Summary
Här presenterar vi två protokoll för att omvandla potatisplantor. Agrobacterium tumefaciens omvandling leder till en komplett transgena anläggning medan den Agrobacterium rhizogenes producerar transgena håriga rötter i en vildtyp skjuta som kan själv förökade. Vi upptäcker då arrangören aktivitet av GUS färgning i de transformerade rötterna.
Abstract
Agrobacterium sp. är en av de mest använda metoderna för att erhålla transgena växter har förmågan att överföra och integrera sina egna T-DNA i växtens arvsmassa. Här presenterar vi två omvandling system för att genetiskt modifiera potatisplantor (Solanumtuberosum). I A. tumefaciens förvandling, bladen är smittade, de transformerade cellerna väljs och en ny komplett bearbetade anläggning regenereras med fytohormoner i 18 veckor. I A. rhizogenes förvandling, stjälkar är smittade genom att injicera bakterier med en nål, nytt framkommit transformerad hårig rötterna upptäcks med en röd fluorescerande markör och icke-omvandlad rötter tas bort. I 5-6 veckor är resulterande anläggningen sammansatt av en vildtyp skjuta med fullt utvecklad transformerad håriga rötter. För att öka biomassa, kan omvandlas hårig rötterna censurerade och själv förökat. Vi ansökte båda Agrobacterium -medierad omvandling metoder för att få rötter uttrycker GUS reporter genen drivs av suberin biosyntetiska gen främjare. De GUS färgningsproceduren tillhandahålls och tillåter cell lokaliseringen av promotorn induktionen. I båda metoderna visade transformerad potatis rötterna GUS färgning i suberized Endodermisen och exodermis, och dessutom i A. rhizogenes omvandlas rötter aktiviteten GUS upptäcktes också i uppkomsten av laterala rötter. Dessa resultat tyder på att A. rhizogenes kan vara ett snabbt alternativa verktyg att studera gener som uttrycks i rötter.
Introduction
Bortsett från ekonomiska intresse har generering av transgena växter sin egen betydelse i forskning att demonstrera den ultimata funktionen av gener och att bättre förstå växtfysiologi och utveckling. Mest använda metoden för växt DNA införande är Agrobacterium-medierad omvandling. Agrobacterium tumefaciens är kunna generera crown galls i vävnaden som har infekterats av många växtarter av dess tumör-inducerande (Ti) plasmid. Plasmiden innehåller en T-DNA region med en uppsättning gener som kommer att integreras i växten genomet och inducera vävnad dedifferentiering1,2. Utbyte av dessa gener inom T-DNA av transgenens har tillåtit generationen av särskilda växt ändringar att undvika fenotypisk effekter3. För att underlätta den transgenens kloning i T-DNA, regionen T-DNA har varit censurerade i en oberoende plasmid som kallas ett binärt plasmid, medan resten av generna av Ti plasmiden (de virulensgener som gör T-DNA överföring och insättning mekanismerna) har varit placeras i en helper plasmid. För bioteknik växtforskning omvandling av A. tumefaciens har flera fördelar: det behöver inte dyra enheter, kan generera både stabil och övergående växt förvandling och lågt antal gene kopior är integrerade i den kromosom4. Men för de flesta växter, men inte, Arabidopsis kräver generering av stabila transformants anläggningen förnyelse från en enda eller ett fåtal celler använder exogent fytohormoner, att göra denna process mödosam och tidskrävande. A. rhizogenes är också kunna ändra växt genomet, producerar håriga rötter eller oavsiktlig rötter på infektion platser på grund av uttrycket av rol (roten loci) gener kodade i rot-inducerande (Ri) plasmid5. Även om mindre studerade än A. tumefaciens, används A. rhizogenes också för att erhålla transgena rötter. I det här fallet innehåller den A. rhizogenes den ursprungliga T-DNA i Ri plasmiden och ett binärt plasmid med en andra T-DNA bär transgenens. När webbplatsen infektion är i stjälkar eller hypocotyls, kan en komposit växt erhållas, med nya hårig transgena rötter framväxande från vildtyp skott. Alternativt kan hårig transformerad rötter växa självständigt i vitro i media med kol källa ingångar. Användning av A. rhizogenes istället för A. tumefaciens att producera transgena vävnad vinner relevans när roten är målorganet, eftersom växten förnyelse krävs inte och därför är det snabbare och mindre kostsamma. Tidigare studier har visat denna metod som disponeras för fenotypisk karakterisering av roten specifika gener6,7,8,9.
Potatis (Solanumtuberosum) är den fjärde viktigaste grödan i världen enligt livsmedels- och jordbruksorganisation av FN (FAO) eftersom knölen har näringsmässiga betydelse livsmedel för att vara en bra källa av vitaminer och mineraler. Därför potatis har placerats i strålkastarljuset i jordbruket bioteknik och också anses som en bra biologisk modell för genetiska och utvecklingstoxikologiska studier10,11. Potatis omvandling väsentligt bidragit till förståelsen av molekylära mekanismerna underliggande suberized vävnader genom karakterisering av gener involverade i suberin och vax biosyntes12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 och transkription förordning19. Suberin feruloyl transferas gen, FHT, är en av dessa kännetecknas biosyntetiska gener; dess nedreglering ger upphov till en stark nedsättning av periderm skyddet som är korrelerad med en stark minskning ferulate estrar av suberin och vaxer i potatis knölar14. Samtidigt, i rötter och frön av Arabidopsis visade knockout av dess förmodade orthologue (ASFT/RWP1) också sin roll i producerande alkyl ferulates i suberin20,21. I potatis visade FHT transkriptionell reporter linjen och FHT antikroppen respektive att aktiviteten Promotorn och proteinet är placerade i Exodermisen, Endodermisen, phellogen-derivat och sårade vävnader15.
I detta arbete detalj vi ett protokoll med A. rhizogenes att producera transgena håriga rötter som underhålls i ett vildtyps-shoot, generera sammansatta potatisplantor eller exciderad växa självständigt in vitro. Vi ger också protokollet använder A. tumefaciens för att erhålla fullständig transgena potatisplantor. Som en fallstudie används A. rhizogenes och A. tumefaciens omvandlas med samma binära vektorn att få rötter med FHT arrangören kör GUS reporter genuttryck. Resultaten rapporteras och jämfört.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A. rhizogenes transformation protokollet var anpassas och ändras från Horn et al.7 och den genotyp som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens omvandling protokollet var anpassas och ändras från Banerjee et al.22 och de genotyper som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) och S. tuberosum ssp. andigena. De viktigaste stegen i båda förfarandena sammanfattas i figur 1 och figur 2, respektive.
Obs: I alla steg i det förfarande som utför in vitro- överföringar, göra det snabbt, och när det är möjligt behålla plattor eller krukor stängd, sålunda minimizing växt exponering för luften för att undvika vissnande och kontaminering. Annat anges, gjorda alla de växt-inkubationer i skåpen under villkoren i 12 h 24 ° C ljus/12 h av 20 ° C mörka och 67 µmol m-1 s-1. Annat anges, utföra alla bakterier manipulation och in vitro- växt överföringar under aseptiska förhållanden i en LAF. Alla media recept för Agrobacterium och in vitro- plant kulturer finns i Tabell S1.
Varning: Deponera alla genetiskt modifierade bakterier och växter till tillgripits avfallsbehållaren.
1. Agrobacterium kulturer används för omvandling
Obs: Den stam som används för A. rhizogenes omvandling var den C58C1:Pri15837 (Vänligen tillhandahållen av Dr Inge Broer) och som för den A. tumefaciens var den GV2260 (Vänligen tillhandahållen av Dr Salomé Prat). A. rhizogenes förvandlades med binära vektorn PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Institutionen för växt systembiologi vid Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) som innehåller en T-DNA bär en omvandling markör för att övervaka hårig roten bildning. För att jämföra de transformerade rötter som genereras av A. rhizogenes och A. tumefaciens, omformades båda med den binära vector-pKGWFS7 som innehåller en T-DNA bär FHT arrangören kör genen β-glucoronidase (GUS) reporter och genen Kanamycin motstånd som en valbar markör15.
- Plocka en koloni av Agrobacterium och växa över natten (O/N) i 5 mL av YEB medium kompletteras med antibiotika (Tabell S1) i ett 50 mL centrifugrör vid 28 ° C med skakningar vid 200 rpm.
- För A. tumefaciens omvandling, Mät den optiska densiteten, som måste vara OD600 = 0,6-1,0.
- Om den optiska densiteten är högre, göra en subkultur som sänka det till OD600 = 0,3 med färska media och vänta tills kulturen når OD600 = 0.6-1.
- Centrifugera 1 mL av Agrobacterium kultur vid 3 000 x g i en bänk-centrifug 10 min i rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten genom pipettering och resuspendera cellerna i 1 mL färsk YEB medium utan antibiotika. Upprepa detta steg för att säkerställa fullständig borttagning av antibiotika.
- Lägg till lämplig YEB volym för att få en sista optiska densitet OD600 för A. tumefaciens omvandling, i senaste resuspension = 0,8.
- Hålla celler på is medan du förbereder växterna att smittas.
2. växtmaterial för omvandling
- Göra en eller två nod skottsticklingar som antingen innehåller den apikala eller extra knoppar från steril i vitro potatisplantor (givare växter); odla dem i solid 2MS medium i krukor i 3 till 4 veckor (figur 1A och figur 2A).
3. plantera omvandling med A. rhizogenes (figur 1)
Obs: Detta förfarande möjliggör erhållande av omvandlade håriga rötter. Utvärdera transgenens uttryck, behövs en negativ kontroll. För att förbereda den negativa kontrollen, följ proceduren med en A. rhizogenes stam antingen ej omformad eller omvandlas med den tomma vektor som innehåller genen omvandling markör.
- Använd färska media plåtar. Alternativt, plattorna kan förvaras vid 4 ° C med locket upp, tätslutande med transparent film att undvika media uttorkning. För att förbereda fyrkantig media plattorna, luta dem ~ 15°, fyll med 40 mL av MS, och låt dem stelna. Detta kommer att minimera kontakten av antenn delen av växten med mediet.
- Överföra mycket noggrant en givare växt från 2MS mediet till en 120 x 120 mm fyrkantig platta.
- Injicera till en stam internoden 3 μL av A. rhizogenes kultur med en kirurgisk nål och upprepa det två gånger per planta i olika internoder när det är möjligt.
Överväg varje injektion som en oberoende transformationshändelse (figur 1B). - Överföra omedelbart hela anläggningen till en fyrkantig platta med fast MS-medium kompletteras med 0,1 mM acetosyringone. Rymma 2 plantor per tallrik.
Obs: 1 M acetosyringone stamlösning bereds i DMSO och kan förvaras vid-20 ° C. - Försegla plattan med kirurgtejp och ordna det vertikalt inuti ett skåp tillväxt i 4 dagar.
- Överföra anläggningen till en ny fyrkantig platta med MS medium kompletteras med cefotaxime natrium [500 µg/mL] att döda A. rhizogenes.
- Efter 10-12 dagar, kommer att håriga rötter börja visas (figur 1 c,1 D). Sedan punktskatt infödda rötterna av anläggningen och överföra anläggningen till en ny fyrkantig platta med MS medium kompletteras med cefotaxime natrium [500 µg/mL].
Obs: Transformerad håriga rötter kan kontrolleras av röd fluorescens när du använder en DsRed omvandling markör (figur 3D). - För att få en sammansatt växt (figur 1E), låt de transgena håriga rötterna växa för 3-4 veckor i MS medium kompletteras med cefotaxime natrium [500 μg/mL] (ändra mediet varje vecka).
- Beroende på syftet, att sprida de transgena håriga rötterna och de negativa kontrollerna som följer.
- Överför hela sammansatta anläggningen till en hydrokultur (Tabell S2) eller jord medium som möjliggör massiv utveckling.
- För att individuellt propagera transformerad håriga rötter, med en skalpell skär rötterna att uttrycka den röda fluorescerande omvandling markören (DsRed protein) när de är 4-8 cm lång (figur 1E) och överföra dem i en petriskål med Gamborg B5 fast medium kompletterat med 2% sackaros och cefotaxime natrium [500 μg/mL]. Förslut plattorna med plast laboratorium film och odla dem i mörker vid 20 ° C.
Obs: Rötterna kan manipuleras under ett stereomikroskop utrustade att upptäcka fluorescensen under sterila förhållanden (se Tabell för material). - För produktion av biomassa (dvs gen uttryck analys), skär en 5 cm lång hårig rot och sprida det i en 150 mL Erlenmeyerkolv med 20 mL Gamborg B5 flytande medium kompletteras med 2% sackaros och cefotaxime natrium [500 µg/mL]. Odla den i 6 veckor i mörker vid 20 ° C och 60 rpm.
Figur 1: Tidslinjen för att få potatis transgena håriga rötter med A. rhizogenes. De ackumulerade veckorna att nå varje skede i omvandlingsprocessen och de efterföljande stegen att växa hårig rötterna visas. Representativa bilder av olika stadier skildras: inledningen av processen med 3 veckor gamla i vitro växter (A), sedan infektion av växterna genom att injicera A. rhizogenes (B), bildandet av den proliferativa vävnad (C, pilar) med framväxande håriga rötter (D), och utvecklade håriga rötter uttrycker röd fluorescerande omvandling markören DsRed (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. plantera omvandling med A. tumefaciens (figur 2)
Obs: Detta förfarande möjliggör erhållande av transformerade växter. Utvärdera den transgenens effekt, krävs en negativ kontroll. Ett alternativ är att följa proceduren med en A. tumefaciens omvandlas med tomma vektorn. Alternativt, vildtyp växter kan användas.
- Skär och Lägg ett blad från 3-4-vecka-gammal växterna (figur 2A) i en petriskål. Med en skalpell utesluta bladskaft och gör tvärgående nedskärningar (1-3 beroende på leaf storleken) från mitten av bladet kanterna att undvika avskärma dem (figur 2B).
- Omedelbart placera blad flyter på 10 mL färsk 2MS flytande media i en petriskål med abaxial sida upp och stäng plattan. Upprepa steget rymmer upp till 15 lämnar för cv. Désirée och 25 lämnar för ssp. enndigena (beroende på storleken på blad).
- Tillsätt omedelbart 80 µL av A. tumefaciens kultur på OD600 = 0.8 i flytande media och homogenisera plattan manuellt för 1 min att distribuera bakteriell solution.
- Noggrant tätar med tätande film, täck med aluminiumfolie och Inkubera under 2 dagar i en kammare vid 24 ° C att låta omvandlingen uppstår.
- Överföra bladen att hålla abaxial sida upp till CIM medium (figur 2B) och inkubera dem för en vecka i en tillväxt som är kabinett.
- Skrapa det CIM mediet med pincetten så att bladen kan rymmas bättre på media.
- Överföra bladen att hålla abaxial sida upp till SIM-medium (figur 2 c) och inkubera dem i ett skåp, uppfriskande mediet var 7-10 dagar, tills skotten är ca 2 cm hög tillväxt.
- Skrapa det SIM mediet med pincetten så att bladen kan vara helt omgiven av media. När dök upp skotten når locket, arbeta med höga petriskålar (100 x 20 mm, höjd x diameter).
Obs: Förhårdnader bildar efter 2-3 veckor i SIM-medium (figur 2D) och skotten efter 6-7 veckor (figur 2E). Skotten kommer att betraktas som oberoende transformationshändelser när de dyker upp från förhårdnader bildas från oberoende sår.
- Skrapa det SIM mediet med pincetten så att bladen kan vara helt omgiven av media. När dök upp skotten når locket, arbeta med höga petriskålar (100 x 20 mm, höjd x diameter).
- Snitt tre skjuter framkommit från varje callus (anses vara samma transformationshändelsen) (figur 2E), överföra dem till kultur kolvar med MG medium kompletteras med cefotaxime natrium [250 mg/L] för att böka, märka delmängden med ett nummer och Inkubera i en tillväxt som är kabinett för 3-4 veckor eller tills skotten är kraftfull (figur 2F).
Obs: När klippa skotten, ta bort också förhårdnader annars roten inte bildas.- Upprepa detta så många gånger som behövs för oberoende linjer. Upp till 5 olika omvandling kan händelser placeras i en kultur kolv med en diameter på 8 cm att arbeta i fullt förtroende som växter från olika händelser inte blandas.
- Välj den mest kraftfull växten av varje händelse, skär den apikala segmentet av fotograferingen med 3-4 internoder och placera det i en ny kultur-kolv med 2MS medium kompletteras med cefotaxime natrium [250 mg/L].
Obs: I 3-6 veckor anläggningen kommer att växa effektivt, att utveckla ett kraftfullt skott och rötter.- Föra tillbaka till kammaren icke-valda skotten tills den vald planta har fullt utvecklade.
- Skär stammen segment från anläggningen med minst en internoden eller med den apikala knoppen och överföra dem till nya 2MS medium kompletteras med cefotaxime [250 mg/L]. Inkubera dem i tillväxten skåp.
- Replikera varje 3-4 veckor för att upprätta i vitro omvandlas raderna.
Obs: Cefotaxime natrium behövs i minst tre efterföljande överföringar till 2MS medium till att döda den A. tumefaciens. efteråt, om A. tumefaciens överväxt observeras, överföra växterna igen till 2MS media kompletteras med cefotaxime natrium.
- Replikera varje 3-4 veckor för att upprätta i vitro omvandlas raderna.
- För att karakterisera den växt fenotypen, överför växter till jord för deras fullständig karakterisering eller hydrokultur kultur för roten inspektion.
- Förvara knölarna produceras i jord att sprida och underhålla de etablerade linjerna.
Figur 2: Tidslinjen för att få potatis omvandlas växter med hjälp av A. tumefaciens. De ackumulerade veckorna att nå varje skede i omvandlingsprocessen och de efterföljande stegen att växa växter visas. Representativa bilder av olika stadier skildras: inledandet av den processen med blad från 3 - vecka-gammal in vitro- växter (A), överföring av den skadad och infekterad lämnar till CIM media (B), bladen när de överförs till SIM-media (C), visualisering av förhårdnader runt sårade områden efter 2-3 veckor i SIM media (D), skjuta bildandet efter 9-11 veckor i SIM-medier (E) och skotten efter överförs till MG media (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. hydrokultur kultur
- Förbereda den Hoaglands lösning på en halv styrka (0,5 x) (Tabell S2) i en 10 L hink.
- Sänk ett akvariepump för att upprätthålla enhetligheten och ordentlig syreförhållandena.
- Täcka väggarna i hinken med aluminiumfolie att växa rötter i mörka förhållanden.
- Undvika rot skadan, att överföra in vitro- växter till hydrokultur kultur.
Obs: Ta bort alla återstående in vitro- medium från rötterna till undvika mikroorganism spridning under inkuberingen genom att skaka noggrant rötterna nedsänkt i vatten. - Omfatta växter med genomskinlig film som ett växthus att möjliggöra adekvat acklimatisering och inkubera i växande kammaren.
- Göra hål i filmen efter 3 dagar och ta bort den helt en vecka efter.
- Ersätta med färsk media var 10 dagar.
6. GUS histochemical reporter gen assay
Obs: I vårt fall GUSEN analysen utfördes med rötter på 2-3 veckor odlas i hydroponics eller in vitro.
- Fixa rötterna med 90% kylda aceton (v/v) och inkubera det i 20 minuter på isen.
- Utför två tvättar med destillerat vatten.
- Lägga till färska GUS färgning lösning (tabell 1) och tillämpa vakuum (-70 Pa) i 20 min.
- Inkubera vid 37 ° C i mörker att skydda ljuskänsliga GUSEN i 4 h eller tills en blå färg är synliga.
Obs: Förekomsten av ferri- och kaliumferrocyanid i GUS lösning minimera spridningen av reaktionsprodukter och tillhandahålla mer exakt lokalisering.
FÖRSIKTIGHET: Använd dragskåp och bära skyddskläder vid hantering av giftig cyanid derivat i GUS lösning (Kaliumferricyanid och kaliumferrocyanid). GUS substrat och bortskaffande materialet ska kasseras på ett säkert sätt. - Ta bort GUS färgning lösning och kasta den i lämpliga behållare.
- Utför två tvättar med etanol 70% (v/v).
- Observera i ljusa fält Mikroskop.
Obs: GUS färgning är stabil för ett par veckor; under den första veckan, GUS signalen är dock tydlig och diffunderar mindre i angränsande celler. För längre lagring, tätning röret och förvara den vid 4 ° C.
Tabell 1: GUS färgning lösning recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes -medierad potatis transformation
I detta manuskript presenteras det stegvisa förfarandet ställa in att få transformerade rot med A. rhizogenes . Figur 1 presenterar en översikt av förfarandet, som helt och hållet tar omkring 5-6 veckor (injektion av A. rhizogenes att erhålla fullt utvecklad håriga rötter). Anläggningen kan sedan studeras som en komposit (vildtyp skjuta, transgena rot) eller transgena hårig roten kloner kan vara censurerade och vuxit självständigt i solid Gamborg B5 medium kompletteras med 2% sackaros. Alternativt, Hårig rötterna kan massivt förökas med hjälp av flytande Gamborg B5 media. Proceduren presenteras har utförts med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée).
Metoden att övervaka förfarandet och för att få potatis transgena håriga rötter har validerats med en binär vektor med DsRed som transformation markör (PK7GWIWG2_II-RedRoot från VIB-Institutionen för växt systembiologi vid Universiteit Gent). Detta tillåts skillnaden av transgena håriga rötter från icke-transgena av den röd fluorescensen. Enligt det, i figur 3 uppvisade transformerad hårig rötterna röd fluorescens vid belysning med grönt ljus. Den negativa kontrollen använder den ej omformad Agrobacterium visade ingen röd fluorescens (figur 3 c), övergripande indikerar lämpligheten av DsRed omvandling markören att identifiera transgena hårig rötterna (figur 3D). Andra omvandling markörer såsom antibiotikaresistens kan användas som beskrivs av andra författare23,24; antibiotika i media kan dock producera en tillväxt fördröjning i transgena rötter innehållande markören.
Figur 3: Fluorescerande transgena håriga rötter av potatis (cv. Désirée) omvandlas av A. rhizogenes. Hårig rötterna erhölls med hjälp av en icke-omvandlad A. rhizogenes (stam C58C1: pRI1583) (A och C) och med A. rhizogenes (stam C58C1:pRI1583) omvandlas med Tom vektor pK7GWIWG2_II-röd-Root en DsRed transformation markör (B och D). Hårig rötterna bildas i båda infektioner (A, B) men röd fluorescens är bara observerade i håriga rötter omvandlas med den A. rhizogenes som innehåller binära vektorn. Bilderna är tagna med ett stereomikroskop utrustad med en lampa och ett specifikt filter att visualisera den röd fluorescensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Agrobacterium tumefaciens -medierad potatis transformation
Det andra protokollet som beskrivs i detta manuskript är inställd att erhålla, steg för steg, en komplett potatis växt omvandlas med A. tumefaciens. Figur 2 presenterar en översikt av förfarandet, som helt och hållet tar mellan 15-18 veckor (från leaf infektion med A. tumefaciens att erhålla fullt regenererad växter). Den mest tidsödande delen av förfarandet är växten regenerering av organogenes. Detta särskilt steg gör denna metod mer arbetskrävande än att använda A. rhizogenes. Förfarandet har utförts med S. tuberosum spp. tuberosum (cv. Désirée) och S. tuberosum ssp. andigena, den förra är mindre beroende av short-day villkor att inducera tuberization.
I den A. tumefaciens-medierad omvandling, i motsats till den A. rhizogenes -medierad omvandling, regenererad växterna är helt transgena organismer. Men även om de transgena växterna regenereras i en Kanamycin selektiva medier, uttrycka inte alla rader effektivt transgenens. Därför behövs validering av transgenens uttryck.
Jämförelse av aktiviteten FHT arrangören i rötter erhålls med hjälp A. tumefaciens och A. rhizogenes
De ovan nämnda förfarandena tillämpades för att producera rötter uttrycker GUS genen enligt arrangören av FHT -genen. Den kompletta omvandlas växter med A. tumefaciens fanns tidigare rapporterade15, använda den binära vektor pKGWFS7 innehållande Promotorn FHT . Nu, här binära vektor har använts att producera nya transformerade håriga rötter för att jämföra vävnader där arrangören är aktiv och därför att testa hårig rotsystemet som ett verktyg för att studera arrangören aktivering.
Figur 4 visar GUS färgning i rötterna av transgena växter erhålls genom A. tumefaciens (figur 4AB) och transgena håriga rötter erhålls genom A. rhizogenes (figur 4 cD, E, F), respektive. Som kan ses, rötter förvandlas med A. tumefaciens och odlade i vitro visar blå färgning i Endodermisen (figur 4A), en cell-lagret mellan cortex och stele. I mer utvecklade rötter, blå märkning är ojämn i det yttre lagret motsvarar Exodermisen (figur 4B). I transformerad håriga rötter vuxit i hydroponics, lokaliserades GUS markören speciellt i Endodermisen (figur 4 cE), i uppkomsten av laterala rötter (figur 4 dE), i de skadade områdena (figur 4E ) och i Exodermisen (figur 4F). Rötterna visade ingen GUS fläcken i negativa kontroller som var antingen håriga rötter utan PromFHT:GUS T-DNA kassett eller vildtyp rötterna.
Figur 4: Histochemical observation av genmanipulerad potatis rötter uttrycker GUS reporter genen drivs av arrangören av FHT. Rötterna från komplett transgena växter som erhållits genom A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) transformation (A-B) Visa blå färgning i Endodermisen (A) och exodermis (B). Transgena hårig rötterna erhålls genom A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. Désirée) transformation (C-F) Visa GUS färgning i Endodermisen (C och E), i laterala roten uppkomsten (D och E), i zonen sårläkning (E) och i Exodermisen (F). Endodermisen (sv); Exodermis (EX); Xylem (XL); Primordia av en lateral rot (LR). Den röda pilen anger det skadade området. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell S1: Media recept används för växande bakterier och in vitro- växter. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell
Tabell S2: Halva styrkan Hoaglands lösning för växande potatisplantor i hydrokultur. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I potatis använder det vanligaste systemet att få stabil komplett transgena växter omvandlingen av Agrobacterium tumefaciens stammar som kräver organogenesen använder exogent fytohormoner. Även om de Agrobacterium baserat protokoll har potential att integrera icke-T-DNA vektor sekvens25, finns denna metod fortfarande det enklaste och billigare att omvandla potatisplantor. Under senaste åren har intresset för A. rhizogenes-medierad omvandling har fått uppmärksamhet av forskare för att tillåta att erhålla transgena rötter i kortare perioder än att använda A. tumefaciens. A. rhizogenes bevarar fortfarande rot-inducerande (Ri) plasmiden som bär en uppsättning gener som kodar för enzymer för phytohormone auxin kontroll och cytokinin biosyntes och kodning för opines26. När Ri T-DNA sätts in värd genomisk DNA, reglerar nya hormonbalansen de infektera cellerna inducera bildandet av prolifererande rötter, kallas håriga rötter, framväxande vid punkterna infektion27. När en ytterligare binära vektor används för att integrera en främmande DNA, ger bevarandet av Ri plasmiden möjligheten att få transformerade håriga rötter utan behov för organogenes använder exogent-tillämpad fytohormoner28. Hårig rötterna kan upprätthållas kopplad till vildtyp shoot genererar en sammansatt växt eller kan vara själv förökade. Denna förmåga av håriga rötter att själv propagera utnyttjas för att producera i flera växter håriga rötter som ett biologiskt system för massproducera värdefulla metaboliter eller främmande proteiner, generera intressen i farmaceutisk kemi och även Fytoremediering områden ( se för granskning29,30). I potatis (var. Kufri Bahar) smittades transgena kompletta anläggningar med vildtyp A. rhizogenes stam att producera håriga rötter att uttrycka den hepatit B surface antigen (HBsAg)23. Alternativt en komplett transgena anläggning regenereras från håriga rötter kan erhållas, men potatis växt och knölar visade tydlig utveckling jämfört med ej omformad kontrollerna. Dessa skillnader i fenotypen är på grund av den ursprungliga Ri T-DNA integrerat inom genomet31,32.
I detta arbete, de detaljerade förfarandena för att erhålla transgena stabil håriga rötter med A. rhizogenes och transgena stabil växter använder A. tumefaciens presenteras (figur 1 och figur 2). Fullt utvecklad transgena hårig rötterna erhölls i 5-6 veckor, medan transgena rötter med hjälp av A. tumefaciens behövs 15-18 veckor på grund av organogenes kravet från transformerade celler, och urval och förökning av transformerade växter. I våra händer, A. tumefaciens omvandling förfarandet fungerar effektivt i S. tuberosum ssp. andigena och ssp. tuberosum (cv. Désirée), med en rapporterad förvandling effektivitet omkring 35%22 och 48% 12, respektive. Den beskrivna A. rhizogenes transformation förfarandet bygger på som rapporterats av Horn7, som visade en hög (80-100%) omvandling effektivitet i cv. Désirée och andra tre potatis-sorter (Albatros, Sabina och Saturna).
Att presentera A. rhizogenes som en alternativ omvandling systemet för potato funktionella studier och att ange huruvida den första förekomsten av Ri T-DNA var oroande, vi använde vektor båda systemen att omvandla potatis rötter med samma binära som innehöll en T-DNA med en främjare av en suberin biosyntetiska gen (FHT) körning uttrycket av genen GUS reporter. Histochemical analysen visade att i A. tumefaciens förvandlas växter var aktiviteten av promotorn FHT i inre och yttre suberized lager av rötterna (Endodermisen och exodermis, respektive) (figur 4A,B ) och också i de skadade områdena med blad, stam och rotknöl15. I A. rhizogenes omvandlas håriga rötter upptäcktes också aktiviteten i Endodermisen och exodermis och i områdena sårade rot (figur 4E). Samtidig förekomst av aktiviteten suberin arrangören i båda typerna av omvandlade rötter indikerar att Ri integrerat T-DNA inte påverkar de utvecklingsprocesser som relaterade till suberization åtminstone i dessa roten vävnader. I transformerad håriga rötter upptäckt vi också aktivitet av promotorn FHT i områdena kring uppkomsten av laterala rötter (figur 4 d,E). Detta stämmer med promotorn verksamheten rapporteras av andra gener som är involverade i transport av suberin monomerer som ABCG11 / WBC1133,34,35,36 eller regulatorn StNAC103 19. potatis omvandlingen av A. rhizogenes att studera en suberin gen har redan rapporterats nyligen37 och även i det fallet håriga rötter har tillåtet för att Visa arrangören aktivering av CYP86A33, en fettsyra Ω-hydroxylas. Dock GUSEN färgning i rötter var bulk kvantifieras med en fluorometric analys, därav det specifika uttrycket i suberized vävnader var bara antas.
Helt och hållet processer dessa resultat bevis att A. rhizogenes transformation är ett snabbare alternativ verktyg att utforska cell typ-specifika Promotorn aktiveringen av suberin-relaterade gener i rötter, som kan förlängas till studier baserade på andra som uppstå i rötter. Överens, har vissa andra funktionella genetiska studier varit framgångsrika i att använda A. rhizogenes i potatis, tomat och eukalyptus för att demonstrera den gen funktion6,7,8,9, att studera den hormonella svar38,39 eller den arrangören aktivitet40,41. Denna strategi kan dock fortfarande finns begränsningar, särskilt när man studerar hårt styrd utvecklingsprocesser som kan avregleras av Ri T-DNA eller när hela anläggningen eller knölarna eller andra organ som är olika från rötterna vill studeras. I dessa situationer föredras fortfarande A. tumefaciens omvandling systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant till PB), Ministerio de Economía y Competitividad och FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) och den universitet Girona (PhD stipendium till SF och grant SING11/1). Författarna är tacksamma till Dr Inge Broer (Institutet för markanvändning, universitetar av Rostock, Rostock, Tyskland) och Dr Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) för att tillhandahålla den A. rhizogenes och A. tumefaciens stam, respektive, och Dr Marçal Soler och Dr Anna Plasencia för hjälp och stöd som fick inleda A. rhizogenes transformation experimenten (Toulouse III Paul Sabatier universitet — CNRS, växt forskning laboratorium (LRSV), Castanet Tolosan, Frankrike). Författarna tackar Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) för hennes värdefulla bistånd vid genomförande av laboratoriearbetet och skötsel av växter, och Ferran Fontdecaba och Carla Sánchez som bistod med några av experiment medan de gjorde deras slutliga examensarbeten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
| Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
| Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
| Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
| Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
| BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
| Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
| Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
| Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
| Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
| DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
| Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
| Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
| Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
| Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
| Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
| Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
| GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
| Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
| Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
| Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
| Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
| Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
| Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
| Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
| MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
| Microscope |
Olympus |
||
| Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
| Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
| NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
| NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
| NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
| Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
| Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
| Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
| pHmetre |
Crison |
||
| Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
| Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
| Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
| Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
| Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
| Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
| Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
| Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
| Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
| Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
| Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
| Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
| Triton |
Serva |
37240 |
|
| Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
| Vacuum |
Dinko |
||
| x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
| Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
| Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
