negativ kontroll. For å forberede kontrollen negative, følger du fremgangsmåten bruker en A. rhizogenes belastning enten transformeringsinstruksjonene eller forvandlet med Tom vektoren som inkluderer transformasjon markør genet.
- Bruke friske media platene. Alternativt kan platene holdes på 4 ° C med lokk side opp, tett forseglet med gjennomsiktige filmen å unngå media dehydrering. For å forberede kvadrat media platene, stigning dem ~ 15°, fyll med 40 mL MS, og la dem stivne. Dette vil minimere kontakt av antenne delen av anlegget med mediet.
- Overføre nøye en donor plante fra 2MS mediet til en 120 x 120 mm firkantet plate.
- Injisere til en stilk internode 3 μL av A. rhizogenes kultur bruker en kirurgisk nål og gjenta det to ganger per plante i forskjellige internodes når det er mulig.
Merk: Vurdere hver injeksjon som en uavhengig transformasjon hendelse (figur 1B). - Overføre umiddelbart hele anlegget til en firkantet plate med solid MS medium med 0,1 mM acetosyringone. Plass 2 planter per plate.
Merk: 1 M acetosyringone lager løsningen er utarbeidet i DMSO og kan lagres på 20 ° C. - Seal platen med kirurgisk tape og ordne det vertikalt innenfor en vekst kabinett for 4 dager.
- Overføre anlegget til en ny firkantet plate med MS medium med cefotaxime natrium [500 µg/mL] å drepe A. rhizogenes.
- Etter 10-12 dager starter hårete røtter vises (figur 1 c,1 D). Deretter avgiftsdirektoratet innfødt røttene av anlegget og overføre anlegget til en ny firkantet plate med MS medium med cefotaxime natrium [500 µg/mL].
Merk: Transformert hårete røtter kan kontrolleres av røde fluorescens når du bruker en DsRed transformasjon markør (figur 3D). - For å få et sammensatt anlegg (figur 1E), la transgene hårete røttene vokse i 3-4 uker i MS medium med cefotaxime natrium [500 μg/mL] (endre mediet hver uke).
- Avhengig av formålet, overføre transgene hårete røttene og negative kontroller som følger.
- Overføre hele sammensatte anlegget til en hydroponic (Tabell S2) eller jord medium for å gi enorme utviklingen.
- Individuelt overføres transformert hårete røttene, ved hjelp av en skalpell kuttet røtter uttrykke røde fluorescerende transformasjon markøren (DsRed protein) når de er 4-8 cm lang (figur 1E) og overføre dem i en Petriskål med solide Gamborg B5-middels supplert med 2% sukrose og cefotaxime natrium [500 μg/mL]. Seal platene med plast laboratorium film og dyrke dem i mørket på 20 ° C.
Merk: Røttene kan manipuleres under et stereomicroscope utstyrt for å oppdage fluorescens under sterile forhold (se Tabell for materiale). - For biomasse produksjon (dvs. gene expression analyse), kuttet en 5 cm lange hårete rot og spre den i et 150 mL Erlenmeyer kolbe med 20 mL Gamborg B5 flytende medium med 2% sukrose og cefotaxime natrium [500 µg/mL]. Vokse det 6 uker i mørket på 20 ° C og 60 rpm.
Figur 1: Tidslinjen for å få potet transgene hårete røtter med A. rhizogenes. De kumulative uker å nå hvert trinn i transformasjonsprosessen og de påfølgende trinnene å vokse hårete røttene vises. Representant bilder av ulike stadier er avbildet: initiering av prosessen med 3-uke-gamle i vitro planter (A), deretter infeksjon av planter ved å injisere A. rhizogenes (B), dannelsen av den proliferativ vev (C, piler) med nye hårete røtter (D), og utviklet hårete røtter uttrykke røde fluorescerende transformasjon markøren DsRed (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. plante transformasjon bruker A. tumefaciens (figur 2)
Merk: Denne prosedyren kan oppnå transformert planter. For å evaluere den transgene effekt, er en negativ kontroll nødvendig. Ett alternativ er å følge prosedyren bruker en A. tumefaciens forvandlet med Tom vektoren. Alternativt, vill type planter kan brukes.
- Skjær og Legg et blad fra 3-4-uke-gamle planter (figur 2A) i en Petriskål. Ved hjelp av en skalpell utelukke petiole og gjøre tverrgående kutt (1-3 avhengig blad) fra midten av bladet til kantene unngå avskjære dem (figur 2B).
- Umiddelbart plassere bladet flyter på 10 mL av fersk 2MS flytende medier i en Petriskål med abaxial side opp og lukke platen. Gjenta trinnet imøtekommende opptil 15 forlater cv. Désirée og 25 forlater ssp. enndigena (avhengig av blad størrelse).
- Straks legge 80 µL av A. tumefaciens kultur på OD600 = 0,8 i flytende media og homogenize platen manuelt i 1 min å distribuere bakteriell løsningen.
- Nøye tetning med tetting film og dekk med aluminiumsfolie for å ruge for 2 dager i et kammer på 24 ° C la transformasjon oppstår.
- Overføre bladene holder abaxial side til CIM medium (figur 2B) og ruge dem for en uke i en vekst kabinett.
- Skrape CIM mediet med pinsett slik at bladene kan tilpasses bedre på media.
- Overføre bladene holder abaxial side opp SIM medium (figur 2C) og ruge dem i en vekst skap, forfriskende mediet hver 7-10 dager til skuddene er ca 2 cm høy.
- Skrape SIM mediet med pinsett slik at bladene kan være helt omgitt av media. Når den dukket opp skudd når lokket, arbeide med høye Petri retter (100 x 20 mm, høyde x diameter).
Merk: Callus vil danne etter 2-3 uker i SIM medium (figur 2D) og skuddene etter 6-7 uker (figur 2E). Skuddene betraktes som uavhengige transformasjon hendelser når de dukker opp fra callus dannet fra uavhengige sår.
- Skrape SIM mediet med pinsett slik at bladene kan være helt omgitt av media. Når den dukket opp skudd når lokket, arbeide med høye Petri retter (100 x 20 mm, høyde x diameter).
- Kutt tre skudd dukket opp fra hver callus (som samme transformasjon hendelse) (figur 2E), overføre dem til kultur flasker med MG medium supplert med cefotaxime natrium [250 mg/L] for å tillate heie, merke delsettet med et tall og Inkuber en vekst regjering i 3-4 uker eller til skuddene er energisk (figur 2F).
Merk: Når skuddene, Fjern også callus ellers roten ikke vil danne.- Gjenta trinn så mange ganger som uavhengige linjer er nødvendig. Opp til 5 forskjellige transformasjon kan hendelser plasseres i en kultur bolle med en diameter på 8 cm til å arbeide i full tillit som planter fra ulike hendelser ikke blandes.
- Velg ivrigste anlegget Event, kuttet den apikale delen av skyte med 3-4 internodes og plassere den i en ny kultur bolle med 2MS medium med cefotaxime natrium [250 mg/L].
Merk: I 3-6 uker anlegget vil vokse effektivt, utvikler en livskraftige skyte og røtter.- Bringe tilbake til kammeret den ikke-valgte skudd til anlegget valgt har fullt utviklet.
- Skjær stilk segmenter av anlegget med minst én internode eller apikale bud og overføre dem til nye 2MS medium med cefotaxime [250 mg/L]. Inkuber dem i veksten kabinett.
- Replikere hver 3-4 uker for å opprette linjene i vitro forvandlet.
Merk: Cefotaxime natrium er nødvendig i minst tre påfølgende overføringer til 2MS medium å være sikker på å drepe A. tumefaciens; etterpå, hvis A. tumefaciens overvekst er observert, overføre plantene igjen til 2MS medier med cefotaxime natrium.
- Replikere hver 3-4 uker for å opprette linjene i vitro forvandlet.
- Betegner anlegget fenotypen, overføre planter jord for deres full analyse eller hydroponics kultur for rot inspeksjon.
- Hold den knoller produsert i jord å og opprettholde etablerte linjene.
Figur 2: Tidslinjen for å få potet forvandlet planter ved hjelp av A. tumefaciens. De kumulative uker å nå hvert trinn i transformasjonsprosessen og de påfølgende trinnene å vokse planter vises. Representant bilder av ulike stadier er avbildet: initiering av prosessen bruker blader fra 3 - uke gammel i vitro planter (en), overføring av den skadede og infiserte blader til CIM media (B), bladene når overført til SIM media (C), visualisering av callus rundt såret områder etter 2-3 uker i SIM medier (D), skyte dannelsen etter 9-11 uker i SIM media (E) og skuddene etter overføres til MG media (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. hydroponic kultur
- Forberede den Hoagland løsning på en halv styrke (0.5 x) (Tabell S2) i en 10 L bøtte.
- Legg et akvarium pumpe for å opprettholde homogenitet og riktig oksygen forhold.
- Dekk veggene i bøtte med aluminiumsfolie til røttene i mørke forhold.
- Unngå rot skade, overføre i vitro planter til hydroponic kultur.
Merk: Fjern eventuelle gjenværende i vitro medium fra røtter å unngå microorganism spredning under inkubasjonen ved risting nøye røttene nedsenket i vann. - Dekk planter med gjennomsiktige filmen som en glasshouse å tillate tilstrekkelig Akklimatisering og ruge i voksende kammeret.
- Lage hull i filmen etter 3 dager og fjerne den helt en uke etter.
- Erstatte med fersk media hver 10 dager.
6. GUS histochemical reporter genet analysen
Merk: I vårt tilfelle av GUS analyse ble gjennomført med røtter i 2-3 uker dyrket i hydroponics eller i vitro.
- Fastsette røttene med 90% kjølt aceton (v/v) og ruge det i 20 minutter på is.
- Utføre to vasker med destillert vann.
- Legge til friske GUS flekk løsning (tabell 1) og bruke vakuum (-70 Pa) for 20 min.
- Ruge på 37 ° C i mørk å beskytte den lysfølsomme GUS 4 h eller til blått er synlig.
Merk: Ferri - og ferrocyanide i GUS løsning redusere spredningen av reaksjon produkter og gir mer presis lokalisering.
FORSIKTIG: Bruk avtrekksvifte og bruk alltid beskyttelsesklær når du håndterer giftig cyanid derivater i GUS løsning (kalium ferricyanide og kalium ferrocyanide). GUS underlaget og salg materialet skal fjernes trygt. - Fjern GUS flekker løsning og kaste den i passende beholdere.
- Utføre to vasker med etanol 70% (v/v).
- Observere under lysende felt mikroskop.
Merk: GUS flekker er stabil for et par uker; men i løpet av første uken, GUS signalet er klart og diffunderer mindre til nabokommunene cellene. For lengre lagring, forsegle røret og lagre den på 4 ° C.
Tabell 1: GUS flekker løsning oppskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -mediert potet transformasjon
I dette manuskriptet presenteres fremgangsmåte som er konfigurert til å hente transformert rot med A. rhizogenes . Figur 1 viser en oversikt over prosedyren, som tar helt rundt 5-6 uker (fra injeksjon av A. rhizogenes å oppnå fullt utviklet hårete røtter). Deretter kan anlegget studeres som en sammensatt (wild type skyte, transgene rot) eller transgene hårete roten kloner kan forbrukeravgift og vokst selvstendig i solide Gamborg B5 medium med 2% sukrose. Alternativt, hårete røttene kan være massivt spres ved hjelp av flytende Gamborg B5 media. Prosedyren presentert er utført med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée).
Metoden overvåke prosedyren og hente potet transgene hårete røtter er validert ved hjelp av en binær vektor med DsRed som en transformasjon markør (PK7GWIWG2_II-RedRoot fra VIB-Institutt for plante Systems Biology på UGent). Dette tillot æren av transgene hårete røtter fra ikke-transgene av den røde fluorescensen. Det, i Figur 3 utstilt transformert hårete røttene røde fluorescens når opplyst med grønt lys. Negativ kontrollen med den transformeringsinstruksjonene Agrobacterium viste ingen røde fluorescens (Figur 3 c), total indikerer hensiktsmessigheten av DsRed transformasjon markøren å identifisere transgene hårete røttene (figur 3D). Andre transformasjon markører som antibiotikaresistens kan brukes som beskrevet av andre forfattere23,24; men kan antibiotika i media produsere en vekst forsinkelse i transgene røtter som inneholder markøren.
Figur 3: Fluorescerende transgene hårete røtter potet (cv. Désirée) forvandlet av A. rhizogenes. Hårete røttene ble hentet ved hjelp av en ikke-transformert A. rhizogenes (belastning C58C1: pRI1583) (A og C) og med A. rhizogenes (belastning C58C1:pRI1583) forvandlet etter tomme vektor pK7GWIWG2_II-rød-rot en DsRed transformasjon markøren (B og D). Hårete røttene er dannet i både infeksjoner (A, B) men røde fluorescens er bare observert i hårete røtter forvandlet A. rhizogenes som inneholder binære vektoren. Bildene ble tatt med en stereomicroscope utstyrt med en lampe og et spesifikt filter å visualisere den røde fluorescensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Agrobacterium tumefaciens -mediert potet transformasjon
Andre protokollen beskrevet i dette manuskriptet er konfigurert til å hente, trinn for trinn en komplett potet plante forvandlet A. tumefaciens. Figur 2 viser en oversikt over prosedyren, som helt tar mellom 15-18 uker (fra blad infeksjon med A. tumefaciens å oppnå fullt Spartments planter). Den mest tidkrevende delen av prosedyren er anlegget fornyelse av organogenesen. Denne spesielle trinnet gjør denne metoden mer arbeidskrevende enn å bruke A. rhizogenes. Prosedyren er utført med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena, det tidligere er mindre avhengig short-day forhold å indusere tuberization.
I A. tumefaciens-mediert transformasjon, i motsetning til den A. rhizogenes -mediert transformasjon, gjenskapte planter er helt transgene organismer. Imidlertid om transgene plantene genereres i en Kanamycin selektiv medier, uttrykke ikke alle linjene effektivt av transgene. Derfor er validering av transgene uttrykket nødvendig.
Sammenligning av FHT promoter aktiviteten i røttene får A. tumefaciens og A. rhizogenes
De nevnte prosedyrene ble brukt til å produsere røtter uttrykke GUS genet under bak FHT genet. Fullstendig forvandlet planter med A. tumefaciens var tidligere rapportert15, bruker binære vektor-pKGWFS7 som inneholder FHT arrangøren. Nå, denne binære vektoren er brukt til å produsere nye transformert hårete røtter å sammenligne vev hvor selskapet er aktiv og derfor å teste hårete rot systemet som et verktøy for å studere promoter aktivisering.
Figur 4 viser GUS farging i røttene av transgene planter innhentet av A. tumefaciens (figur 4AB) og transgene hårete røtter ved A. rhizogenes (figur 4CD, E, F), henholdsvis. Som kan sees, røtter forvandlet A. tumefaciens og dyrket i vitro viser blå flekker i endodermis (figur 4A), en celle lag mellom cortex og stele. Mer utviklet røtter, blå merking er usammenhengende i eksterne laget tilsvarende exodermis (figur 4B). I transformert hårete røtter dyrket i hydroponics, var GUS markøren spesielt ligger i endodermis (figur 4CE), i fremveksten av lateral røtter (Figur 4 dE), i de sårede områdene (figur 4E ) og exodermis (figur 4F). Røttene viste ingen GUS flekken negative kontroller som var enten hårete røtter uten PromFHT:GUS T-DNA kassett eller wild type røttene.
Figur 4: Histochemical observasjon av transgene potet røtter uttrykke GUS reporter genet drevet av arrangøren av FHT. Røttene fra transgene anlegg ved A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) transformasjon (A-B) viser blå flekker i endodermis (A) og exodermis (B). Transgene hårete røttene innhentet av A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. Désirée) transformasjon (C-F) Vis GUS flekker i endodermis (C og E) i laterale roten fremveksten (D og E), i sonen sårhelende (E) og exodermis (F). Endodermis (no); Exodermis (EX); Vedvev (XL); Primordia av en lateral rot (LR). Den røde pilen viser såret området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell S1: Media oppskrifter brukes for voksende bakterier og i vitro planter. Klikk her for å laste ned denne tabellen
Tabell S2: Halv styrke Hoagland løsning for voksende potet planter i hydroponics. Klikk her for å laste ned denne tabellen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I potet bruker vanligste systemet er å få stabile transgene anlegg transformasjonen av Agrobacterium tumefaciens stammer som krever organogenesen bruker eksogene phyto-hormoner. Selv om Agrobacterium basert protokollene har potensial til å integrere ikke-T-DNA vektor sekvens25, finnes denne metoden fortsatt den enkleste og billigere å transformere potet planter. Siste årene interessen A. rhizogenes-mediert transformasjon har oppmerksomheten til forskere for å la hente transgene røtter i kortere perioder enn å bruke A. tumefaciens. A. rhizogenes bevarer fortsatt rot-inducing (Ri) plasmider som bærer et sett av gener enzymer for phytohormone auxin kontroll og cytokinin biosyntesen-koding og koding for opines26. Når Ri T-DNA er satt inn i verten genomisk DNA, deregulates den nye hormonell balansen av infiserte celler indusere dannelsen av voksende røtter, kalt hårete røtter, dukker opp på points infeksjon27. Når en ekstra binære vektor brukes for å integrere en utenlandsk DNA, gir bevaring av Ri plasmider muligheten til å få transformert hårete røtter uten behov for organogenesen med exogenously brukte phyto-hormoner28. Hårete røttene kan vedlikeholdes festet til vill type skyte genererer en sammensatt plante eller kan være selvstendig overført. Denne evnen av hårete røtter selv overføres utnyttes for å produsere i flere planter hårete røtter som biologisk system for inngå verdifulle metabolitter eller utenlandske proteiner, genererer interesser i farmasøytisk industri og selv phytoremediation områder ( se for gjennomgang29,30). I potet (var. Kufri Bahar), var transgene anlegg infisert med wild type A. rhizogenes belastning å produsere hårete røtter uttrykke hepatitt B overflaten antigener (HBsAg)23. Eventuelt en komplett transgene plante regenereres fra hårete røtter kan oppnås, men potet plante og knoller viste tydelig utvikling sammenlignet med transformeringsinstruksjonene kontrollene. Disse forskjellene i fenotypen er på grunn av den opprinnelige Ri T-DNA integrert i genomet31,32.
I dette arbeidet, detaljerte prosedyrer å få transgene stabil hårete røtter med A. rhizogenes og transgene stabil planter ved hjelp av A. tumefaciens presenteres (figur 1 og figur 2). Fullt utviklet transgene hårete røttene ble oppnådd i 5-6 uker, mens transgene røtter bruker A. tumefaciens nødvendig 15-18 uker på organogenesen behovet fra transformert celler, og utvalget og overføring av transformert planter. I våre hender fungerer A. tumefaciens transformasjon fremgangsmåte effektivt i S. tuberosum ssp. andigena og ssp. tuberosum (cv. Désirée), med rapporterte transformasjon effektivitet rundt 35%22 og 48% 12, henholdsvis. Beskrevet A. rhizogenes transformasjon fremgangsmåte er basert på det rapportert av Horn7, som viste en høy (80-100%) transformasjon effektivitet i cv. Désirée og andre tre potet kultivarer (Albatros, Sabina og Saturna).
Presentere A. rhizogenes som et alternativ transformasjon system for potet funksjonelle studier og til å angi om første tilstedeværelsen av Ri T-DNA var til bekymring, vi brukte vektor begge systemer å transformere potet røtter med samme binære som inneholdt en T-DNA med en pådriver for et suberin biosyntetiske gen (FHT) kjører uttrykket av GUS reporter genet. Histochemical analysen avdekket at i A. tumefaciens forvandlet planter, aktiviteten til FHT arrangøren var i de indre og ytre suberized lag av røttene (endodermis og exodermis, henholdsvis) (figur 4A,B ) og også i såret områder av blad, stem og tuber15. I A. rhizogenes forvandlet hårete røtter fant også aktiviteten i endodermis og exodermis og de sårede rot områdene (figur 4E). Samtidig forekomst av suberin promoter aktiviteten i begge typer transformert røtter angir at Ri integrert T-DNA ikke påvirker utviklingsprosesser knyttet til suberization minst i disse rot vev. I transformert hårete røtter oppdaget vi også aktivitet til FHT promoter i områdene omkring fremveksten av lateral røtter (Figur 4 d,E). Dette er i samsvar med arrangøren aktivitet rapportert av andre gener involvert i transport av suberin monomerer eksempel ABCG11 / WBC1133,34,35,36 eller regulator StNAC103 19. potet transformasjonen av A. rhizogenes å studere et suberin gen har allerede rapportert nylig37 og også i så fall hårete røtter har lov til å vise promoter aktivering av CYP86A33, en fettsyre Ω-hydroksylase. Men GUS farging i røttene var bulk kvantifisert ved hjelp av en fluorometric analysen, derfor bestemte uttrykk i suberized vev var bare antas.
Sammen prosesser disse resultatene bevis på at A. rhizogenes transformasjon er et raskere alternativ verktøy for å utforske celle type-spesifikk promoter aktivering av suberin-relaterte gener i røtter, som kan utvides til studier basert på andre oppstå i røtter. I avtalen, har noen andre funksjonelle genetiske studier vært vellykket i å bruke A. rhizogenes i potet, tomat og eukalyptus for å demonstrere gen funksjon6,7,8,9, å studere hormonelle responsen38,39 eller arrangøren aktivitet40,41. Men kan denne strategien fortsatt presentere begrensninger, særlig når studere strengt kontrollert utviklingsprosesser som kan være deregulert av Ri T-DNA eller når hele anlegget eller knoller eller andre organer forskjellig fra røttene vil bli studert. I disse situasjonene er A. tumefaciens transformasjon systemet fortsatt foretrukket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI tilskudd til PB), Ministerio de Economía y Competitividad og ble tildelt und finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R), og Universitetet i Girona (PhD stipend for SF og grant SING11/1). Forfatterne er Dr. Inge Broer (Institute for arealbruk, Universitetet i Rostock, Rostock, Tyskland) og Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spania) for å gi A. rhizogenes og A. tumefaciens belastningen, henholdsvis, og Dr. Marçal Soler og Dr. Anna Plasencia for hjelp og støtte i å initiere A. rhizogenes transformasjon eksperimenter (Toulouse III Paul Sabatier University-CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet Tolosan, Frankrike). Forfatterne takker Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) for hennes verdifull hjelp til å gjennomføre laboratoriearbeid og ta vare på planter, og Ferran Fontdecaba og Carla Sánchez som hjalp med noen av eksperimenter mens de gjorde deres avsluttende grad prosjekter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
