Denne protokol beskriver brugen af enkelt kæde MHC klasse I komplekser til at undersøge molekylære interaktioner i menneskelige CD8 + T celle aktivering: generation af manipuleret antigen præsentere celler, der udtrykker enkelt kæde konstruktioner, kultur menneskelige CD8 + T celle klon og T-celle aktivering eksperimenter.
Ikke-stimulerende self peptid MHC (pMHC) komplekser Fremkald ikke T-celle aktivering og effektor funktion, men kan forbedre T-celle svar til agonist pMHC, gennem en proces, der kaldes co-agonisme. Denne protokol beskriver en eksperimentel system at undersøge co-agonisme under menneskelige CD8 + T celle aktivering af udtrykker humane MHC klasse I molekyler præsenterer forudbestemte peptider som enkelt polypeptider (enkelt kæde MHC) i en xenogene cellelinie. Vi udtrykt enkelt kæde MHCs betingelser hvor lave niveauer af agonist enkelt kæde p-MHC komplekser og høje niveauer af ikke-stimulerende enkelt kæde p-MHC komplekser blev udtrykt. Brug af denne eksperimentelle systemet tillod os at sammenligne CD8 + T-celle svar til agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af ikke-stimulerende pMHC. Protokollen beskriver celle linje Transfektion med enkelt kæde MHC konstruktioner, generation af stabil celle linjer, kultur af hepatitis B virus-specifikke menneskelige CD8 + T-celler og T-celle aktivering eksperimenter samtidig kvantificere cytokin produktion og degranulering. De præsenterede metoder kan bruges til forskning om forskellige aspekter af CD8 + T-celle aktivering i human T-celle systemer med kendt peptid MHC specificitet.
MHC klasse I (MHC-jeg) molekyler præsenterer kort (8-10 aminosyrer) peptider afledt af proteiner syntetiseret af hver celle. MHC-jeg molekyler på raske celler præsentere self peptider afledt af endogene proteiner. Viral infektion fører til præsentation af ikke-selv virus-afledte peptider på MHC-jeg, men selv inficerede celler nuværende ikke-selv peptider ved tilstedeværelse af store mængder af self peptid-MHC (pMHC). MHC-jeg er anerkendt af T-celle receptoren (TCR) og CD8 Co receptor på T-celler. TCR bindende affinitet til peptid pMHC er stærkt afhængige af sekvensen af præsenteres peptider, CD8 bindende er peptid-uafhængig. TCR binding til ikke-selv agonist pMHC komplekse fører til T-celle aktivering og effektor funktion. Ikke-stimulerende self pMHC komplekser Fremkald ikke T-celle aktivering og effektor funktion, men kan forbedre T-celle svar til agonist pMHC, gennem en proces, der kaldes co-agonisme1,2,3. Co-agonisme er blevet observeret i mus CD4 + T celler4,5,6 samt mus og menneskelige CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiske tilstande, T-celler skal genkende begrænsede mængder af agonist pMHC på antigen præsentere celler (PMV’er) Co præsenterer høje niveauer af ikke-stimulerende pMHC komplekser, tyder på, at co-agonisme bidrager til optimal T celle svar in vivo. Cellen Total overflade MHC klasse jeg niveauer er ofte downregulated under virusinfektioner14 og på tumorer15. Denne immun unddragelse strategi falder agonist pMHC præsentation, men også reducerer mængden af co agonist pMHC jeg tilgængelig for T-celle aktivering ekstraudstyr. Desuden klasse høj celle overflade udtryk niveauer af MHC I molekyle HLA-C har vist sig at korrelere med forbedret HIV kontrol16, hvilket tyder på en afgørende rolle for samlede MHC klasse udtryk i T-celle aktivering. Trods den fysiologiske betydning af co-agonisme, er dens molekylære mekanisme stadig utilstrækkeligt forstået. Dette skyldes hovedsageligt tekniske udfordringer for eksperimentelt kontrollere mængden af præsenteres Co agonist pMHC samtidig holde agonist pMHC konstant.
Vi udviklede en eksperimentel system at undersøge co-agonisme under menneskelige CD8 + T celle aktivering af udtrykker humane MHC klasse I molekyler præsenterer forudbestemte peptid som enkelt polypeptid (enkelt kæde MHC-I, figur 1A) i en xenogene celler linje9,10. Enkelt kæde (sc) agonist pMHC blev udtrykt under kontrol af tetracyclin-inducerbar promotor i den hamster-afledte T-REx CHO cellelinie, udtrykker tetracyklin repressor; Dette giver mulighed for meget lave “utætte” udtryk for sc agonist pMHC i mangel af tetracyklin og høj sc agonist pMHC udtryk efter tilsætning af tetracyklin (figur 1BC). Sc agonist at udtrykke pMHC T-REx CHO celler blev derefter supertransfected med ikke-stimulerende, co agonist sc pMHC-jeg under kontrol af en constitutively aktiv promotor (figur 1BC). Brug af denne eksperimentelle systemet tillod os at sammenligne CD8 + T-celle svar til agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af høje niveauer af ikke-stimulerende pMHC. Kritisk, da peptid og MHC-jeg tunge kæde er kovalent knyttet i scMHC-jeg format, dette giver introduktioner af mutationer i MHC molekyler præsenterer forudbestemte peptider. Brug af scMHC-jeg teknologi således tilladt os at specifikt modulere TCR eller CD8-bindende egenskaber af agonist eller co agonist pMHC.
Co-agonisme i CD8 + T celle aktivering er blevet observeret ved hjælp af renset MHC-jeg komplekser præsenterer agonist og co agonist peptider i form af heterodimers11,17 eller præsenteres på quantum dots12,13. Tidligt arbejde på co-agonisme i CD8 + T celle aktivering inden for rammerne af agonist pMHC anerkendelse på APC brugt TAP2-mangelfuld cellelinjer som pansrede mandskabsvogne. HANEN er nødvendig for peptid transport fra cytoplasmaet til det endoplasmatiske reticulum, og HANEN-vitaminmangel reducerer stærkt puljen af tilgængelige MHC klasse-bindende peptider. I mangel af peptider, den spirende kompleks af MHC klasse I tunge kæde og β2– mikroglobulin er ustabilt, hvilket resulterer i meget lav MHC-jeg cellens overflade udtryk. I første omgang, afslørede sammenligning af T-celler stimuleret med antigen indlæst på TAP-tilstrækkelig – og mangelfuld mus RMA og RMA-S cellelinjer, henholdsvis som pansrede mandskabsvogne, ikke nogen beviser for co-agonisme under musen T-celle aktivering18. Men brugen af dette eksperimentelle system ikke tillod præcis kontrol over mængden af agonist pMHC præsenteret uafhængigt af ikke-stimulerende self pMHC. Desuden, disse to cellelinjer kan også variere i udtryk for andre molekyler, der modulerer T-celle aktivering, såsom ligander til T-celle co-stimulatory eller hæmmende receptorer eller adhæsionsmolekyler.
Efterfølgende, udviklede vi en protokol til indlæsning af TAP2-mangelfuld RMA-S celler med eksogene peptider til præsentation af et fast beløb af agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af ikke-stimulerende pMHC. Dette blev opnået gennem følgende: inkubation af TAP2-mangelfuld RMA-S cellerne ved lavere temperaturer (28 ° C, i stedet for de sædvanlige 37 ° C) for at stabilisere Tom MHC klasse i tunge kæde/β2 mikroglobulin komplekser19; inkubation ved 28 ° C med eksogene agonist peptid; inkubation ved 28 ° C i tilstedeværelse eller fravær af eksogene ikke-stimulerende peptid; og inkubation ved 37 ° C at reducere celle overflade udtryk for tomme MHC klasse I komplekser8,9. Brug af dette eksperimentelle set-up afslørede, at tilstedeværelsen af ikke-stimulerende pMHC forøget aktivering af musen thymocytter, naive perifere CD8 + T celler og CTLs8. Mekanisk, tilstedeværelsen af ikke-stimulerende pMHC kan fremkalde CD8 rekruttering til T celle: APC immun synapse selv i mangel af agonist pMHC, og ikke-stimulerende pMHC kan forbedre TCR interaktion med CD8 coreceptor7,8. Men denne eksperimentelle system ikke tillader test TCR og CD8 coreceptor binding til agonist og co agonist pMHC relative bidrag i mediating ekstraudstyr aktivering som ændringer at ændre TCR eller CD8 binding til MHC klasse ville jeg påvirke alle MHC molekyler, uanset den præsenteres peptid. Derfor brugte vi MHC klasse jeg enkelt kæde teknologi for at overvinde dette problem.
Enkelt kæde (sc) MHC klasse jeg format har været brugt før at forbedre antigene pMHC præsentation for terapeutiske strategier, og at besvare grundlæggende spørgsmål om mekanismer af TCR og NK celle receptor aktivering og fungere20,21 . scMHC-jeg består af peptid, β2– mikroglobulin og MHC-jeg tunge kæde følgeskab af to fleksible Serin/glycin-rige linkers (figur 1A), flere forskellige linker sekvenser er blevet udviklet og testet22. scMHC-jeg kan folde uafhængigt af HANEN komplekse og ledsage proteiner kræves til konventionelle pMHC komplekse forsamling20. scMHC-jeg har vist sig at folde korrekt, som bestemmes ved hjælp af kropsbygning-specifikke antistof farvning22 og ved at løse sc struktur med røntgenkrystallografi23. De grundlæggende scMHC-jeg design er blevet ændret for at forbedre bindingen af lav affinitet peptider24,25.
Denne protokol beskriver brugen af menneskelige scMHC-jeg at undersøge co-agonisme under humane Tillidsliste klon aktivering. Protokollen er blevet optimeret til humane Tillidsliste klon specifikke for en epitop af Hepatitis B virus (HBV). HBV er en svær healthcare byrde på verdensplan, som der er 350 millioner mennesker smittet med HBV og kronisk HBV infektion kan føre til udvikling af hepatocellulært carcinom (HCC). HCC celler som følge af HBV infektion kan normalt præsentere HBV-afledte epitoper og kan genkendes på specifikke humane T celler. HBV og HCC clearance er afhængig af human T-celle svar26, men HCC patienter lider ofte af T celle udmattelse og nedsat T celle svar27. Indførelsen af HBV-specifikke TCR i T-celler af HBV har været forsøgt som potentielle immunterapi strategi at fjerne kroniske HBV infektion28. Men det er uvist, om denne metode vil være effektiv i en klinisk indstilling, på grund af de lave niveauer af overflade MHC-I humane hepatocytter29. Derfor kan forstå mekanisme af coagonism give alternative perspektiver for immunterapi af HBV, eventuelt ved at forbedre præsentationen af endogene pMHC til at fremkalde co-agonisme-medieret T celle svar. Protokollen omfatter alle de nødvendige skridt til forskning på menneskelige co-agonisme: Transfektion af T-REx CHO celler med agonist og co agonist sc pMHC, generation af stabil T-REx CHO cellelinjer, kultur af HBV-specifikke humane Tillidsliste CD8 + T cellelinje og CTL aktivering forsøg kvantificering cytokin produktion og degranulering svar på T-REx CHO celler. Selvom vi fokuserer på ved hjælp af sc MHC klasse i-teknologi til at undersøge co-agonisme under HBV T celle aktivering, skal det bemærkes, at de præsenterede metoder kan nemt tilpasses til forskning på andre aspekter af T-celle aktivering i human T-celle systemer med kendt pMHC-jeg specificitet.
Denne protokol bruger en menneskelige CD8 + CTL linje specifikke for HBV-afledte peptid E183-91 (FLLTRILTI: “E183”)30 præsenteret på HLA-A2. SC HLA molekyler bestående af et signal sekvensen fra menneskelige β2-mikroglobulin, et HLA-A2 bindende peptid af interesse, en glycin/Serin linker, en menneskelig β2-mikroglobulin, et glycin/Serin linker og en A2 tunge kæde kan være kommercielt syntetiseret (figur 1A ). Plasmider kodning scA2 konstruktioner med agonist E183 peptid eller coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 peptider er ledige fra forfattere efter anmodning. Peptid rækkefølge kan ændres ved hjælp af webstedet instrueret-mutagenese. Tetracyclin-inducerbar vektor blev pcDNA5/at brugt til at udtrykke agonist enkelt kæde HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I nærværelse af tetracyklin repressor, pcDNA5/at plasmid tillader kun meget lav, “utætte” udtryk for protein af interesse; høj udtryk kan være fremkaldt ved tilsætning af tetracyklin (figur 1BC). Brug af en tetracyklin-inducerbar ekspressionssystem giver kontrol over mængden af celle overflade agonist pMHC udtryk. En konstitutiv udtryk plasmidet pcDNA3.1 blev brugt til at udtrykke coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracyclin-regulerede udtryk (T-REx) CHO cellelinje (hamster cellelinie, ingen endogene humane MHC) blev brugt til at udtrykke agonist og co agonist sc-HLA-A2 konstruktioner. Denne eksperimentelle system giver præcis kontrol over pMHC præsentation (figur 1 c): ingen pMHC præsentation (untransfected T-REx), en stor mængde af co agonist pMHC præsentation (konstitutiv sc GAG-HLA-A2 udtryk), et lavt beløb af agonist pMHC præsentation (sc E183-HLA-A2 i mangel af tetracyklin), en stor mængde af agonist pMHC præsentation (sc E183-HLA-A2 i overværelse af tetracyklin), et lavt beløb af agonist pMHC præsentation og høj udtryk for Co agonist pMHC (sc E183-HLA-A2 i den fravær af tetracyklin og konstituerende sc GAG-HLA-A2 udtryk). Brug af denne eksperimentelle system giver præcis kontrol over celle overflade mængder af agonist og coagonist pMHC.
Præsenteres protokollen giver en robust værktøj til undersøgelse af molekylære interaktioner under menneskelige CD8 + T celle aktivering. Et kritisk trin for undersøgelse af co-agonisme under human T-celle aktivering er kontrol over agonist pMHC celle overflade udtryk at sikre lige agonist pMHC præsentation på PMV’er med eller uden Co agonist pMHC udtryk. I vores eksperimentel system, dette opnås ved hjælp af en enkelt celle klon udtryk for lavt beløb af agonist pMHC, efterfulgt af supertransfection med en co agonist pMHC konstruktion og agonist pMHC kvantificering ved hjælp af TCR-lignende antistof10, 32. som agonist sc pMHC udtryk kan ændre sig over tid, det er afgørende at kvantificere agonist pMHC overflade udtryk på PMV’er anvendes i hvert eksperiment ved hjælp af TCR-lignende antistoffer. Hvis ingen specifikke TCR-lignende antistof er tilgængelige, agonist scMHC-jeg kan udtrykkes som fluorescerende proteiner fusion, og dets celle overflade udtryk kan derefter kvantificeres ved hjælp af en følsom mikroskopi metode, som total interne reflection Fluorescens mikroskopi 35 , 36. Derudover celle overflade udtryk for Co agonist pMHC aftager over tid, på grund af methylering-afhængig og -uafhængig hæmning af CMV promotor37, og bør overvåges ved hjælp af antistof farvning og flow flowcytometri analyse, med gentagne FACS-sortering efter behov. Vi har kulturperler CHO celler op til 5 uger med relativt begrænset tab af sc pMHC udtryk. Vi anbefale varmt frysning CHO celler hurtigt efter valg/sortering til at sikre en pålidelig bestand af celler med kendt sc MHC udtryk.
De flere skridt præsenteret protokoller kan ændres, afhængigt af tilgængeligheden af udstyr eller afhængigt af de specifikke forskning mål. For eksempel PBMC spredning potentielle kan blive hæmmet (trin 3.2.1) ved hjælp af alternative metoder, der ikke kræver en gamma (eller X-) irradiator, såsom behandling med mitomycin C38. En ikke-enzymatiske celle dissociation buffere der indeholder metal chelatorer39 kan bruges i stedet for celle skrabning taktfast 3.3.1. Derudover antigen præsentere systemet kan ændres for at gøre det mere velegnet til kloning af mennesker CTL udtryk for forskellige TCRs. CHO celler udtrykkelige hamster MHC klasse I molekyler, og selv om disse er irrelevant for linjen CTL studerede her (figur 2A og Figur 3A, vi observerede ingen T-celle svar til untransfected CHO celler), der er en mulighed for, at andre menneskers TCRs kan vise nogle xenoreactivity. I at sagen, hamster MHC klasse I udtryk kan reduceres ved at udskære hamster β2-microglubulin eller tryk ved hjælp af CRISPR/Cas9; eller en menneskelig APC linje kan bruges efter CRISPR/Cas9-medieret β2-microglubulin eller TAP banke.
Eksperimentelle systemet præsenteres her tillader præcis styring af TCR og CD8 interaktioner med MHC molekyler præsenterer foruddefinerede peptider. For eksempel, har vi tidligere vist at mutationer afskaffe CD8 bindende40 til coagonist pMHC elimineret coagonist-medieret aktivering ekstraudstyr i murine og menneskelige CD8 + T celler9,10, mens om ophævelse af TCR interaktion med co agonist pMHC havde ingen effekt på coagonist-medieret aktivering enhancement10. Brugen af enkelt kæde MHC konstruktioner har imidlertid flere begrænsninger. For eksempel, det er tid og arbejdskraft-forbrugende at teste flere Co agonist peptid sekvenser ved hjælp af denne eksperimentelle system, da dette indebærer generation af flere plasmider kodning sc MHC med forskellige peptider, og efterfølgende transfections og celle sortering. Tidligere vi brugt murine TAP-mangelfuld cellelinie RMA-S til at teste flere Co agonist peptider i musen T-celle aktivering8,9, men denne tilgang blev ikke gennemført med TAP-mangelfuld menneskelige T2 celle linje10, mest sandsynligt på grund af præsentation af TAP-uafhængig peptider41. En anden begrænsning af vores eksperimentel system er der er ikke giver en hurtig metode til at ændre mængden af co agonist pMHC molekyler ved fastlæggelsen af den kritiske mængde Co agonist pMHC kræves for at udløse T-celle aktivering. Derudover tillader tetracyklin-inducerbar systemet anvendes ikke titrering af agonist pMHC mængde på niveauet enkelt celle ved at ændre tetracyklin koncentration, som varierende tetracyklin koncentration ændrer andelen af HLA-A2 positive celler, stedet for HLA-A2 niveauer på pr. celle grundlag. En alternativ tilgang, som vi undersøger i øjeblikket er at bruge understøttede lipid dobbeltlag42, tidligere brugt til at undersøge co-agonisme under murine CD4 + T celle aktivering4 eller perler præsenterer fast beløb af agonist pMHC i den tilstedeværelsen af forskellige mængder af co agonist pMHC. Når det bruges sammen med UV-cleavable peptid teknologi4,43, disse alternative eksperimentelle systemer bør give mulighed for hurtig test af flere Co agonist peptid sekvenser samt forskellige mængder af co agonist pMHC .
Sc MHC teknologi kan også være relevant til undersøgelse af co-agonisme i menneskelige eller murine CD4 T celler, som enkelt kæde MHC klasse II molekyler præsenterer forudbestemt peptider med succes har udtrykt på pattedyr celle overflader44. Desuden kan brug af sc MHC teknologi udvides til at omfatte undersøgelse af ikke-klassisk MHC molekyler såsom HLA-E. SC HLA-E har været beskrevet før, og dens udtryk har vist sig at hæmme human T-celle aktivering45. En anden ikke-klassisk MHC molekyle af interesse er CD1, som præsenterer lipider i stedet for peptider46. SC konstruktioner bestående af CD1 tunge kæde og β2-mikroglobulin har vist udtrykkes på celleoverfladen og binde relevante lipid ligander47. Enkelt kæde MHC teknologi har stort potentiale som et forsknings-værktøj for at undersøge molekylære interaktioner under T og NK celle aktivering.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Singapore Ministry of Healths nationale medicinske Forskningsråd under sin CBRG/0064/2014 til N.R.J.G., ved Opret under sin R571-002-012-592 til P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 til P.A.M ., og af en Singapore Translationel forskning (STaR) Investigator Award (NMRC-STaR-013/2012) til A.B. Vi er taknemmelige for Dr. Paul Hutchinson og Mr. Teo Guo Hui fra NUS immunologi programmet Flow Core facilitet ved ekspert celle sortering. Vi er taknemmelige for Elijah Chen kritisk læsning af manuskriptet.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |