このプロトコルの使用を記述する単一のチェーンの MHC のクラス I 人間 cd8 陽性 T 細胞活性化の分子間相互作用を調査する錯体: 世代人工抗原提示単一のチェーンを表現する細胞の構築では、人間 cd8 陽性 T 細胞クローンの文化そして T 細胞活性化実験。
非刺激自己ペプチッド MHC (pMHC) の複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが、co されると呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。このプロトコルを記述する実験的人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子として前もって決定されたペプチドを提示単一のポリペプチド (単一のチェーン MHC) 異種細胞。アゴニスト単一のチェーン p MHC 複合体の低レベルと非刺激の単一チェーン p MHC 複合体の高レベルが表現された条件の下で単一のチェーン非自己を表現しました。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。プロトコルはセル行トランスフェクションを記述単一チェーン MHC 構造、安定したセルの世代ライン、B 型肝炎ウイルスに固有人間 cd8 陽性 T 細胞の培養 T 細胞活性化実験同時に定量化のサイトカイン産生とし脱顆粒。提示方法は知られているペプチッド MHC の特異性と人間の T 細胞における cd 8 + T 細胞活性化のさまざまな側面の研究のため使用できます。
MHC のクラス I (MHC-私) 分子は各細胞で合成されるたんぱく質から派生した短い (8-10 アミノ酸) ペプチドを提示します。MHC-私の健康な細胞の分子存在自己ペプチドに由来する内因性のタンパク質です。ウイルス感染は、MHC に非自己ウイルス由来ペプチドのプレゼンテーションにつながる- けど、大量自己ペプチド-MHC (pMHC) の存在下でも感染細胞存在の非自己ペプチド。MHC-私が T 細胞受容体 (TCR) と T 細胞 CD8 共受容体で認識されます。TCR 親和性ペプチド pMHC には、CD8 バインディングはペプチドに依存しないに対し提示されたペプチドのシーケンスに大きく依存です。複雑な非自己アゴニスト pMHC に TCR バインディングは、T 細胞の活性化とエフェクターの機能に します。非刺激の自己 pMHC 複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが co される1,2,3と呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。マウス cd4 陽性 T 細胞4,5,6同様にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞7,8,9,10, Co されるが観察されています。11,12,13生理条件下で T 細胞が抗原提示細胞 (APCs) 共同提示最適な T に貢献するその co される示唆している非刺激 pMHC 錯体の高レベルの限られた数 pMHC アゴニストを認識する必要が。生体内で細胞の応答。総細胞表面の MHC クラス レベル ウイルス感染症14中と腫瘍15ダウンレギュ レートが多い。この免疫回避戦略アゴニスト pMHC プレゼンテーションを減少、また共同作動薬 pMHC の量を減らす私は T 細胞活性化強化のために利用できます。また、高い細胞表面 MHC の発現分子の HLA C が T 細胞の活性化で式に改良された HIV 制御16、総 MHC のクラスの重要な役割を示唆して関連付けるため示されている種します。Co される生理学的意義、にもかかわらずその分子機構はまだ不完全に理解されます。これは主に実験的アゴニスト pMHC を変えずに提示された共同作動薬 pMHC の量を制御する技術的な課題のためです。
実験を行った人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子の単一のポリペプチドとして前もって決定されたペプチドを提示 (単一のチェーン MHC-私は、図 1 a) 異種細胞で9,10 を行します。テトラサイクリン リプレッサー; を表現するハムスター由来の T-レックス町細胞株におけるテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御の下で表現された単一のチェーン (sc) アゴニスト pMHCこれはテトラサイクリンとテトラサイクリン (図 1 b、C) の付加の後の高い sc アゴニスト pMHC 式の不在で sc 作動薬 pMHC の非常に低い「漏れやすい」表現ことができます。当時の sc アゴニスト pMHC 表現する T-レックス CHO 細胞非促進共同アゴニスト sc pMHC と supertransfected-(図 1 b、C) 恒常活性プロモーターの制御下で私。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の高レベルの存在の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。批判的に、以来、ペプチドと MHC-私重鎖は、scMHC にリンクされて共有-私はフォーマット、これにより、事前に決定されたペプチドを提示 MHC 分子に変異の紹介。ScMHC の使用-私技術はこうして特にアゴニストまたは共同作動薬 pMHC の TCR や CD8 バインディングのプロパティを調整することができました。
Cd 8 + T 細胞の活性化で Co されるは、精製された MHC を使用して観察されている-私提示アゴニストと共同アゴニスト ヘテロ11,の形でペプチド複合体17またはに提示量子ドット12,13。APC のアゴニスト pMHC 認識のコンテキストで cd 8 + T 細胞の活性化で共同作動の初期の作品は、Apc として TAP2 欠損細胞株を使用しました。タップは小胞体の細胞質からペプチド輸送に必要なタップ欠乏著しく低下利用可能な MHC クラス – 結合ペプチドのプール。ペプチドのない場合は、MHC の初期の複合体クラス I の重鎖と、β2– ミクログロブリンは安定して、非常に低い MHC の結果-携帯表面表現ですね。当初は、タップ十分・ RMA ヘテロ欠損マウスおよび RMA S セルラインに読み込まれる抗原で刺激された T 細胞の比較それぞれ、Apc は、明らかにしなかった co されるの任意の証拠マウス T 細胞活性化18中。しかし、この実験システムの使用は非刺激の自己 pMHC とは独立して表示作動薬 pMHC の量を正確に制御をできませんでした。さらに、これらの 2 つの細胞株は、T 細胞共刺激または抑制性の受容体にリガンドなどの T 細胞の活性化を調節する他の分子や接着分子の発現にも異なる場合があります。
その後、我々 は非刺激 pMHC の有無で定額作動薬 pMHC のプレゼンテーションを許可する外因性ペプチド TAP2 欠損 RMA S セルの読み込みのためのプロトコルを開発しました。これは次によって達成された: TAP2 欠損 RMA-S の潜伏は空の MHC を安定させるために (28 ° C、代わりに通常の 37 ° C) 低い温度で細胞クラス I 重いチェーン/β2ミクログロブリン錯体19;外因性アゴニスト ペプチドの 28 ° C の孵化外因性非促進ペプチドの存在の有無で 28 ° c の孵化空の MHC の細胞表面発現を減らすために 37 ° C で培養種複合体8,9。この実験のセットアップの使用では、非刺激 pMHC のプレゼンス強化マウス胸腺細胞、素朴な末梢血 cd8 陽性 T 細胞および Ctl8の活性化であることを明らかにしました。機械論的に、非刺激 pMHC の存在は、アゴニスト pMHC の不在でも T 細胞: APC 免疫シナプスに CD8 募集を引き起こすことができるし、非刺激 pMHC CD8 コレセプター7,8と TCR 相互作用を高めることができます。しかし、この実験システムはできませんと思います MHC クラスへ TCR や CD8 のバインドを変更する変更として活性化促進を媒介にアゴニストと共同アゴニスト pMHC する TCR および CD8 のコレセプター バインディングの相対的な貢献をテスト提示されたペプチドに関係なく、すべての MHC の分子に影響を与えます。したがって、この問題を克服するためにチェーンの技術を 1 つ MHC クラスを使用しました。
私は形式の単一のチェーン (sc) MHC クラス治療戦略のための抗原 pMHC プレゼンテーションを改善するために、TCR と NK 細胞受容体の活性化機構に関する基本的な質問に答えるし、20,21 の機能に使用されています。.scMHC-構成ペプチド、β2– ミクログロブリンと MHC-私重鎖は 2 つの柔軟なセリン/グリシンに富んだのリンカー (図 1 a) で参加している、いくつかの異なるリンカー配列されている開発および22のテストします。scMHC-私は複雑なタップとは関係なく折るし、従来の pMHC の複雑なアセンブリの20に必要なタンパク質のシャペロンします。scMHC-私が正しく、22を汚すコンホメーション特異抗体を用いて、x 線結晶構造解析23sc 構造を解くことによって折る示されています。基本的な scMHC-私低親和性ペプチド24,25の結合を改善するために設計が変更されています。
このプロトコルは、人間の scMHC の使用を説明します-ヒト CTL 中 co 作動を調査するクローンのアクティブ化。ヒト CTL クローン B 型肝炎ウイルス (HBV) の抗原のために特定のプロトコルを最適化されています。HBV は、世界中の厳しい医療負担 3 億 5000 万人が b 型肝炎と慢性 b 型肝炎感染に感染肝細胞癌 (HCC) の開発につながることができますがあります。HBV 感染から生じる肝細胞癌細胞 b 型肝炎ウイルス由来の抗原を提示することができます通常、特定の T 細胞によって認識することができます。B 型肝炎と肝クリアランスが人間の T 細胞の応答26に依存していますが、肝細胞癌患者は多くの場合 T 細胞の枯渇および減らされた T 細胞応答27苦しみます。慢性 HBV 感染症28を除去するために潜在的な免疫療法戦略として b 型肝炎ウイルス特定の TCR の HBV の T 細胞への導入を試みた。ただし、それは知られている場合このメソッドは表面の MHC の低レベルのため、臨床の現場で有効になります-ひと肝細胞29で。したがって、coagonism のメカニズムを理解することがあります別の視点 b 型肝炎での免疫療法のおそらく co 作動による T 細胞反応を誘導する内因性の pMHC のプレゼンテーションを強化しています。人間共同作動の研究のためのすべての必要な手順をカバーするプロトコル: アゴニストと共同アゴニストの sc pMHC、安定した T-rex 町細胞ラインの生成、HBV 固有ヒト CTL cd8 陽性 T 細胞株と CTL 活性化の文化と T レックス CHO 細胞のトランスフェクションサイトカイン産生と T レックス CHO 細胞への応答における脱顆粒の定量化実験。Sc MHC の使い方に焦点をクラス I の HBV の T 細胞の活性化中に co 作動を調査する技術、その提示方法簡単に適応できます T 細胞活性化の他の側面の研究のため知られている pMHC ヒト T 細胞系における留意しなければならない-私特異性。
このプロトコルを使用して、人間 cd8 CTL ライン特定 b 型肝炎ウイルス由来ペプチド E183 91 (FLLTRILTI:「E183」)30 HLA A2 に表示されます。sc HLA 分子が人間の β 2-ミクログロブリンから信号系列から成る、関心、グリシン/セリン リンカー、人間の β 2-ミクログロブリン、グリシン/セリン リンカーと重鎖は商業的にすることができます A2 の HLA A2 結合ペプチド合成 (図 1 a).リクエストに応じて著者からプラスミド アゴニスト E183 ペプチッド、または coagonist HIV ギャグ (SLYNTVATL)31ペプチド scA2 コンストラクトがあります。ペプチッド シーケンスは、サイト監督変異を使用して変更できます。テトラサイクリン誘導ベクトルに/pcDNA5 アゴニスト単一の鎖 HLA A2 E183 ペプチド (sc E183 HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン リプレッサー、pcDNA5 の存在下で/プラスミドにより興味の蛋白質の非常に低い、「漏れやすい」表現テトラサイクリン (図 1 b、C) の添加により、高発現を誘起することができます。テトラサイクリン誘導発現システムは、細胞表面のアゴニスト pMHC 発現量を制御できます。発現プラスミド pcDNA3.1 coagonist scA2 ギャグ ペプチド (sc ギャグ HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン調節式 (T-レックス) 町セルライン (ハムスター細胞株、ない内生人間 MHC) は、アゴニストおよび共同アゴニストの sc HLA A2 構造を表現する使用されました。実験的なシステムにより、pMHC のプレゼンテーション (図 1) を正確に制御: pMHC プレゼンテーション (融合 T-レックス)、共同アゴニスト pMHC プレゼンテーション (構成 sc ギャグ HLA A2 式) の高額、低量アゴニスト pMHCプレゼンテーション (不在で sc E183 HLA A2 テトラサイクリン)、アゴニスト pMHC プレゼンテーション (テトラサイクリン存在下で sc E183 HLA A2) の高額、低量アゴニスト pMHC プレゼンテーションと共同作動薬 pMHC の高発現 (sc E183 HLA A2、テトラサイクリン、および構成 sc ギャグ HLA A2 式の不在)。実験的なシステム アゴニストと coagonist pMHC の細胞表面の量の正確なコントロールを使用します。
提案するプロトコルは、人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化における分子間相互作用の解明の堅牢なツールを提供します。人間の T 細胞のアクティブ化中に co されるの調査のための重要なステップは、アゴニスト pMHC 細胞表面発現 pMHC Apc 共同アゴニスト pMHC 式の有無について等しいアゴニストを確保するための制御です。実験体制の共同アゴニスト pMHC アゴニストを構築し pMHC 定量化 TCR のような抗体10、を使用して supertransfection がそれに続く作動薬 pMHC の少量を表現する単一細胞クローンを使用して、これは、32. アゴニスト sc pMHC 式は、時間をかけて変更することが、TCR のような抗体を用いた実験で使用されている Apc のアゴニスト pMHC 表面式を定量化する重要です。特定の TCR のような抗体がない場合アゴニスト scMHC-蛍光タンパク質融合として表現できる、全内部反射蛍光顕微鏡などの機密性の高い顕微鏡法を使用しては、その細胞表面発現を定量化し、35,36しますさらに、共同作動薬 pMHC の細胞表面発現37CMV プロモーターのメチル化依存性および非依存を黙らせるために、時間をかけて減少し抗体染色と流れフローサイトメトリー解析を用いた監視する必要があります。繰り返し FACS の並べ替えに必要なとき。Sc pMHC 式の比較的限られた損失で最大 5 週間 CHO 細胞培養を行ったが。我々 はすぐに知られている sc MHC の発現と細胞の信頼性の高い在庫を確保するための選択/並べ替え後 CHO 細胞を凍結をお勧めします。
示されたプロトコルのいくつかの手順は、機器の可用性によって、または特定の研究目的に応じて変更できます。たとえば、PBMC 拡散潜在的なガンマ (または x) を必要としない方法を使用すると抑制 (ステップ 3.2.1) にすることができます照射、マイトマイシン C38による治療など。セル ステップ 3.3.1 でこするのではなく、金属キレート剤39を含む非酵素的細胞解離バッファーを使用できます。異なる Tcr 町細胞エクスプレス ハムスター MHC を表現する CTL クローン人間のクラス I の分子とこれらがここで学んだ CTL ラインの関連がより適しているように抗原提示システムを変更ことができますさらに、(図 2 aと。図 3 a、認められなかった融合 CHO 細胞 T 細胞応答)、他の人間の Tcr がありますいくつかの xenoreactivity を示す可能性があります。ハムスター β 2-microglubulin をノックして削減することができますまたは CRISPR/Cas9; を使用してをタップこと場合は、ハムスターの MHC のクラス I の式または CRISPR/Cas9 を介する β 2 microglubulin またはタップをノックアウトした後、人間の APC ラインを使用ことができます。
ここで紹介する実験システムは、事前定義されたペプチドを提示 MHC 分子と TCR および CD8 の相互作用の正確に制御できます。たとえば、我々 は以前にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞9,10coagonist を介した活性化促進を廃止 CD8 バインディング40 coagonist pMHC の突然変異に排除 TCR 廃止に対し共同作動薬 pMHC との相互作用には、coagonist を介した活性化強化10の影響はなかった。ただし、シングル チェーン MHC 構造の使用には、いくつか制限があります。たとえば、時間だし、複数プラスミドで異なるペプチドとその後 transfections 細胞選別と sc MHC の世代にこの実験のシステムを使用して複数の共同アゴニスト ペプチドをテストするのには手間のかかるシーケンスします。以前、マウス T 細胞活性化8,9, 複数共同アゴニスト ペプチドをテストにマウス タップ欠損細胞株 RMA-s を使用したが、このアプローチはタップ欠乏人間 T2 細胞ラインと10、最も可能性の高い成功しませんでした。タップに依存しないペプチド41に表現。実験体制のもう一つの制限は、T 細胞の活性化をトリガーするために必要な共同作動薬 pMHC の臨界量を決定する目的のため共同アゴニスト pMHC 分子の量を変更するための高速化手法を行いません。また、使用されるテトラサイクリン誘導システムでは許可されませんアゴニストの滴定単一セルのレベルで pMHC 数量テトラサイクリン濃度を変更するさまざまなテトラサイクリン濃度 HLA A2 陽性細胞の割合を変えるとなくセルごとごとに HLA A2 レベル。現在行っている別のアプローチ脂質二重膜42、以前マウス cd 4 + T 細胞活性化4中 co 作動を調査する使用を使用することですまたは提示定額でアゴニスト pMHC ビーズ、共同作動薬 pMHC のさまざまな量の存在。これらの代替実験系の共同作動薬 pMHC の量が異なると同様に、複数の共同アゴニスト ペプチド配列の高速テストように紫外線分解ペプチド技術4,43と組み合わせて使用すると、.
Sc MHC 技術は、単一のチェーン MHC クラス II 分子を提示済みペプチドは、哺乳類の細胞表面44に正常に表現されているように人間またはマウスの CD4 T 細胞の co されるの調査に適用もなることができます。また、sc MHC 技術の使用は HLA 大腸菌などの非古典的 MHC の分子の調査に拡張できます。Sc HLA-E は、前に記載されている、その表現45人間の T 細胞の活性化を阻害することが示されています。興味の別の非古典的 MHC 分子は CD1 ペプチド46の代わりに脂質を提示です。細胞表面に発現することと関連する脂質配位子47をバインドする CD1 重鎖と β 2-ミクログロブリンから成る Sc 構造が示されています。シングル チェーン MHC 技術 T および NK 細胞の活性化に分子間相互作用を調査するための調査ツールとして大きな可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、シンガポール保健省の下にそのデザイナーデュオに R571-002-012-592, 国立研究財団 Investigatorship R571-000-272-281 デザイナーデュオに作成によって N.R.J.G. にその CBRG/0064/2014 年の下で国の医学研究評議会によって支えられました。。、、a. b. へのシンガポールのトランスレーショナル ・ リサーチ (星) 奨励賞 (ナノ材研/スター/013/2012)専門家細胞選別の NUS 免疫プログラム フロー中核施設から博士ポール ハッチンソンと氏テオ郭ヒュイに感謝しております。原稿の批判的読解のエリヤ陳に感謝しております。
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |