Det här protokollet beskriver användningen av enda kedja MHC klass I komplex att undersöka molekylära interaktioner i mänskliga CD8 + T cellaktivering: generation av bakåtkompilerade antigenpresenterande celler som uttrycker enda kedja konstruerar, kultur av mänskliga CD8 + T cell klon och T-cells aktivering experiment.
Icke-stimulerande själv peptid MHC (pMHC) komplex framkalla inte T cell aktivering och effektor funktioner, men kan förbättra T-cell svar på agonist pMHC, genom en process som kallas co-agonism. Det här protokollet beskriver en experimentell system att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 + T cellaktivering genom att uttrycka mänskliga MHC klass I molekyler presentera förutbestämda peptider som enda polypeptider (enda kedja MHC) i en xenogena cellinje. Vi uttryckte enda kedja MHCs under förhållanden där låga nivåer av agonist enda kedja p-MHC komplexen och höga halter av icke-stimulerande enda kedja p-MHC komplexen uttrycktes. Användning av detta experimentella system tillät oss att jämföra CD8 + T cell Svaren till agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av icke-stimulerande pMHC. Protokollet beskrivs cell linje transfection med enda kedja MHC konstruktioner, generation av stabil cell linjer, kultur av hepatit B virus-specifika mänskliga CD8 + T celler och T-cellsaktivering experiment samtidigt kvantifiera cytokin produktion och degranulering. De presenterade metoderna kan användas för forskning om olika aspekter av CD8 + T cellaktivering i mänsklig T cellsystem med kända peptid MHC specificitet.
MHC klass I (MHC-jag) molekyler presentera kort (8-10 aminosyror) peptider härrör från proteiner som syntetiseras av varje cell. MHC-jag molekyler på friska celler presentera själv peptider härrör från endogena proteiner. Virusinfektion som leder till presentation av icke-jaget virus-derived peptider på MHC-jag, men även infekterade celler närvarande icke-jaget peptider i närvaro av stora mängder själv peptid-MHC (pMHC). MHC-jag är erkänt av T-cell receptorn (TCR) och CD8 samtidig receptorn på T-celler. TCR affinitet till peptid pMHC är starkt beroende av sekvensen av presenterade peptider, medan CD8 bindande är peptid-oberoende. TCR bindning till icke-jaget agonist pMHC komplex leder till T cell aktivering och effektor funktioner. Icke-stimulerande själv pMHC-komplex framkalla inte T cell aktivering och effektor funktioner, men kan förbättra T-cell svar på agonist pMHC, genom en process som kallas co-agonism1,2,3. Co-agonism har observerats i mus CD4 + T celler4,5,6 samt mus och mänskliga CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiska betingelser, T-celler måste erkänna begränsade mängder agonist pMHC på antigenpresenterande celler (APC) Co presenterar höga halter av icke-stimulerande pMHC komplex, vilket tyder på att co-agonism bidrar till optimal T cell Svaren Invivo. Totala cell surface MHC klass jag nivåer är ofta nedreglerade vid virusinfektioner14 och på tumörer15. Denna immune evasion strategi minskar agonist pMHC presentation, men minskar också mängden co agonist pMHC jag tillgänglig för T-cells aktivering förbättring. Dessutom klass hög cell surface uttrycksnivåerna för MHC I molekylen HLA-C har visats korrelera med förbättrad HIV kontroll16, vilket tyder på en avgörande roll för totala MHC klass I uttryck i T-cellsaktivering. Trots den fysiologiska betydelsen av co-agonism, är dess molekylära mekanism fortfarande ofullständigt förstås. Detta beror till stor del på tekniska utmaningar av experimentellt styra mängden presenterade samtidig agonist pMHC samtidigt hålla agonist pMHC konstant.
Vi utvecklade en experimentell system att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 + T cellaktivering genom att uttrycka mänskliga MHC klass I molekyler presentera förutbestämda peptid som enda polypeptid (enda kedja MHC-I, figur 1A) i en xenogena cell linje9,10. Enda kedja (sc) agonist pMHC uttrycktes under kontroll av tetracyklin-inducerbara arrangören i den hamster-derived T-REx CHO cellinje uttrycker tetracyklin repressor; Detta tillåter mycket låg ”läckande” uttryck för sc agonist pMHC i avsaknad av tetracyklin och hög sc agonist pMHC uttryck efter tillägg av tetracyklin (figur 1BC). Sc-agonist pMHC-uttryckande T-REx CHO cellerna var sedan supertransfected med icke-stimulerande, samtidig agonist sc pMHC-jag under kontroll av en konstitutivt aktiv promotor (figur 1BC). Användning av detta experimentella system tillät oss att jämföra CD8 + T cell Svaren till agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av höga halter av icke-stimulerande pMHC. Kritiskt, sedan peptid och MHC-jag tung kedja är kovalent bundna i scMHC-jag format, detta tillåter introduktioner av mutationer i MHC molekyler presentera förutbestämda peptider. Användning av scMHC-jag teknik därmed tillät oss modulerar TCR eller CD8-bindande egenskaper av agonist eller samtidig agonist pMHC.
Co-agonism i CD8 + T cellaktivering har observerats med renat MHC-jag komplex presenterar agonist och samtidig agonist peptider i form av heterodimerer11,17 eller presenteras på quantum dots12,13. Tidiga arbete på co-agonism i CD8 + T cellaktivering inom ramen av agonist pMHC erkännande på APC används TAP2-brist cellinjer som trupptransportfordon. Tryck krävs peptid transport från cytoplasman till endoplasmatiska retiklet och TAP-brist minskar kraftigt poolen av tillgängliga MHC klass I-bindande peptider. I avsaknad av peptider, begynnande komplex av MHC klass I tung kedja och β2– mikroglobulin är instabil, vilket resulterar i mycket låg MHC-jag cell surface uttryck. Inledningsvis, visade jämförelse av T-celler stimuleras med antigen lastas på TAP-tillräcklig och – bristfällig mus RMA och RMA-S cellinjer, respektive, som trupptransportfordon, inte några bevis för co-agonism under musen T cell aktivering18. Användning av detta experimentella system tillät dock inte exakt kontroll över mängden agonist pMHC presenteras oberoende av icke-stimulerande self pMHC. Dessa två cellinjer kan dessutom också skilja sig i uttryck av andra molekyler som modulerar T-cellsaktivering, såsom ligander till T-cell co-stimulatory eller hämmande receptorer eller adhesionsmolekyler.
Därefter utvecklade vi ett protokoll för lastning TAP2-brist RMA-S celler med exogena peptider så att presentationen av en fast mängd agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av icke-stimulerande pMHC. Detta uppnåddes genom följande: inkubation av TAP2-brist RMA-S celler vid lägre temperaturer (28 ° C, i stället för den vanliga 37 ° C) för att stabilisera Tom MHC klass I tung kedja/β2 mikroglobulin komplex19; inkubation vid 28 ° C med exogena agonist peptid; inkubation vid 28 ° C i närvaro eller frånvaro av exogena icke-stimulerande peptid; och inkubation vid 37 ° C att minska cell surface uttryck för tomma MHC klass I komplex8,9. Användning av denna experimentella set-up visade att förekomsten av icke-stimulerande pMHC förbättrad aktivering av mus tymocyter, naiva perifera CD8 + T-celler och CTL8. Slentrianmässigt, förekomsten av icke-stimulerande pMHC kan inducera CD8 rekrytering till T cell: APC immun synapsen även i avsaknad av agonist pMHC, och icke-stimulerande pMHC kan förbättra TCR interaktion med CD8 coreceptor7,8. Detta experimentella system tillåter dock inte testa de relativa bidragen av TCR och CD8 coreceptor bindningen till agonist och samtidig agonist pMHC i medla aktiveringen förbättring, som alla ändringar som att ändra TCR eller CD8 bindning till MHC klass skulle jag påverka alla MHC molekyler, oavsett presenterade peptiden. Därför använde vi MHC klass jag enda kedja teknik för att lösa detta problem.
Den enda kedja (sc) MHC klass jag format har använts innan att förbättra antigena pMHC presentation för terapeutiska strategier, och att besvara grundläggande frågor om mekanismer av TCR och NK cell receptor aktiveringen och fungera20,21 . scMHC-jag består av peptid, β2– mikroglobulin och MHC-jag tung kedja sällskap av två flexibla serin/glycin-rika linkers (figur 1A), flera olika linker sekvenser har utvecklats och testats22. scMHC-jag kan vika oberoende av kranen komplexa och förkläde proteiner krävs för konventionella pMHC komplex sammansättning20. scMHC-jag har blivit visad att vika korrekt, som bestämts med konformation-specifika antikroppen färgning22 och lösa sc struktur med röntgenkristallografi23. Den grundläggande scMHC-jag design har ändrats för att förbättra bindningen av låg affinitet peptider24,25.
Det här protokollet beskriver användningen av mänskliga scMHC-jag att undersöka co-agonism under mänskliga CTL klona aktivering. Protokollet har optimerats för mänskliga CTL-klon som är specifika för en epitop av hepatit B virus (HBV). HBV är en allvarlig hälso-och börda över hela världen, eftersom det finns 350 miljoner personer infekterade med HBV och kronisk HBV-infektion kan leda till utveckling av hepatocellulär cancer (HCC). HCC celler som härrör från HBV-infektion kan vanligtvis presentera HBV-derived epitoper och kan kännas igen av specifika mänskliga T celler. HBV- och HCC clearance är beroende av den mänskliga T-cell svar26, men HCC patienter lider ofta av T-cell utmattning och nedsatt T-cell svar27. Införandet av HBV-specifika TCR i T-celler av HBV har prövats som en potentiell immunterapi strategi att eliminera kronisk HBV-infektion28. Det är dock okänt om denna metod kommer att vara effektiv i en klinisk miljö, på grund av de låga nivåerna av surface MHC-I i humana hepatocyter29. Därför kan förstå mekanismen av coagonism ge alternativa perspektiv för immunterapi av HBV, möjligen genom att förbättra presentationen av endogena pMHC att framkalla co-agonism-medierad T-cell svar. Protokollet omfattar alla åtgärder som behövs för forskning på mänskliga co-agonism: transfection av T-REx CHO celler med agonist och samtidig agonist sc pMHC, generation av stabil T-REx CHO cellinjer, kultur av HBV-specifika mänskliga CTL CD8 + T cell fodrar och CTL aktivering experiment kvantifiera cytokin produktion och degranulering svar till T-REx CHO celler. Även om vi fokuserar på att använda den sc MHC klass I teknik för att undersöka co-agonism under HBV T cellaktivering, det måste noteras att de presenterade metoderna kan enkelt anpassas för forskning om andra aspekter av T-cellsaktivering i mänsklig T cellsystem med kända pMHC-jag specificitet.
Detta protokoll används en mänskliga CD8 + CTL linje specifikt för HBV-derived peptid E183-91 (FLLTRILTI: ”E183”)30 presenteras på HLA-A2. SC HLA-molekyler som består av en signal sekvens från mänskliga β2-mikroglobulin, ett HLA-A2 bindande peptid av intresse, en glycin/serin länkare, en mänsklig β2-mikroglobulin, en glycin/serin länkare och en A2 tung kedja kan vara kommersiellt syntetiseras (figur 1A ). Plasmider kodning scA2 konstruktioner med agonist E183 peptid eller coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 peptider är tillgängliga från författarna på begäran. Peptid sekvensen kan ändras med webbplatsen regi-mutagenes. En tetracyklin-inducerbara vektor användes pcDNA5/att för att uttrycka agonist enda kedjan HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I närvaro av tetracyklin repressor, pcDNA5/till plasmid tillåter endast mycket låga, ”läckande” uttryck av proteinet av intresse. hög uttryck kan induceras genom tillsats av tetracyklin (figur 1BC). Användning av tetracyklin-inducerbara uttryck system tillåter kontroll över mängden cell surface agonist pMHC uttryck. Ett konstitutivt uttryck plasmiden pcDNA3.1 användes för att uttrycka coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracyklin-reglerade uttrycket (T-REx) CHO cell (linje hamster cell, ingen endogena mänskliga MHC) användes för att uttrycka agonist och samtidig agonist sc-HLA-A2 konstruktioner. Detta experimentella system möjliggör exakt kontroll över pMHC presentation (figur 1 c): ingen pMHC presentation (untransfected T-REx), en stor mängd co agonist pMHC presentation (konstituerande sc GAG-HLA-A2 uttryck), en låg mängd agonist pMHC presentation (sc E183-HLA-A2 i avsaknad av tetracyklin), en stor mängd agonist pMHC presentation (sc E183-HLA-A2 i närvaro av tetracyklin), en låg mängd agonist pMHC presentation och hög uttryck för samtidig agonist pMHC (sc E183-HLA-A2 i den frånvaron av tetracyklin och konstituerande sc GAG-HLA-A2 uttryck). Användning av detta experimentella system tillåter exakt kontroll av cell surface mängder agonist och coagonist pMHC.
Presenterade protokollet ger ett robust verktyg för utredning av molekylära interaktioner under mänskliga CD8 + T cellaktivering. Ett avgörande steg för utredning av co-agonism under mänsklig T cellaktivering är kontroll över agonist pMHC cell surface uttryck för att säkerställa lika agonist pMHC presentation på trupptransportfordon med eller utan samtidig agonist pMHC uttryck. I våra experimentella system, detta uppnås genom att använda en enda cell klon uttrycker låga mängder agonist pMHC, följt av supertransfection med samtidig agonist pMHC konstruera och agonist pMHC kvantifiering använder TCR-liknande antikropp10, 32. som agonist sc pMHC uttryck kan förändras över tid, är det kritiskt att kvantifiera agonist pMHC yta uttryck på trupptransportfordon som används i varje experiment med TCR-liknande antikroppar. Om inga specifika TCR-liknande antikropp är tillgänglig, agonist scMHC-jag kan uttryckas som fluorescerande protein fusion, och dess cell surface uttryck kan då kvantifieras med en känslig mikroskopi metod, såsom Totalreflexion fluorescensmikroskopi 35 , 36. Dessutom cell surface uttryck för samtidig agonist pMHC minskar med tiden, på grund av metylering-beroende och -oberoende ljuddämpning av CMV arrangören37, och bör övervakas med antikropp färgning och flöde flödescytometri analys, med upprepade FACS-sortering när det behövs. Vi har odlade CHO celler för upp till 5 veckor med relativt begränsad förlust av sc pMHC uttryck. Vi rekommenderar frysning CHO celler snart efter urval/sortering att säkerställa en tillförlitlig lager av celler med kända sc MHC uttrycket.
Flera steg i protokoll som presenteras kan ändras, beroende på tillgången på utrustning eller beroende på syftet specifik forskning. Till exempel PBMC spridning potentiella kan vara hämmade (steg 3.2.1) med alternativa metoder som inte kräver en gamma (eller X-) irradiator, såsom behandling med mitomycin C38. En icke-enzymatiska cell dissociation buffertar som innehåller metall kelater39 kan användas i stället för cell skrapning i steg 3.3.1. Dessutom den antigenpresenterande system kan ändras för att göra den mer lämplig för mänskliga CTL kloner att uttrycka olika TCRs. CHO celler express hamster MHC klass I molekyler, och även om dessa är irrelevant för CTL raden utstuderat här (figur 2A och Figur 3A, vi observerade inga T-cell svar till untransfected CHO-celler), det finns en möjlighet att andra mänskliga TCRs kan visa vissa xenoreactivity. I att fallet, hamster MHC klass I uttryck kan minskas genom att slå ut hamster β2-microglubulin eller tryck med hjälp av CRISPR/Cas9; eller en mänsklig APC-linje kan användas efter CRISPR/Cas9-medierad β2-microglubulin eller peka på slå ut.
Den experimentella system presenteras här tillåter exakt kontroll av TCR och CD8 interaktioner med MHC molekyler presentera fördefinierade peptider. Till exempel, har vi tidigare visat att mutationer att avskaffa CD8 bindande40 till coagonist pMHC elimineras coagonist-medierad aktivering enhancement i murina och mänskliga CD8 + T celler9,10, medan om upphävande av TCR interaktion med samtidig agonist pMHC hade ingen effekt på coagonist-medierad aktivering enhancement10. Användning av enda kedja MHC konstruktioner har dock flera begränsningar. Exempelvis är det dags och tidskrävande arbete att testa flera samtidig agonist peptid sekvenser med detta experimentella system, eftersom detta innebär generering av flera plasmider kodning sc MHC med olika peptider, och efterföljande transfections och cell sortering. Tidigare använde vi den murin cellinje från TAP-brist RMA-S för att testa flera samtidig agonist peptider i musen T cell aktivering8,9, men detta tillvägagångssätt var inte framgångsrik med TAP-brist mänskliga T2 cell linje10, troligen på grund av presentation av TAP-oberoende peptider41. En annan begränsning av våra experimentella system är som är inte ger en snabb metod för att ändra mängden co agonist pMHC molekyler för att fastställa kritiska mängden co agonist pMHC krävs för att utlösa T-cellsaktivering. Dessutom tillåter tetracyklin-inducerbara systemet används inte titrering av agonist pMHC kvantitet på nivån enda cell genom att ändra tetracyklin koncentrationen, eftersom varierande tetracyklin koncentration förändrar andelen av HLA-A2 positiva celler, snarare än HLA-A2 nivåer per cell utifrån. Ett alternativt tillvägagångssätt som vi undersöker för närvarande är att använda stöds lipid lipidmonolager42, tidigare använde för att undersöka co-agonism under murina CD4 + T cell aktivering4 eller pärlor presentera fast mängd agonist pMHC i den närvaro av varierande mängder av samtidig agonist pMHC. När används i kombination med UV-cleavable peptid teknik4,43, bör dessa alternativa experimentella system möjliggör snabb testning av flera samtidig agonist peptid sekvenser samt olika mängder co agonist pMHC .
Sc MHC tekniken kan tillämpas också på utredning av co-agonism i mänskliga eller murina CD4 T-celler, som enda kedja MHC klass II molekyler presentera förutbestämda peptider har uttryckts framgångsrikt på däggdjursceller ytor44. Dessutom kan användningen av sc MHC-teknik förlängas till utredning av icke-klassisk MHC molekyler såsom HLA-E. SC HLA-E har beskrivits tidigare, och dess uttryck har visats hämma mänsklig T cell aktivering45. En annan icke-klassisk MHC-molekyl av intresse är CD1, som presenterar lipider i stället för peptider46. SC konstruktioner som består av CD1 tung kedja och β2-mikroglobulin har visat att uttryckas på cellytan och binda relevanta lipid ligander47. Enda kedja MHC-tekniken har stor potential som ett verktyg för forskning för att undersöka molekylära interaktioner under T- och NK cellaktivering.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskningsrådet under dess CBRG/0064/2014 till N.R.J.G., genom att skapa under dess R571-002-012-592 till pam., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 till pam ., och genom en Singapore translationell forskning (STaR) Investigator Award (NMRC-stjärnigt-013/2012) att A.B. Vi är tacksamma att Dr. Paul Hutchinson och Mr Teo Guo Hui från NUS immunologi programmet Flow Core facilitet för expert cell sorteringen. Vi är tacksamma att Elijah Chen för kritisk läsning av manuskriptet.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |