Denne protokollen beskriver bruken av enkelt MHC klasse I komplekser undersøke molekylære interaksjoner i human CD8 + T celle aktivering: generasjon utviklet antigen presentere celler uttrykke enkelt kjede konstruerer, kultur for menneskelig CD8 + T celle klone og T celle aktivering eksperimenter.
Non-stimulerende selv peptid MHC (pMHC) komplekser Fremkall ikke T celle aktivering og effektor funksjoner, men kan forbedre T celle Svar å Agonistiske pMHC, gjennom en prosess kalt co-agonism. Denne protokollen beskriver en eksperimentell systemet å undersøke co-agonism under menneskelige CD8 + T celle aktivering ved å uttrykke menneskelige MHC klasse I molekyler presentere forhåndsbestemt peptider som enkelt polypeptides (enkelt kjede MHC) i en xenogeneic celle linje. Vi uttrykte enkelt kjede MHCs under forhold der lave nivåer av Agonistiske enkelt kjede p-MHC komplekser og høye nivåer av ikke-stimulerende enkelt kjede p-MHC komplekser ble uttrykt. Bruk av dette eksperimentelle systemet tillot oss å sammenligne CD8 + T celle Svar å Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av ikke-stimulerende pMHC. Protokollen beskriver cellen linje transfection med enkelt kjede MHC konstruerer, generering av stabil linjer, kultur av hepatitt B virus-spesifikke menneskelig CD8 + T-celler og T celle aktivering eksperimenter samtidig kvantifisere cytokiner produksjonen og omfatter degranulering. Presentert metodene kan brukes for forskning på ulike aspekter av CD8 + T celle aktivering i human T celle systemer med kjente peptid MHC spesifisitet.
MHC klasse I (MHC-jeg) molekyler presentere kort (8-10 aminosyrer) peptider fra proteiner syntetisert av hver celle. MHC-jeg molekyler på friske celler presentere selv peptider fra endogene proteiner. Viral infeksjon fører til presentasjon av ikke-selv virus-avledet peptider på MHC-jeg, men selv infiserte celler finnes ikke-selv peptider i nærvær av store mengder selv peptid-MHC (pMHC). MHC-jeg er anerkjent av den T-celle reseptoren (TCR) og CD8 co reseptoren på T-celler. TCR forpliktende tilhørighet til peptid pMHC er svært avhengig av en rekke presentert peptider, mens CD8 binding er peptid-uavhengig. TCR binding til ikke-selv Agonistiske pMHC komplekse fører til T celle aktivering og effektor funksjoner. Non-stimulerende selv pMHC komplekser Fremkall ikke T celle aktivering og effektor funksjoner, men kan forbedre T celle Svar å Agonistiske pMHC, gjennom en prosess kalt co-agonism1,2,3. Co-agonism har blitt observert i musen CD4 + T celler4,5,6 samt mus og menneskelige CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiske forhold T celler må anerkjenne begrensede mengder av Agonistiske pMHC på antigen presentere celler (APCs) co-presentere høye nivåer av ikke-stimulerende pMHC komplekser, antyder at co-agonism bidrar til optimal T cellen svar i vivo. Total-celle overflaten MHC, klasse jeg nivåer er ofte downregulated under virusinfeksjoner14 og svulster15. Denne immun evasion strategien reduserer Agonistiske pMHC presentasjon, men også reduserer mengden co Agonistiske pMHC jeg tilgjengelig for T celle aktivering ekstrautstyr. Videre klasse høyt overflaten uttrykk nivåer av MHC I molekylet HLA-C har vist seg å korrelere med forbedret HIV kontroll16, antyder en avgjørende rolle for totalt MHC, klasse jeg uttrykk i T celle aktivering. Til tross for fysiologiske betydningen av co-agonism, er dens molekylær mekanikk fortsatt ufullstendig forstått. Dette skyldes i stor grad tekniske utfordringer eksperimentelt kontrollere mengden presentert co Agonistiske pMHC samtidig Agonistiske pMHC konstant.
Vi utviklet en eksperimentell systemet å undersøke co-agonism under menneskelige CD8 + T celle aktivering ved å uttrykke menneskelige MHC klasse I molekyler presentere forhåndsbestemt peptid som enkelt polypeptid (enkelt kjede MHC-I, figur 1A) i en xenogeneic celle linje9,10. Enkelt kjede (sc) Agonistiske pMHC ble uttrykt under kontroll av tetracycline-induserbart arrangøren i hamster-avledet T-REx CHO cellen linje uttrykke tetracycline repressor; Dette gir svært lav “lekk” uttrykk for sc Agonistiske pMHC i fravær av tetracycline og høy sc Agonistiske pMHC uttrykk etter tillegg av tetracycline (figur 1BC). Sc Agonistiske pMHC-uttrykke T-REx CHO cellene var da supertransfected med ikke-stimulerende, co Agonistiske sc pMHC-jeg under kontroll av en constitutively aktive promoter (figur 1BC). Bruk av dette eksperimentelle systemet tillot oss å sammenligne CD8 + T celle Svar å Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av høye nivåer av ikke-stimulerende pMHC. Kritisk, siden peptid og MHC-jeg tunge kjeden er covalently koblet i scMHC-jeg format, lar dette introduksjoner av mutasjoner i MHC molekyler presentere forhåndsbestemt peptider. Bruk av scMHC-jeg teknologien dermed tillatt oss å modulere spesielt TCR eller CD8 bindende egenskaper Agonistiske eller co Agonistiske pMHC.
Co-agonism i CD8 + T celle aktivering er observert med renset MHC-jeg komplekser presentere Agonistiske og co Agonistiske peptider i form av heterodimerer11,17 eller presenteres på kvante prikker12,13. Tidlige arbeider på co-agonism i CD8 + T celle aktivering i sammenheng Agonistiske pMHC anerkjennelse på APC brukt TAP2 dårlig linjer som APCs. Trykk kreves for peptid transport fra cytoplasma til det endoplasmatiske retikulum, og trykk-mangel reduserer sterkt utvalget av tilgjengelige MHC klasse-bindende peptider. I fravær av peptider, begynnende komplekset av MHC klasse I tung kjetting og β2– microglobulin er ustabil, noe som resulterer i svært lav MHC-jeg celle overflaten uttrykk. I utgangspunktet avsløre sammenligning av T-celler stimulert med antigen lastet på trykk-nok – mangelfull mus RMA og RMA-S cellelinjer, som APCs, ikke noen bevis for co-agonism under musen T celle aktivering18. Men tillater bruk av dette eksperimentelle systemet ikke presis kontroll over mengden av Agonistiske pMHC presenterte uavhengig av ikke-stimulerende selv pMHC. Videre kan disse to linjer også variere i uttrykk for andre molekyler som modulerer T celle aktivering, som ligander til T celle co-stimulatory eller hemmende reseptorer eller vedheft molekyler.
Deretter utviklet vi en protokoll for lasting TAP2 dårlig RMA-S celler med eksogene peptider tillate presentasjon av en fast mengde Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av ikke-stimulerende pMHC. Dette ble oppnådd gjennom følgende: inkubasjonstiden for TAP2-mangelfull RMA-S celler ved lavere temperaturer (28 ° C i stedet for den vanlige 37 ° C) for å stabilisere tom MHC klasse I tunge kjede/β2 microglobulin komplekser19; inkubasjon på 28 ° C med eksogene Agonistiske peptid; inkubasjon på 28 ° C i tilstedeværelse eller fravær av eksogene ikke-stimulerende peptid; og inkubasjon på 37 ° C å redusere cellen overflaten uttrykk for tom MHC klasse I komplekser8,9. Bruk av denne eksperimentelle set-up avslørte at tilstedeværelsen av ikke-stimulerende pMHC forbedret aktivering av musen thymocytes, naiv perifere CD8 + T celler og CTLer8. Mechanistically, tilstedeværelse av ikke-stimulerende pMHC kan indusere CD8 rekruttering T celle: APC immun synapse selv i fravær av Agonistiske pMHC, og ikke-stimulerende pMHC kan forbedre TCR interaksjon med CD8 coreceptor7,8. Men tillater dette eksperimentelle systemet ikke teste den relative bidrag av TCR og CD8 coreceptor binding til Agonistiske og co Agonistiske pMHC i formidling aktivisering ekstrautstyr, som endringer endre TCR eller CD8 binding til MHC, klasse jeg ville påvirke alle MHC molekyler, uansett presentert peptid. Vi brukte derfor MHC, klasse jeg single chain teknologi for å løse dette problemet.
Enkelt kjede (sc) MHC klassen jeg format har vært brukt før å forbedre antigen pMHC presentasjon for strategier, og å svare på grunnleggende spørsmål om mekanismer av TCR og NK celle reseptor aktivering og fungerer20,21 . scMHC-jeg består av peptid, β2– microglobulin og MHC-jeg tunge kjeden av to fleksible serine/glycine-rik linkers (figur 1A), flere forskjellige koblingsfunksjonalitet sekvenser har vært utviklet og testet22. scMHC-jeg kan kaste uavhengig av KRANEN komplekse og Anstandsdame proteiner kreves for konvensjonelle pMHC komplekse samlingen20. scMHC-jeg har blitt vist å kaste riktig, som bruker konformasjon-spesifikke antistoffer flekker22 og løse sc struktur med Røntgenkrystallografi23. Den grunnleggende scMHC-jeg design er endret for å forbedre binding av lav affinitet peptider24,25.
Denne protokollen beskriver bruken av menneskelig scMHC-jeg undersøke co-agonism under menneskelige CTL klone aktivisering. Protokollen er optimalisert for menneskelig CTL klone spesifikke for en epitope av hepatitt B-viruset (HBV). HBV er en alvorlig helse lasten over hele verden, som det er 350 millioner mennesker smittet med HBV og kronisk HBV-infeksjon kan føre til utvikling av leverkreft (HCC). HCC celler som følge av HBV-infeksjon kan vanligvis presentere HBV-avledet epitoper og kan bli gjenkjent av spesifikke menneskelig T-celler. HBV og HCC klaring avhengig den menneskelige T celle svar26, men HCC pasienter lider ofte av T celle utmattelse og redusert T celle svar27. Innføring av HBV-spesifikke TCR i T-celler av HBV har vært prøvd som potensielle immunterapi strategi å eliminere kronisk HBV-infeksjon28. Men det er ukjent om denne metoden vil være effektiv i en klinisk setting, på grunn av de lave nivåene av overflaten MHC-I menneskelig hepatocytter29. Derfor kan forstå mekanismen av coagonism gi alternative perspektiver for immunterapi av HBV, muligens ved å forbedre presentasjonen av endogene pMHC å indusere co-agonism-mediert T celle svar. Protokollen dekker alle de nødvendige skritt for forskning på menneskelige co-agonism: hva T-REx CHO celler Agonistiske og co Agonistiske sc pMHC, generasjon av stabil T-REx CHO linjer, HBV-spesifikke menneskelig CTL CD8 + T celle linje og CTL aktivisering eksperimenter kvantifisere cytokin produksjon og omfatter degranulering svar på T-REx CHO celler. Selv om vi fokusere på å bruke sc MHC klasse I teknologien å undersøke co-agonism under HBV T celle aktivering, det må bemerkes at metodene presentert kan lett tilpasses for forskning på andre aspekter av T celle aktivering i human T celle systemer med kjente pMHC-jeg spesifisitet.
Denne protokollen bruker en menneskelig CD8 + CTL linje bestemt HBV-avledet peptid E183-91 (FLLTRILTI: “E183”)30 presentert på HLA-A2. SC HLA molekyler som består av et signal fra menneskelige β2-microglobulin, en HLA-A2 bindende peptid av interesse, en glysin/serine linker, en menneskelig β2-microglobulin, et glysin/serine linker og en A2 tunge kjede kan være kommersielt syntetisert (figur 1A ). Plasmider koding scA2 konstruksjoner med Agonistiske E183 peptid eller coagonist HIV KNEBLE (SLYNTVATL)31 peptider er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. Peptid rekkefølgen kan endres med nettstedet regissert-mutagenese. En tetracycline-induserbart vektor ble pcDNA5/til brukt til å uttrykke Agonistiske enkelt kjeden HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I nærvær av tetracycline repressor, pcDNA5/plasmider tillater bare svært lav, “lekk” uttrykk av proteinet steder. høy uttrykk kan være forårsaket av tillegg av tetracycline (figur 1BC). Bruk av et tetracycline-induserbart uttrykk system gir kontroll over mengden av cellen overflaten Agonistiske pMHC uttrykk. En grunnleggende uttrykk plasmider pcDNA3.1 ble brukt til å uttrykke coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracycline regulert uttrykket (T-REx) CHO celle (linje hamster cellen, ingen endogene menneskelige MHC) ble brukt til å uttrykke Agonistiske og co Agonistiske sc-HLA-A2 konstruksjoner. Eksperimentell systemet gir presis kontroll over pMHC presentasjon (figur 1 c): ingen pMHC presentasjon (untransfected T-REx), en stor mengde co Agonistiske pMHC presentasjon (konstituerende sc GAG-HLA-A2 uttrykk), lite Agonistiske pMHC presentasjon (sc E183-HLA-A2 i fravær av tetracycline), en stor mengde Agonistiske pMHC presentasjon (sc E183-HLA-A2 i nærvær av tetracycline), lite Agonistiske pMHC presentasjon og høy uttrykk for co Agonistiske pMHC (sc E183-HLA-A2 i den fravær av tetracycline, og konstituerende sc GAG-HLA-A2 uttrykk). Bruk av dette eksperimentelle systemet tillater presis styring av celle overflaten mengder Agonistiske og coagonist pMHC.
Presentert protokollen gir et kraftig verktøy for undersøkelse av molekylære interaksjoner i human CD8 + T celle aktivering. Et kritisk punkt for undersøkelse av co-agonism under menneskelige T celle aktivering er kontroll over Agonistiske pMHC celle overflaten uttrykk for å sikre lik Agonistiske pMHC presentasjon på APCs med eller uten co Agonistiske pMHC uttrykk. I eksperimentelle systemet, dette oppnås ved hjelp av en enkelt celle klone uttrykke lave mengder Agonistiske pMHC, etterfulgt av supertransfection med en co Agonistiske pMHC konstruksjon og Agonistiske pMHC kvantifisering bruker TCR-lignende antistoff10, 32. som agonist sc pMHC uttrykk kan endres over tid, er det avgjørende å kvantifisere Agonistiske pMHC overflaten uttrykk på APCs brukt i hvert eksperiment med TCR-lignende antistoffer. Hvis ingen spesifikke TCR-lignende antistoff tilgjengelig, Agonistiske scMHC-jeg kan uttrykkes som fluorescerende protein fusion, og cellen overflaten uttrykket kan deretter kvantifiseres bruke en følsom mikroskopi metode, for eksempel total intern refleksjon fluorescens mikroskopi 35 , 36. videre cellen overflaten uttrykk for co Agonistiske pMHC reduseres over tid på grunn av metylering-avhengige og -uavhengig stanse CMV promoter37, og bør følges med antistoff flekker og flyt cytometri analyse, gjentatte FACS-sortering ved behov. Vi har kultivert CHO celler 5 uker med relativt begrenset tap av sc pMHC uttrykk. Vi anbefaler frysing CHO cellene etter valg/sortering å sikre et pålitelig lager av celler kjent sc MHC-uttrykk.
Flere trinnene presentert protokollene kan endres, avhengig av tilgjengeligheten av utstyr, eller avhengig av den spesifikke forskning mål. For eksempel PBMC spredning potensielle kan bli hemmet (trinn 3.2.1) bruke alternative metoder som ikke krever en gamma (eller X-) irradiator, for eksempel behandling med mitomycin C38. En ikke-enzymatisk celle dissosiasjon buffere som inneholder metall chelater39 kan brukes i stedet for celle skraping i trinn 3.3.1. Videre antigen presentere systemet kan endres for å gjøre det mer egnet for menneskelig CTL kloner uttrykke forskjellige TCRs. CHO celler uttrykke hamster MHC klasse I molekyler, og selv om disse er irrelevant for Sertifikatklareringslisten linjen studert her (figur 2A og Figur 3A, vi observerte ingen T celle Svar å untransfected CHO celler), det er en mulighet at andre menneskelige TCRs kan vise noen xenoreactivity. I at saken, hamster MHC klasse I uttrykk kan reduseres av slå ut hamster β2-microglubulin eller trykk bruker CRISPR/Cas9; eller en menneskelig APC linje kan brukes etter CRISPR/Cas9-mediert β2-microglubulin eller trykk slå ut.
Eksperimentell systemet presenteres her tillater presis kontroll av TCR og CD8 interaksjoner med MHC molekyler presentere forhåndsdefinerte peptider. For eksempel har vi tidligere vist at mutasjoner avskaffe CD8 bindende40 til coagonist pMHC eliminert coagonist-mediert aktivisering ekstrautstyr i murine og menneskelig CD8 + T celler9,10, mens lertid TCR interaksjon med co Agonistiske pMHC hadde ingen effekt på coagonist-mediert aktivisering ekstrautstyr10. Bruk av enkelt kjede MHC konstruksjoner har imidlertid flere begrensninger. For eksempel er det tid og arbeid tidkrevende å teste flere co Agonistiske peptid sekvenser med dette eksperimentelle systemet, fordi dette innebærer generasjon av flere plasmider koding sc MHC med forskjellige peptider, og påfølgende transfections og celle sortering. Tidligere vi brukte murine trykk-mangelfull celle linjen RMA-S for å teste flere co Agonistiske peptider i musen T celle aktivering8,9, men dette var ikke vellykket med trykk-mangelfull menneskelige T2 cellen linje10, mest sannsynlig på grunn av presentasjonen av trykk-uavhengig peptider41. En annen begrensning av vår eksperimentelle systemet er ikke gir en rask metode for å endre mengden co Agonistiske pMHC molekyler for å bestemme kritisk mengden co Agonistiske pMHC for å utløse T celle aktivering. Videre tillater tetracycline-induserbart systemet brukes ikke Serine Agonistiske pMHC antallet på nivå én celle ved å endre tetracycline konsentrasjonen, som varierende tetracycline konsentrasjon endrer andelen HLA-A2 positiv celler, snarere enn HLA-A2 nivåer på per celle-basis. En alternativ tilnærming som vi er nå undersøke å bruke støttes lipid bilayers42, tidligere undersøke co-agonism under murine CD4 + T celle aktivering4 eller perler presenterer fast mengde Agonistiske pMHC i den tilstedeværelsen av varierende mengder co Agonistiske pMHC. Når den brukes sammen med UV-cleavable peptid teknologi4,43, bør disse alternative eksperimentelle systemer tillate rask testing av flere co Agonistiske peptid sekvenser i tillegg til ulike mengder av co Agonistiske pMHC .
Sc MHC teknologien kan være også gjelder for undersøkelse av co-agonism i menneskelige eller murine CD4 T celler, som enkelt kjede klasse II molekylene av MHC presentere forhåndsbestemt peptider har blitt vellykket uttrykt på pattedyr celle overflater44. Videre kan bruk av sc MHC teknologi utvides til undersøkelse av ikke-klassiske MHC molekyler som HLA-E. SC HLA-E har blitt beskrevet før, og dets uttrykk har vist seg å hemme human T celle aktivering45. En annen ikke-klassiske MHC molekyl av interesse er CD1, som presenterer lipider i stedet for peptider46. SC konstruksjoner CD1 tung kjetting og β2-microglobulin har vist seg å bli uttrykt på cellens overflate og binde relevante lipid ligander47. Enkelt kjede MHC teknologi har stort potensial som et forskningsverktøy for å undersøke molekylære interaksjoner i T og NK celle aktivering.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Singapore helsedepartementets National Medical Research Council under dets CBRG/0064/2014 til N.R.J.G., ved å opprette under sin R571-002-012-592 P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 til P.A.M ., og en Singapore translasjonsforskning (stjerne) etterforsker prisen (NMRC/STaR/013/2012) til AB Vi er takknemlige til Dr. Paul Hutchinson og Mr. Teo Guo Hui fra NUS immunologi program Flow Core anlegg for ekspert celle sorteringen. Vi er takknemlige for Elijah Chen for kritisk lesning av manuskriptet.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |