Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.
Complejos de MHC (pMHC) péptido del uno mismo no estimulantes no inducen las funciones de activación y efectora de la célula de T, pero pueden mejorar las respuestas de la célula de T a agonista pMHC, mediante un proceso denominado co-agonismo. Este protocolo describe un experimental sistema investigar co-agonismo durante la activación de células T CD8 + humana expresando MHC humano clase I moléculas que presentan péptidos determinados como solo polipéptidos (única cadena MHC) en una línea celular xenogeneicos. Expresamos sola cadena MHCs bajo condiciones donde se expresan bajos niveles de complejos de MHC p sola cadena agonista y altos niveles de complejos de cadena simple no estimulante p-MHC. Uso de este sistema experimental nos permitió comparar CD8 + células de T respuestas a pMHC agonista en presencia o ausencia de pMHC no estimulante. El protocolo describe la transfección de la célula línea con sola cadena MHC construcciones, líneas de generación de células estables, cultivo de células humanas de T de CD8 + hepatitis B virus-específica y activación de células T experimentos simultáneamente cuantificación producción de citoquinas y degranulación. Los métodos presentados se pueden utilizar para la investigación sobre diferentes aspectos de la activación de células T CD8 + en sistemas de células de T humanas con especificidad conocida péptido MHC.
MHC de clase I (MHC-I) moléculas presentan péptidos cortos (8-10 aminoácidos) derivados de proteínas sintetizadas por cada célula. MHC-I las moléculas en las células sanas presentan autas péptidos derivados de proteínas endógenas. Infección viral conduce a la presentación de péptidos derivados de virus no-yo en MHC-I, pero las células infectadas aún presente no péptidos en presencia de grandes cantidades de péptido-MHC propio (pMHC). MHC-es reconocido por el receptor de célula T (TCR) y el correceptor CD8 de las células T. Afinidad de unión del TCR al péptido pMHC es altamente dependiente de la secuencia de péptidos presentados, considerando vinculante CD8 es independiente del péptido. Unión del TCR a pMHC mismo agonista complejo conduce a funciones de activación y efectora de la célula de T. No estimulante pMHC auto complejos no inducen las funciones de activación y efectora de la célula de T, pero pueden mejorar las respuestas de la célula de T a pMHC agonista, a través de un proceso denominado co-agonismo1,2,3. Agonismo de co se ha observado en ratones células de T de CD4 +4,5,6 , así como en ratón y humanos T CD8 + las células7,8,9,10, 11 , 12 , 13. bajo condiciones fisiológicas, las células T necesitan reconocer cantidades limitadas de agonista pMHC encendido antígeno que presenta las células (APCs) Co que presenta altos niveles de no estimulantes pMHC complejos, sugiriendo que co-agonismo contribuye a la óptima T respuestas de la célula in vivo. Celular total superficie MHC de clase los niveles son con frecuencia o durante infecciones virales14 y15de tumores. Esta estrategia de evasión inmune disminuye la presentación de pMHC agonista, pero también reduce la cantidad de agonista Co pMHC me disponibles para la mejora de la activación de células T. Por otra parte, los niveles de expresión superficial alta célula del MHC clase I molécula HLA-C ha demostrado correlacionar con mayor VIH control16, sugiriendo un papel crítico para el total de la clase MHC y expresión en la activación de células T. A pesar de la importancia fisiológica de co-agonismo, su mecanismo molecular aún incompleto se entiende. Esto es en gran parte debido a dificultades técnicas de controlar experimentalmente la cantidad de agonista co presentado pMHC manteniendo agonista pMHC constante.
Desarrollamos un experimental sistema investigar co-agonismo durante la activación de células T CD8 + humana expresando MHC humano clase I moléculas que presenta determinado péptido como polipeptídica única (única cadena MHC-I, figura 1A) en una celda xenogeneicos línea9,10. Cadena simple (sc) agonista pMHC se expresó bajo el control del promotor inducible por tetraciclina en la línea de celular de T-REx CHO derivado de hámster expresando represora tetraciclina; Esto permite muy baja expresión “agujereado” de sc agonista pMHC en la ausencia de tetraciclina y alta sc agonista pMHC expresión después de la adición de la tetraciclina (figura 1BC). Las células de T-REx CHO pMHC expresando agonista de sc fueron entonces supertransfected con no estimulantes agonistas Co sc pMHC-I bajo el control de un promotor constitutivo activo (figura 1BC). Uso de este sistema experimental nos permitió comparar CD8 + células de T respuestas a pMHC agonista en presencia o ausencia de niveles elevados de pMHC no estimulante. Críticamente, desde péptidos y MHC-I cadena pesada son covalente en la scMHC-formatear, esto permite la introducción de mutaciones en las moléculas de MHC que presentan péptidos determinados. Uso de scMHC-I tecnología así nos permitió modular específicamente propiedades TCR o CD8-Unión de agonista o agonista Co pMHC.
Co-agonismo en la activación de células T CD8 + se ha observado con MHC purificado-I complejos que presenta agonistas y agonistas Co péptidos en forma de heterodímeros11,17 o cuántica presentado en los puntos12,13. Primeros trabajos en co-agonismo en la activación de células T CD8 + en el contexto de reconocimiento de agonista pMHC en APC utilizan líneas de células deficientes en TAP2 como CPA. GRIFO se requiere para el transporte de péptidos del citoplasma el retículo endoplasmático, y deficiencia de TAP reduce severamente la piscina de los péptidos de-enlace de clase de MHC disponibles. En la ausencia de péptidos, el naciente complejo de MHC clase I cadena pesada y β2– microglobulina es inestable, resultando en MHC muy bajo-la expresión superficial de la célula. Inicialmente, comparación de las células T estimuladas con antígeno cargado TAP-suficiente – ratón deficiente RMA y líneas celulares de RMA-S, respectivamente, como APC, no reveló ninguna evidencia para co-agonismo en ratón de la activación de la célula de T18. Sin embargo, uso de este sistema experimental no permitían un control preciso sobre la cantidad de agonista pMHC presentado independientemente no estimulante pMHC del uno mismo. Por otra parte, estas dos variedades de células también pueden diferir en la expresión de otras moléculas que modulan la activación de células T, como ligandos a los receptores de la célula de T coestimuladoras o inhibitorios, o moléculas de adhesión.
Posteriormente, hemos desarrollado un protocolo para la carga de las células deficientes en TAP2 RMA-S con péptidos exógenos para permitir la presentación de una cantidad fija de agonista pMHC en la presencia o ausencia de pMHC no estimulante. Esto se logró a través de los siguientes: incubación de TAP2-deficiente RMA-S células a temperaturas más bajas (28 ° C, en lugar de los habituales 37 º C) para estabilizar el vacío MHC clase I cadena pesada/β2 microglobulina complejos19; incubación a 28 ° C con el péptido del agonista exógeno; incubación a 28 ° C en la presencia o ausencia de péptido no estimulantes exógeno; y la incubación a 37 ° C para reducir la expresión superficial de la célula de vacío MHC clase I complejos8,9. Uso de este montaje experimental reveló que la presencia de pMHC no estimulante mayor activación de timocitos de ratón, las células T CD8 + periféricas ingenuo y CTLs8. Mecánico, la presencia de pMHC no estimulantes puede inducir reclutamiento CD8 a la sinapsis inmune de la célula: APC T incluso en ausencia de agonistas pMHC, y pMHC no estimulantes puede mejorar la interacción del TCR con CD8 coreceptor7,8. Sin embargo, este sistema experimental no permite pruebas las contribuciones relativas de TCR y CD8 Unión de correceptores a pMHC agonistas y agonistas Co en la mediación de la mejora de la activación, como modificaciones alterando la Unión TCR o CD8 MHC de clase que me afecta a todas las moléculas de MHC, independientemente el péptido presentado. Por lo tanto utilizamos la clase de MHC sola tecnología de la cadena para superar este problema.
La clase de MHC de cadena única (sc) que formato se ha utilizado antes para mejorar presentación antigénica pMHC para estrategias terapéuticas y para responder preguntas fundamentales sobre los mecanismos de TCR y NK la activación del receptor de la célula y función20,21 . scMHC-consiste en péptidos, β2– microglobulina y MHC-I cadenas pesadas Unidas por dos enlazadores de serina/glicina-ricos flexibles (figura 1A), varias secuencias de vinculador diferentes han sido desarrollados y probados22. scMHC-puedo doblar independientemente de la llave de la complejo y acompañen las proteínas necesarias para pMHC convencional complejo Asamblea20. scMHC-me ha mostrado para doblar correctamente, como determinó la conformación-anticuerpo específico de tinción22 y resolviendo la estructura sc con Cristalografía de rayos x23. El scMHC básico-ha modificado el diseño para mejorar la Unión de baja afinidad péptidos24,25.
Este protocolo describe el uso de scMHC humano-I investigar co-agonismo en CTL humano clon de activación. El protocolo ha sido optimizado para clon humano CTL específico para un epitopo del virus de la Hepatitis B (VHB). HBV es un severo problema de salud en todo el mundo, ya que hay 350 millones las personas infectadas con HBV y la infección crónica de HBV pueden conducir al desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). Células HCC resultando de la infección de HBV pueden presentar generalmente epítopos derivados de VHB y pueden ser reconocidas por las células de T humanas específicas. Remoción de HBV y el HCC se basa en la respuestas de células T humanas26, pero HCC pacientes a menudo sufren de agotamiento de la célula de T y la célula de T reducido respuestas27. Introducción de HBV específico TCR en las células de T del VHB ha sido probado como una estrategia potencial de inmunoterapia para eliminar de la infección de HBV crónica28. Sin embargo, se desconoce si este método será efectivo en un ajuste clínico, debido a los bajos niveles de superficie MHC-I en hepatocitos humanos29. Por lo tanto, comprender el mecanismo de coagonism puede proporcionar perspectivas alternativas para inmunoterapia de HBV, posiblemente mejorando la presentación de pMHC endógeno para inducir las respuestas de células T mediada por agonismo co. El protocolo abarca todas las medidas necesarias para la investigación en humano co-agonismo: transfección de las células de T-REx CHO con agonistas y agonistas Co sc pMHC, generación de líneas de celulares de T-REx CHO estables, cultura de HBV-específico humano CTL CD8 + T células y activación CTL experimentos de cuantificación de la producción de citoquinas y degranulación en respuesta a células T-REx CHO. Aunque nos centramos en el uso del MHC sc tecnología investigar co-agonismo durante la activación de células T HBV de clase I, debe ser observado que los métodos presentados fácilmente pueden ser adaptados para la investigación sobre otros aspectos de la activación de células T en sistemas de células de T humanas con pMHC conocido-me especificidad.
Este protocolo utiliza un humano CD8 + CTL línea específico para el péptido derivado de HBV E183-91 (FLLTRILTI: “E183”)30 presentada en HLA-A2. las moléculas HLA SC que consta de una secuencia señal de humano β2-microglobulina, un péptido de unión de HLA-A2 de interés, un enlazador de glicina/serina, un humano β2-microglobulina, un enlazador de glicina/serina y una A2 cadena pesada puede ser comercialmente sintetizado (figura 1A ). Los plásmidos codificación scA2 construcciones con agonista E183 péptido, o péptidos de31 coagonist VIH GAG (SLYNTVATL) son de los autores a petición. La secuencia del péptido puede cambiarse mediante mutagénesis dirigida de sitio. Un vector inducible por tetraciclina pcDNA5/a se utiliza para expresar la cadena único agonista HLA-A2 con E183 péptido (sc E183-HLA-A2). En presencia del represor de la tetraciclina, la pcDNA5/a plásmido permite sólo muy baja, “leaky” expresión de la proteína de interés; alta expresión puede ser inducida por la adición de la tetraciclina (figura 1BC). Uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina permite control sobre la cantidad de células superficiales agonista pMHC expresión. Una expresión constitutiva plásmido pcDNA3.1 se utiliza para expresar coagonist scA2 con péptido de mordaza (GAG-HLA-A2 de la sc). La expresión regulada de tetraciclina línea de células CHO (T-REx) (línea de células de hámster, no MHC humano endógeno) fue utilizada para expresar construcciones sc-HLA-A2 agonistas y conjunta agonista. Este sistema experimental permite un control preciso sobre pMHC presentación (figura 1): no presentación pMHC (untransfected T-REx), una alta cantidad de presentación de pMHC Co agonista (sc constitutiva expresión de HLA-A2-GAG), una baja cantidad de agonista pMHC presentación (sc E183-HLA-A2 en la ausencia de la tetraciclina), una alta cantidad de presentación pMHC de agonista (sc E183-HLA-A2 en presencia de tetraciclina), una baja cantidad de agonista pMHC presentación y alta expresión de agonista Co pMHC (sc E183-HLA-A2 en el ausencia de tetraciclina y sc constitutiva expresión de HLA-A2-GAG). Uso de este sistema experimental permite un control preciso de cantidades superficie celular de agonista y pMHC coagonist.
El protocolo presentado constituye una herramienta sólida para la investigación de las interacciones moleculares durante la activación de células T CD8 + humana. Un paso crítico para la investigación del co-agonismo durante la activación de células T humanas es control agonista pMHC superficial la expresión célula para asegurar a igual agonista pMHC presentación sobre los vehículos blindados con o sin expresión de pMHC Co agonista. En nuestro sistema experimental, esto se logra utilizando un clon de célula expresan cantidades bajas de agonista pMHC, seguido de supertransfection con un agonista Co pMHC construir y agonista pMHC cuantificación usando anticuerpos TCR-como10, 32. como expresión de agonista sc pMHC cambian con el tiempo, es fundamental para cuantificar la expresión superficial de agonista pMHC en APC utilizado en cada experimento utilizando anticuerpos de TCR-como. Si no está disponible, ningún anticuerpo específico TCR-como agonista scMHC-puedo expresar como fusión de la proteína fluorescente, y su expresión superficial de la célula se puede entonces cuantificar mediante un método de microscopia sensibles, tales como microscopía de fluorescencia de reflexión interna total 35 , 36. por otra parte, expresión superficial de la célula de agonista Co pMHC disminuye con el tiempo, debido a la metilación dependiente – independiente y silenciamiento del promotor CMV37y deben ser supervisada con anticuerpo de tinción y flujo cytometry análisis, repetidas FACS-clasificación cuando sea necesario. Hemos cultivado células CHO durante 5 semanas con pérdida relativamente limitada de sc pMHC expresión. Se recomienda congelar las células CHO pronto después de su selección/clasificación para asegurar un stock confiable de células con expresión de MHC conocido sc.
Los varios pasos de los protocolos presentados pueden ser modificados, dependiendo de la disponibilidad de equipos, o dependiendo de los objetivos específicos de investigación. Por ejemplo, PBMC proliferación potenciales puede ser inhibido (paso 3.2.1) usando métodos alternativos que no requieran de una gamma (o x) Irradiador, tales como el tratamiento con mitomicina C38. Un buffers de disociación no enzimática de la célula que contienen quelantes de metal39 pueden utilizarse en lugar de raspar en paso 3.3.1 de la célula. Por otra parte, el antígeno que presenta el sistema puede ser modificado para hacerlo más conveniente para los clones humanos CTL expresando diferentes TCRs. CHO células hámster expresa MHC clase I moléculas, y aunque estas son irrelevantes para la línea CTL estudiada aquí (figura 2A y Figura 3A, observaron no hay respuestas de células T células CHO untransfected), existe la posibilidad que otros TCRs humanas pueden mostrar algunos xenoreactivity. En que caso, hámster MHC clase I expresión puede reducirse al noquear a hámster β2-microglubulin o toque usando CRISPR/Cas9; o una línea APC humana puede utilizarse después de noquear CRISPR/Cas9-mediada β2-microglubulin o grifo.
El sistema experimental presentado aquí permite el control preciso de interacciones CD8 TCR con las moléculas de MHC que presentan péptidos previamente definidos. Por ejemplo, nos hemos demostrado previamente que mutaciones supresión CD8 enlace40 a pMHC coagonist eliminaron mejorar la activación mediada por el coagonist en murinos y humanos T CD8 + células9,10, mientras que abroga TCR interacción con Co agonista pMHC no tuvo efecto en la activación mediada por coagonist mejora10. Sin embargo, el uso de construcciones sola cadena MHC tiene varias limitaciones. Por ejemplo, es tiempo y consumo de mano de obra para probar múltiples péptidos Co agonista secuencias utilizando este sistema experimental, como se trata de generación de múltiples plásmidos codifican sc MHC péptidos diferentes y posterior transfecciones y clasificación celular. Anteriormente, hemos utilizado la línea de celular TAP-deficiencia murine RMA-S para probar múltiples péptidos Co agonista en ratón de8,de activación de la célula de T9, pero este acercamiento no tuvo éxito con el grifo-deficiencia humana T2 celular línea10, probablemente debido a la presentación de péptidos de grifo independiente41. Otra limitación de nuestro sistema experimental es que no proporciona un método rápido para alterar la cantidad de agonista Co pMHC moléculas con el fin de determinar la cantidad crítica de agonista Co pMHC necesaria para desencadenar la activación de la célula de T. Por otra parte, el sistema inducible por tetraciclina no permite valoración de agonista pMHC cantidad a nivel unicelular cambiando la concentración de la tetraciclina, como diferentes concentración de tetraciclina altera la proporción de células positivas de HLA-A2, en lugar de los niveles de HLA-A2 en base al celular. Un enfoque alternativo que estamos investigando actualmente es usar lipídicas bicapas42, utilizado anteriormente para investigar co-agonismo murino CD4 + T células activación4 o granos cantidad fija actual de pMHC agonista en la presencia de cantidades variables de co agonista pMHC. Cuando se utiliza junto con UV escindibles péptido tecnología4,43, estos sistemas experimentales alternativos deben permitir la prueba rápida de múltiples secuencias de péptidos de agonista Co así como diferentes cantidades de co agonista pMHC .
La tecnología de MHC sc puede ser también aplicable a la investigación de la co-agonismo en células T CD4 humanas o murinas, según sola cadena MHC clase II las moléculas que presentan los péptidos se han expresado con éxito en células de mamífero superficies44. Por otra parte, el uso de la tecnología de sc MHC puede ampliarse a la investigación de las moléculas de MHC no clásicas como HLA-E. SC HLA-E se ha descrito antes, y su expresión se ha demostrado para inhibir la activación de células T humanas45. Otra molécula de MHC no clásicas de interés es el CD1, que presenta lípidos en lugar de péptidos46. SC construcciones de cadena pesada CD1 y β2-microglobulina han demostrado ser expresado en la superficie celular y enlazar lípidos correspondientes ligandos47. Cadena única tecnología MHC tiene un gran potencial como herramienta de investigación para investigar las interacciones moleculares durante la activación de células T y NK.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por el Consejo de Ministerio de salud Singapur Nacional de investigación médica bajo su CBRG/0064/2014 a N.R.J.G., por crear bajo su R571-002-012-592 a p.a.m., Investigatorship de la Fundación de investigación nacional R571-000-272-281 de P.A.M. . y por un premio de investigador de investigación traslacional (estrella) Singapur (NMRC/estrella/013/2012) a A.B. Agradecemos al Dr. Paul Hutchinson y el Sr. Teo Guo Hui de instalaciones centrales de flujo de programa NUS Inmunología para la selección de expertos de la célula. Agradecemos a Elijah Chen lectura crítica del manuscrito.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |