Summary
Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.
Abstract
Agrobacterium sp. is één van de meest gebruikte methoden voor het verkrijgen van transgene planten als het heeft de mogelijkheid om te dragen en de plant genoom te integreren in de eigen T-DNA. Hier presenteren we twee transformatie systemen om genetisch wijzigen aardappelplanten (Solanum tuberosum). In A. tumefaciens transformatie, bladeren zijn besmet, getransformeerde cellen worden geselecteerd en een nieuwe volledige getransformeerde fabriek wordt geregenereerd fytohormonen met 18 weken. In A. rhizogenes transformatie, stengels zijn besmet door het injecteren van de bacteriën met een naald, de nieuwe getransformeerd naar voren gekomen harige wortels worden gedetecteerd met behulp van een rode fluorescerende markering en de wortels niet-getransformeerd worden verwijderd. In 5-6 weken is de resulterende plant een composiet van een wild type shoot met volledig ontwikkelde getransformeerde harige wortels. Het vergroten van de biomassa, kunnen de getransformeerde harige wortels worden weggesneden en zelf doorgegeven. We beide Agrobacterium -gemedieerde transformatie methoden om te verkrijgen van de wortels die de GUS verslaggever-gen uitdrukt gedreven door een promotor van suberine biosynthetic gene toegepast. De GUS kleuring procedure wordt verstrekt en laat de lokalisatie van de cel van de inductie van de promotor. In beide methoden toonde de getransformeerde aardappel wortels vlekken in de suberized endodermis en exodermis, en bovendien, in de A. rhizogenes getransformeerd wortels de activiteit GUS GUS is ook aangetroffen in de opkomst van laterale wortels. Deze resultaten suggereren dat A. rhizogenes een snel alternatief instrument te bestuderen van de genen die worden uitgedrukt in wortels kan zijn.
Introduction
Afgezien van economisch belang heeft de generatie van transgene planten zijn eigen belang in onderzoek om aan te tonen de ultieme functie van genen en plantenfysiologie en ontwikkeling beter te begrijpen. De meest gebruikte methode voor plant DNA invoeging Agrobacterium is-gemedieerde transformatie. Agrobacterium tumefaciens vermag kroon kurkachtig genereren in de geïnfecteerde weefsel van vele plantensoorten door de inwerking van de tumor-inducerende (Ti) plasmide. Het plasmide bevat een T-DNA-regio met een aantal genen die zullen worden geïntegreerd in het genoom van de plant en het veroorzaken van weefsel dedifferentiation1,2. De uitwisseling van deze genen binnen de T-DNA door de transgenic heeft de generatie van specifieke plant wijzigingen vermijden van fenotypische effecten3toegestaan. Om te vergemakkelijken de transgenic klonen in de T-DNA, heeft de regio van T-DNA is weggesneden in een onafhankelijke plasmide genoemd een binaire plasmide, terwijl de rest van de genen van de Ti-plasmide (de virulentiegenen waarmee de mechanismen voor overdracht en inbrengen van T-DNA) geweest Geplaatst in een plasmide helper. Voor plant biotechnologisch onderzoek, transformatie door A. tumefaciens heeft verschillende voordelen: het heeft geen behoefte aan dure apparaten, is in staat om zowel stabiel en voorbijgaande plant transformatie, als lage aantallen van gen exemplaren zijn geïntegreerd in de chromosoom4. De generatie van stabiele transformants vereist echter voor de meeste planten, maar niet, Arabidopsis plant regeneratie van één of een paar cellen met behulp van exogene fytohormonen, waardoor dit proces moeizaam en tijdrovend. A. rhizogenes is ook kundig voor wijzigen van het genoom van de plant, produceren harige wortels of bijwortels op de sites van de infectie als gevolg van de expressie van genen van de rol (wortel loci) gecodeerd in de root-inducerende (Ri) plasmide5. Hoewel minder dan A. tumefaciensstudeerde, wordt A. rhizogenes ook gebruikt voor het verkrijgen van transgene wortels. In dit geval, bevat de A. rhizogenes het oorspronkelijke T-DNA in het plasmide Ri en een binaire plasmide met een tweede T-DNA die de transgenic. Wanneer de infectie-site in stengels of hypocotyls is, kan een samengestelde plant worden verkregen, met nieuwe harige transgene wortels opkomende van wild type schiet. Als alternatief, harige getransformeerde wortels kunnen groeien autonoom in vitro in media met koolstof bronaanvoeren. Het gebruik van A. rhizogenes in plaats van A. tumefaciens voor de productie van transgene weefsel wint relevantie als de hoofdmap de doel-orgel, is vanwege de regeneratie van de plant is niet vereist en vandaar het is sneller en minder kostbaar. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze methode uitgetrokken voor de fenotypische karakterisering van wortel specifieke genen6,7,8,9.
De aardappel (Solanum tuberosum) is de vierde belangrijkste gewas in de wereld volgens de voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO), omdat de Knol voeding relevantie voor menselijke consumptie voor het zijn een goede bron van vitaminen en mineralen. Om die reden, aardappel in de schijnwerpers van landbouwkundige biotechnologie is gezet en ook wordt beschouwd als een goede biologische model voor genetische en ontwikkelingsbiologie10,11 bestudeert. Aardappel transformatie in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van de moleculaire mechanismen onderliggende suberized weefsels via de karakterisatie van genen betrokken bij suberine en wax biosynthese12,13,14 ,15,16,17, suberine monomeer vervoer18 en transcriptie verordening19. Het suberine feruloyl transferase gen, FHT, behoort tot deze gekarakteriseerd biosynthetic genen; haar Downregulatie geeft aanleiding tot een sterke aantasting van de bescherming van de periderm, die is gecorreleerd met een sterke afname van de ferulate esters van suberine en wassen in aardappel knollen14. Gelijktijdig, in de wortels en zaden van Arabidopsis, de knock-out van haar vermeende orthologue (ASFT/RWP1) ook blijk gegeven van haar rol in het produceren van alkyl ferulates in suberine20,21. In aardappel toonde de FHT transcriptionele verslaggever lijn en het antilichaam FHT respectievelijk dat de promotor-activiteit en het eiwit zich in de exodermis, de endodermis, de phellogen-derivaten en gewonde weefsels15 bevinden.
In dit werk detailleren wij een protocol met behulp van A. rhizogenes voor de productie van transgene harige wortels die worden bijgehouden in een wild type shoot, het genereren van samengestelde aardappelplanten of weggesneden om te groeien autonoom in vitro. We bieden ook het protocol dat A. tumefaciens gebruikt om volledige transgene aardappelplanten. Als een case-studie, worden A. rhizogenes en A. tumefaciens getransformeerd met de dezelfde binaire vector gebruikt voor het verkrijgen van de wortels met de promotor van de FHT GUS verslaggever genexpressie rijden. De resultaten worden gerapporteerd en vergeleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het A. rhizogenes -transformatie-protocol werd aangepast en gewijzigd van Horn et al.7 en het genotype getest was S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). Het A. tumefaciens transformatie protocol werd aangepast en gewijzigd van Banerjee et al.22 en de genotypen getest werden S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) en S. tuberosum ssp. andigena. De belangrijkste stappen van beide procedures worden samengevat in Figuur 1 en figuur 2, respectievelijk.
Opmerking: In alle stappen van de procedure uitvoeren in vitro overdrachten, snel doen, en indien mogelijk, houden de platen of potten gesloten, dus het minimaliseren van plant blootstelling aan de lucht om verwelking en besmetting te voorkomen. Anders vermeld, werden alle incubations van de plant gedaan in kasten onder de voorwaarden van 12u van 24 ° C licht/12 h van 20 ° C van donkere en 67 µmol m-1 s-1. Anders vermeld, alle de bacteriën manipulatie en in vitro plant transfers uitvoeren onder aseptische omstandigheden in een laminaire flow-kap. Alle media recepten voor Agrobacterium en in vitro culturen van de plant zijn opgenomen in Tabel S1.
Let op: Alle genetisch gemodificeerde bacteriën en planten naar de geëigende afval container storten.
1. Agrobacterium culturen gebruikt voor transformatie
Opmerking: De gebruikte voor A. rhizogenes transformatie stam was de C58C1:Pri15837 (vriendelijk geleverd door Dr. Inge Broer) en dat voor de A. tumefaciens was de GV2260 (vriendelijk geleverd door Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes werd omgevormd met het binaire vector PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Plant Systems Biology aan de Universiteit Gent Vakgroep; http://gateway.psb.ugent.be) met een T-DNA een transformatie marker te voeren om te controleren de harige wortel vorming. Om te vergelijken de getransformeerde wortels gegenereerd door A. rhizogenes en A. tumefaciens, werden beide omgevormd met het binaire vector pKGWFS7 waarin een T-DNA uitvoering van de promotor van de FHT rijden de β-glucoronidase (GUS) verslaggever gen en het kanamycine resistentie gen als een selecteerbaar marker15.
- Kies een kolonie van Agrobacterium en groeien het 's nachts (O/N) in 5 mL YEB voedingsbodem aangevuld met antibiotica (Tabel S1) in een centrifugebuis 50 mL bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
- Voor A. tumefaciens transformatie, meet de optische dichtheid, die OD600 moet = 0.6-1.0.
- Als de optische dichtheid hoger is, moet een subcultuur verlagen tot OD600 = 0,3 met verse media en wacht totdat de cultuur OD600 bereikt = 0,6-1.
- Centrifugeer 1 mL Agrobacterium cultuur bij 3000 x g in een bench-top centrifuge gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door pipetteren en resuspendeer de cellen in 1 mL verse YEB medium zonder antibiotica. Herhaal deze stap om ervoor te zorgen de volledige verwijdering van antibiotica.
- Voor A. tumefaciens transformatie, in de laatste resuspensie toevoegen het juiste YEB volume te verkrijgen van een definitieve optische dichtheid van OD600 = 0,8.
- Cellen op ijs houden bij de voorbereiding van de planten te worden besmet.
2. plantmateriaal voor transformatie
- Maken van een of twee knooppunt houtstekken ofwel met de apicale of de ondersteunende toppen van steriele in vitro aardappelplanten (donor planten); groeien ze in solide 2MS medium in de potten voor 3 tot 4 weken (figuur 1A en figuur 2A).
3. plant transformatie met behulp van A. rhizogenes (Figuur 1)
Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk het verkrijgen van getransformeerde harige wortels. Om te beoordelen de transgenic expressie, is een negatieve controle nodig. Volg de procedure met behulp van een stam van de A. rhizogenes niet-getransformeerde of getransformeerd met de lege vector waarin de transformatie marker gene ter voorbereiding van de negatieve controle.
- Gebruik verse media platen; Als alternatief, de platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C met het deksel naar boven, strak verzegelde met doorzichtige folie om uitdroging van de media. Ter voorbereiding van de vierkante media platen, helling hen ~ 15°, vullen met 40 mL van MS, en laten stollen. Dit zal het minimaliseren van het contact van de antenne deel van de plant met het medium.
- Overdracht zeer zorgvuldig een donor plant van het 2MS medium naar een vierkante plaat van 120 x 120 mm.
- Injecteer aan één stengel stengellid 3 μL van de cultuur van de A. rhizogenes met behulp van een chirurgische naald en herhaal het tweemaal per plant in verschillende stengelleden indien mogelijk.
Opmerking: Overwegen elke injectie als een onafhankelijke modificatie (figuur 1B). - Transfer onmiddellijk de hele plant naar een vierkante plaat met solide MS medium aangevuld met 0,1 mM acetosyringone. Geschikt voor 2 planten per plaat.
Opmerking: De 1 M acetosyringone stockoplossing wordt bereid in DMSO en kan worden opgeslagen bij-20 ° C. - Afdichting van de plaat met behulp van chirurgische tape en regelen het verticaal binnen een kabinet groei voor 4 dagen.
- De plant overbrengen in een nieuwe vierkante plaat met MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL] om te doden van A. rhizogenes.
- Na 10-12 dagen, zal harige wortels beginnen te verschijnen (Figuur 1 c,1 D). Vervolgens accijnzen van de eigen wortels van de plant en de plant overbrengen in een nieuwe vierkante plaat met MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL].
Opmerking: Getransformeerde harige wortels kunnen worden gecontroleerd door rode fluorescentie bij het gebruik van een DsRed transformation marker (figuur 3D). - Voor het verkrijgen van een samengestelde plant (figuur 1E), laat de transgene harige wortels groeien voor 3-4 weken in MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 μg/mL] (wekelijks veranderen het medium).
- Afhankelijk van het doel, de transgene harige wortels en de negatieve controles als volgt worden doorgegeven.
- De hele samengestelde plant overbrengen in een hydrocultuur (Tabel S2) of de bodem medium toe te staan voor enorme ontwikkeling.
- Als u wilt individueel propageren de getransformeerde harige wortels, met behulp van een scalpel snijden de wortels uiting geven aan de rode fluorescerende transformatie markering (DsRed eiwit) wanneer ze zijn 4-8 cm lang (figuur 1E) en ze vervolgens overbrengen naar een petrischaal met Gamborg B5 solide medium aangevuld met 2% sucrose en cefotaxime natrium [500 μg/mL]. Zegel van de platen met plastic laboratorium film en ze groeien in het donker bij 20 ° C.
Opmerking: De wortels kunnen worden gemanipuleerd onder een stereomicroscoop uitgerust om te ontdekken de fluorescentie onder steriele omstandigheden (Zie Tabel van materialen). - Voor de productie van biomassa (dat wil zeggen, gen expressie analyse), snijd een 5 cm lang harige root en het doorgeven in een 150 mL conische kolf met 20 mL Gamborg B5 opgietvloeistof aangevuld met 2% sucrose en cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL]. Het kweken voor 6 weken in het donker bij 20 ° C en 60 rpm.
Figuur 1: Tijdlijn te verkrijgen aardappel transgene harige wortels met behulp van A. rhizogenes. De cumulatieve weken te bereiken van elk stadium van het transformatieproces en de daaropvolgende stappen de harige wortels groeien worden weergegeven. Representatieve beelden van verschillende stadia worden afgebeeld: de opening van het proces met behulp van 3 weken oude in vitro planten (A), vervolgens infectie van de planten door het injecteren van A. rhizogenes (B), de vorming van de proliferatieve weefsel (C, pijlen) met opkomende harige wortels (D), en de ontwikkelde harige wortels uiting geven aan de rode fluorescerende transformatie markering DsRed (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. plant transformatie met behulp van A. tumefaciens (Figuur 2)
Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk het verkrijgen van getransformeerde planten. Om te beoordelen van de transgenic effect, is een negatieve controle nodig. Een optie is de procedure met behulp van een A. tumefaciens getransformeerd met de lege vector te volgen. Wild type planten kunnen als alternatief worden gebruikt.
- Knippen en deze plaatsen een blad van de 3-4-week-oude planten (figuur 2A) in een petrischaal. Met behulp van een scalpel uitsluiten van de bast en snoeien dwarse (1-3 afhankelijk van de grootte van het blad) vanaf het midden van het blad aan de randen te vermijden ze afsnijden (figuur 2B).
- Onmiddellijk plaats van het blad drijvend op 10 mL verse 2MS vloeibare media in een petrischaal met de abaxial kant omhoog en sluit de plaat. Herhaal de stap die plaats bieden aan maximaal 15 vertrekt voor cv. Désirée en 25 verlaat voor ssp. eenndigena (afhankelijk van de grootte van het blad).
- Voeg onmiddellijk 80 µL van A. tumefaciens cultuur bij OD600 = 0,8 in de vloeibare media en meng de plaat handmatig voor 1 min voor het distribueren van de bacteriële oplossing.
- Zorgvuldig verzegelen met het afdichten van de film, dek af met aluminiumfolie en incubeer gedurende 2 dagen in een zaal bij 24 ° C te laten de transformatie zich voordoen.
- Breng de bladeren abaxial kant tot CIM medium (figuur 2B) te houden en hen Incubeer gedurende één week in een kabinet groei.
- Schraap het CIM-medium met de pincet, zodat de bladeren beter kunnen worden ondergebracht op de media.
- Breng de bladeren abaxial kant tot SIM-medium (figuur 2C) houden en broeden ze in een groei kabinet, vernieuwen van het medium om 7-10 dagen, tot de scheuten zijn ongeveer 2 cm hoog.
- Schraap het SIM-medium met de pincet, zodat de bladeren kunnen volledig worden omgeven door de media. Wanneer de naar voren gekomen scheuten het deksel bereikt, werken met hoge petrischalen (100 x 20 mm, hoogte x diameter).
Opmerking: De eelt zullen vormen na 2-3 weken in SIM-medium (figuur 2D) en de scheuten na 6-7 weken (figuur 2E). De scheuten zal worden beschouwd als onafhankelijke modificaties als zij uit eelt gevormd uit onafhankelijke wonden voortkomen.
- Schraap het SIM-medium met de pincet, zodat de bladeren kunnen volledig worden omgeven door de media. Wanneer de naar voren gekomen scheuten het deksel bereikt, werken met hoge petrischalen (100 x 20 mm, hoogte x diameter).
- Knip drie schiet naar voren gekomen uit elke callus (beschouwd als "transformation event" de dezelfde) (figuur 2E), wroeten, overdracht kunnen cultuur kolven met MG medium aangevuld met cefotaxime natrium [250 mg/L] om de subset label met een nummer en Incubeer in een behuizing voor 3-4 weken of totdat de scheuten krachtige (figuur 2F zijn) groei.
Opmerking: Wanneer de scheuten, snijden verwijdert ook de eelt anders de wortel niet maakt.- Herhaal de stap zo vaak als onafhankelijke regels zijn nodig. Tot 5 verschillende transformatie kunnen gebeurtenissen worden geplaatst in een maatkolf van cultuur met een diameter van 8 cm te werken in het volste vertrouwen dat het planten van verschillende gebeurtenissen worden niet gemengd.
- Selecteer het gezondste bedrijf van elke gebeurtenis, knippen het apicale segment van het schieten met 3-4 stengelleden en breng dit in een nieuwe cultuur-kolf met 2MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [250 mg/L].
Opmerking: 3-6 weken die de plant efficiënt zal groeien, ontwikkelen van een krachtige shoot en wortels.- Terugbrengen naar de kamer de niet-geselecteerde scheuten totdat de geselecteerde plant volledig heeft ontwikkeld.
- Segmenten van de stengel van de plant met ten minste één stengellid of met de apicale bud knippen en deze overbrengen naar nieuwe 2MS medium aangevuld met cefotaxime [250 mg/L]. Broeden ze in de kast groei.
- Elke 3-4 weken om de regels in vitro getransformeerd worden gerepliceerd.
Opmerking: De cefotaxime natrium is nodig in ten minste drie daaropvolgende overdrachten naar 2MS medium om zeker te zijn om te doden van de A. tumefaciens; Daarna, als A. tumefaciens begroeiing wordt waargenomen, overbrengen in de planten weer 2MS media aangevuld met cefotaxime natrium.
- Elke 3-4 weken om de regels in vitro getransformeerd worden gerepliceerd.
- Karakteriseren het fenotype van de plant, planten voor de bodem voor hun volledige karakterisering of naar overbrengen hydrocultuur cultuur voor inspectie van de wortel.
- De knollen geproduceerd in de bodem te verspreiden en onderhouden van de vastgestelde regels te houden.
Figuur 2: Tijdlijn te verkrijgen van de aardappel omgezet planten met behulp van A. tumefaciens. De cumulatieve weken te bereiken van elk stadium van het transformatieproces en de volgende stappen om de planten groeien worden weergegeven. Representatieve beelden van verschillende stadia worden afgebeeld: de opening van het proces met behulp vertrekt vanuit 3 - weken oude in vitro planten (A), de overdracht van de gewonde en geïnfecteerde verlaat aan de CIM-media (B), de bladeren toen overgedragen aan SIM-media (C), de visualisatie van de eelt rond de gewonde gebieden na 2-3 weken in SIM-media (D), de vorming van de shoot na 9-11 weken in SIM-media (E) en de scheuten na wordt overgedragen aan MG media (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. hydroponic cultuur
- Voorbereiden van de Hoagland oplossing voor een halve sterkte (0,5 x) (Tabel S2) in een 10 L emmer.
- Dompel een aquarium pomp teneinde homogeniteit en goede zuurstof voorwaarden te behouden.
- Betrekking hebben op de muren van de emmer met aluminiumfolie om te groeien van de wortels in donkere omstandigheden.
- Het vermijden van wortel schade, overbrengen in in vitro planten hydrocultuur cultuur.
Opmerking: Verwijder eventuele resterende in vitro medium uit wortels om te voorkomen dat micro-organisme proliferatie tijdens de incubatie door zorgvuldig schudden van de wortels ondergedompeld in water. - De planten met transparante film als een kas te maken voldoende acclimatisatie en broeden in de groeiende zaal bedekken.
- Maak gaten in de film na 3 dagen en volledig één week na verwijderen.
- Vervangen door verse media elke 10 dagen.
6. GUS histochemische reporter gene assay
Opmerking: In ons geval de GUS analyse werd uitgevoerd met wortels van 2-3 weken in hydrocultuur of in vitrogekweekt.
- Herstellen van de wortels met 90% gekoeld aceton (v/v) en Incubeer het gedurende 20 minuten op ijs.
- Het uitvoeren van twee wasbeurten met gedestilleerd water.
- Toevoegen van verse GUS kleurstofoplossing (tabel 1) en de toepassing van vacuüm (-70 Pa) voor 20 min.
- Incubeer bij 37 ° C in het donker te beschermen van de lichtgevoelige GUS voor 4 uur of totdat een blauwe kleur zichtbaar is.
Opmerking: De aanwezigheid van ferri- en ferrocyanide in GUS oplossing minimaliseren de verspreiding van reactieproducten en bieden meer precieze lokalisatie.
Let op: Gebruik een zuurkast en Draag beschermende kleding bij hantering van de giftige cyanide derivaten in GUS oplossing (kalium Hexacyanoferraat en kaliumferrocyanide). Het substraat GUS en het materiaal ter beschikking moeten veilig worden afgevoerd. - GUS kleurstofoplossing Verwijder en verwerp het in geschikte containers.
- Het uitvoeren van twee wasbeurten met ethanol 70% (v/v).
- Onder een Microscoop helder veld observeren.
Opmerking: GUS kleuring is stabiel voor een paar weken; tijdens de eerste week was het signaal GUS is echter duidelijk en diffundeert minder in aangrenzende cellen. Voor langere opslag, verzegelen van de buis en op te slaan bij 4 ° C.
Tabel 1: GUS kleuring oplossing recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -gemedieerde aardappel transformatie
In dit manuscript, de stapsgewijze procedure instellen om te verkrijgen getransformeerd wortel met A. rhizogenes gepresenteerd. Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure, waarin in totaal ongeveer 5-6 weken (na injectie van A. rhizogenes voor het verkrijgen van de volledig ontwikkelde harige wortels). Vervolgens kan de plant worden bestudeerd als een composite (wild type schieten, transgene wortel) of de transgene harige wortel klonen kunnen worden weggesneden en autonoom gegroeid in solide Gamborg B5 medium aangevuld met 2% sucrose. U kunt ook kunnen de harige wortels worden massaal gekweekt met behulp van de vloeibare Gamborg B5 media. De procedure ingediend heeft verricht met S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée).
De methode om te controleren van de procedure en voor aardappel transgene harige wortels heeft gevalideerd met behulp van een binaire vector met de DsRed als een transformatie marker (PK7GWIWG2_II-RedRoot van VIB-Vakgroep Plant Systems Biology aan de Universiteit Gent). Hierdoor kon het onderscheid van transgene harige wortels van niet-transgene door de rode fluorescentie. Volgens dat tentoongesteld de getransformeerde harige wortels in Figuur 3 rode fluorescentie wanneer verlicht met groen licht. De negatieve controle met behulp van de niet-getransformeerde Agrobacterium toonde geen rode fluorescentie (Figuur 3 c), algemene met vermelding van de geschiktheid van de markering van de transformatie DsRed te identificeren van de transgene harige wortels (figuur 3D). Andere transformatie markeringen zoals antibioticaresistentie kunnen worden gebruikt, zoals beschreven door andere auteurs23,24; echter de antibiotica in de media kunnen het produceren van een vertraging van de groei in transgene wortels met de marker.
Figuur 3: TL transgene harige wortels van aardappel (cv. Désirée) getransformeerd door A. rhizogenes. De harige wortels werden verkregen met behulp van een niet-getransformeerd A. rhizogenes (stam van C58C1: pRI1583) (A en C) en met A. rhizogenes (soort C58C1:pRI1583) getransformeerd met de uitvoering van de pK7GWIWG2_II-rood-Root van de lege vector een DsRed transformatie marker (B en D). De harige wortels zijn gevormd in beide infecties (A, B), maar rode fluorescentie is alleen waargenomen in harige wortels getransformeerd met de A. rhizogenes met de binaire vector. De beelden werden genomen met een stereomicroscoop uitgerust met een lamp en een specifiek filter om te visualiseren de rode fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Agrobacterium tumefaciens -gemedieerde aardappel transformatie
Het tweede protocol beschreven in dit manuscript is ingesteld om te verkrijgen, stap voor stap een volledige aardappel plant getransformeerd met A. tumefaciens. Figuur 2 geeft een overzicht van de procedure, die helemaal tussen de 15-18 weken (na de besmetting van het blad met A. tumefaciens duurt voor het verkrijgen van volledig geregenereerde planten). Het meest tijdrovende gedeelte van de procedure is de regeneratie van de plant door organogenese. Deze bepaalde stap maakt deze methode meer moeizaam dan het gebruik van A. rhizogenes. De procedure is uitgevoerd met S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée) en S. tuberosum ssp. andigena, de voormalige wordt minder afhankelijk van de short-day voorwaarden voor het opwekken van tuberization.
In de A. tumefaciens-gemedieerde transformatie, in tegenstelling tot de A. rhizogenes -gemedieerde transformatie, de geregenereerde planten zijn volledig transgene organismen. Echter, hoewel de transgene planten worden geregenereerd in een kanamycine selectieve media, niet alle regels express efficiënt de transgenic. Vandaar, de validatie van de transgenic expressie is nodig.
Vergelijking van de activiteit van de promotor FHT in wortels verkregen met behulp van A. tumefaciens en A. rhizogenes
De bovengenoemde procedures werden toegepast voor de productie van wortels die het gen uitdrukt GUS onder de promotor van FHT gen. De complete getransformeerd planten met A. tumefaciens waren eerder gemelde15, met behulp van de binaire vector-pKGWFS7 met de FHT promotor. Nu, deze binaire vector is gebruikt voor de productie van nieuwe getransformeerde harige wortels om te vergelijken van de weefsels waar de promotor actief is en dus voor het testen van de harige wortelsysteem als hulpmiddel voor de studie van de activering van de promotor.
Figuur 4 toont GUS kleuring in wortels van transgene planten verkregen door A. tumefaciens (figuur 4AB) en transgene harige wortels verkregen door A. rhizogenes (figuur 4CD, E, F), respectievelijk. Zoals kan worden gezien, wortels getransformeerd met A. tumefaciens en gekweekt in vitro Toon blauwe vlekken in de endodermis (figuur 4A), een cellaag tussen de cortex en de stele. In meer ontwikkelde wortels, de blauwe etikettering is fragmentarisch in de externe laag overeenkomt met de exodermis (figuur 4B). In getransformeerde harige wortels gegroeid in hydrocultuur, de markering GUS specifiek lag in de endodermis (figuur 4CE), in het ontstaan van laterale wortels (Figuur 4 dE), in de gewonde gebieden (figuur 4E ) en in de exodermis (figuur 4F). De wortels toonde geen GUS vlek in de negatieve controles die beide harige wortels zonder de PromFHT:GUS T-DNA cassette of wild type wortels waren.
Figuur 4: Histochemische observatie van transgene aardappel wortels die het gen uitdrukt GUS verslaggever gedreven door de promotor van FHT. De wortels van volledige transgene planten verkregen door A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) transformatie (A-B) Toon blauw kleuring in de endodermis (A) en exodermis (B). De transgene harige wortels verkregen door A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. Désirée) transformatie (C-F) GUS vlekken in de endodermis (C en E), weergegeven in de laterale root opkomst (D en E), in de wond-genezing zone (E) en de exodermis (F). Endodermis (nl); Exodermis (EX); Xylem (XL); Primordia van een laterale root (LR). De rode pijl geeft de gewonde gebied. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel S1: Media recepten gebruikt voor groeiende bacteriën en in vitro planten. Gelieve Klik hier om te downloaden van deze tabel
S2 tabel: Halve sterkte Hoagland de oplossing voor het kweken van aardappelplanten in hydrocultuur. Gelieve Klik hier om te downloaden van deze tabel
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In aardappel, het meest voorkomende systeem voor stabiele volledige transgene planten gebruikt de transformatie door Agrobacterium tumefaciens stammen waarvoor organogenese gebruik van exogene fytohormonen. Hoewel de Agrobacterium gebaseerde protocollen heeft het potentieel om het integreren van niet-T-DNA vector reeks25, is deze methode nog het makkelijkst en minder dure beschikbaar voor transformeren aardappelplanten. Tijdens de laatste jaren de belangstelling voor A. rhizogenes-gemedieerde transformatie heeft de aandacht van onderzoekers voor het toestaan van transgene wortels in kortere perioden dan het gebruik van A. tumefaciensverkrijgen. De A. rhizogenes worden nog steeds bewaard het root-inducerende (Ri) plasmide die draagt een aantal genen coderend voor enzymen voor de phytohormone auxine controle en cytokinine biosynthese en codering voor opines26. Zodra de Ri T-DNA wordt ingevoegd aan de genomic DNA van de gastheer, deregulates de nieuwe hormonale evenwicht de geïnfecteerde cellen inducerende de vorming van delende wortels, harige wortels, opkomende op de punten van infectie27genoemd. Wanneer een extra binaire vector wordt gebruikt voor de integratie van een buitenlandse DNA, verleent het behoud van de Ri-plasmide de mogelijkheid om het verkrijgen getransformeerd harige wortels zonder de noodzaak van organogenese met behulp van exogenously-toegepaste fytohormonen28. De harige wortels kunnen kunnen worden gekoppeld aan de wild type shoot voor het genereren van een composiet plant of zelf gekweekte. Dit vermogen van harige wortels zelf doorgeven is uitgebuit om te produceren in verschillende planten harige wortels als een biologisch systeem voor massaproductie waardevolle metabolieten of vreemde eiwitten, het genereren van belangen in de farmacie en zelfs fytoremediatie gebieden ( Zie voor beoordeling29,30). In aardappel (var. Kufri Bahar), waren transgene complete installaties besmet met wild type A. rhizogenes stam tot harige wortels uiting van het Hepatitis B surface antigeen (HBsAg)23. U kunt ook een volledige transgene plant geregenereerd van harige wortels kan worden verkregen, maar aardappel planten en knollen toonde verschillende ontwikkeling ten opzichte van de niet-getransformeerde besturingselementen. Deze verschillen in het fenotype zijn als gevolg van de oorspronkelijke Ri T-DNA geïntegreerd binnen het genoom31,32.
In dit werk, de gedetailleerde procedures voor het verkrijgen van transgene stabiele harige wortels met behulp van A. rhizogenes en transgene stabiele planten met behulp van A. tumefaciens worden gepresenteerd (Figuur 1 en Figuur 2). De volledig ontwikkelde transgene harige wortels werden verkregen in 5-6 weken, terwijl transgene wortels 15-18 weken als gevolg van de eis van de organogenese van getransformeerde cellen, en de selectie en de vermeerdering van getransformeerde planten met behulp van A. tumefaciens nodig. In onze handen, de A. tumefaciens transformatie procedure werkt efficiënt in S. tuberosum ssp. andigena en ssp. tuberosum (cv. Désirée), met een gerapporteerde transformatie efficiëntie ongeveer 35%22 en 48% 12, respectievelijk. De beschreven A. rhizogenes transformatie procedure is gebaseerd op die gerapporteerd door hoorn7, waaruit bleek een hoog (80-100%) transformatie efficiëntie in cv. Désirée en andere cultivars van de drie aardappel (Albatros, Sabina en Saturna).
A. rhizogenes presenteren als een alternatieve transformatie systeem voor aardappel functionele studies en om aan te geven dat of de oorspronkelijke aanwezigheid van T-DNA Ri aanleiding tot bezorgdheid was, we gebruikten vector beide systemen te transformeren van aardappel wortels met dezelfde binaire die bevatte een T-DNA met een promotor van een suberine biosynthetic gen (FHT) rijden de uitdrukking van het gen van de verslaggever GUS . De histochemische analyse kwam naar voren dat in A. tumefaciens getransformeerd planten, de activiteit van de FHT promotor was in de binnenste en buitenste suberized lagen van de wortels (endodermis en exodermis, respectievelijk) (figuur 4A,B ) en ook op de gewonde gebied van het blad, stengel- en knolgewassen15. In A. rhizogenes getransformeerd harige wortels, werd de activiteit ook ontdekt in de endodermis en exodermis en op het gebied van de gewonde wortel (figuur 4E). Het samen voorkomen van de activiteit van de promotor suberine in beide soorten getransformeerde wortels geeft aan dat de Ri geïntegreerd T-DNA is niet van invloed op de ontwikkelings processen gerelateerd aan suberization ten minste in deze wortel weefsels. In getransformeerde harige wortels ontdekt we ook activiteit van de FHT promotor in de gebieden rond de opkomst van laterale wortels (Figuur 4 d,E). Dit is het eens met de activiteit van de promotor gerapporteerd door andere genen betrokken bij het vervoer van suberine monomeren, zoals ABCG11 / WBC1133,34,35,,36 of de regulator StNAC103 19. de transformatie van de aardappel door A. rhizogenes te bestuderen van een gen Suberine is reeds gemeld onlangs37 en ook in dat geval harige wortels hebben toegestaan om te laten zien van de activering van de promotor van CYP86A33, een vetzuur Ω-hydroxylase. Echter de GUS kleuring in wortels was bulk gekwantificeerd aan de hand van een fluorimetrische assay, vandaar de specifieke expressie in suberized weefsels alleen werd geacht.
Over het geheel genomen processen deze resultaten bewijzen dat A. rhizogenes transformatie is een snellere alternatieve tool om te ontdekken de activering van de promotor van de type-specifieke cel van suberine-gerelateerde genen in de wortels, die kunnen worden verlengd tot studies op basis van andere die optreden in wortels. Eens, zijn sommige andere functionele genetische studies succesvol geweest in met behulp van A. rhizogenes in aardappel, tomaat en eucalyptus om aan te tonen de gene functie6,7,8,9, om te studeren de hormonale reactie38,39 of de promotor activiteit40,41. Deze strategie kan echter nog steeds beperkingen, presenteren met name bij de studie van strak gecontroleerde ontwikkelings processen die kunnen worden vrijgemaakt door de Ri T-DNA of wanneer de hele plant of de knollen of andere organen verschillen van wortels wilt worden bestudeerd. In deze situaties is het A. tumefaciens transformatie systeem nog steeds de voorkeur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI subsidie voor PB), Ministerio de Economía y Competitividad en FEDER financiering (AGL2012-36725, AGL2015 + 67495 + C2 + 1-R) en de Universiteit van Girona (PhD grant SF en subsidie SING11/1). De auteurs zijn Dr. Inge Broer (Instituut voor ruimtelijke ordening, Universiteit van Rostock, Rostock, Duitsland) en Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanje) dankbaar voor het verstrekken van de A. rhizogenes en de A. tumefaciens stam, respectievelijk, en Dr. Marçal Soler en Dr. Anna Plasencia voor de hulp en steun ontvangen in het initiëren van de experimenten van de transformatie A. rhizogenes (Universiteit Paul Sabatier van Toulouse III — CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan, Frankrijk). De auteurs bedanken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) voor haar waardevolle hulp in het laboratoriumwerk uitvoeren en het verzorgen van planten, en Ferran Fontdecaba en Carla Sánchez die bijgestaan met een aantal van de experimenten terwijl ze aan het doen waren hun projecten van de laatste graad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
