Detta protokoll visar injektion av ett retrogradely transportabla virala vektorn i råtta ryggmärgsvävnad. Vektorn tas upp vid synapsen och transporteras till cellkroppen av målet nervceller. Denna modell är lämplig för retrograd spårning av viktiga spinal vägar eller inriktning celler för gen terapi program.
Att införa proteiner av intresse i celler i nervsystemet är utmanande på grund av medfödda biologiska hinder som begränsar tillgång till de flesta molekyler. Injektion direkt i ryggmärgsvävnad förbi dessa hinder, som ger tillgång till cellen organ eller synapser där molekyler kan införlivas. Att kombinera virala vektorn teknik med denna metod möjliggör införsel av målgener nervvävnad i syfte att genterapi eller tarmkanalen spårning. Här introduceras ett virus konstruerade för högeffektiva retrograd transport (HiRet) på synapserna av propriospinal interneuroner (PNs) att främja särskilda transporter till nervceller i ryggmärgen och hjärnstammen atomkärnor. Inriktning PNs utnyttjar de talrika anslutningar som de får från motoriska vägar såsom de rubrospinal och reticulospinal skrifter, liksom deras sammankoppling med varandra under hela ryggmärgen segmenten. Representativa spårning med HiRet vector med konstitutivt aktiv grönt fluorescerande protein (GFP) visar HiFi Detaljer för cell organ, axoner och dendritiska arbors i bröstkorg PNs och reticulospinal nervceller i pontine reticular formation. HiRet innehåller väl in i hjärnstammen vägar och PNs men visar ålder beroende integreras corticospinal tarmkanalen nervceller. Sammanfattningsvis är spenat snore injektion med virala vektorer en lämplig metod för införandet av proteiner av intresse i nervceller av riktade skrifter.
Virala vektorer är viktiga biologiska verktyg som kan införa genetiska materialet i celler för att kompensera för defekta gener, upregulate viktig tillväxt proteiner eller tillverka markör proteiner som framhäver strukturen och synapsförbindelser av sina mål. Denna artikel fokuserar på direkt injektion av en högeffektiv retrogradely transportabla lentiviral vektor i råtta ryggmärgen för att belysa större motoriska vägar med fluorescerande spårning. Denna metod är också mycket lämplig för axonal föryngring och återväxt studier att införa proteiner av intresse i olika populationer av nervceller och har använts för att tysta nervceller för funktionell kartläggning studier1,2.
Många av de anatomiska detaljerna för spinal motoriska vägar var klarlagd genom direkt injektion studier med klassiskt spårämnen såsom BDA och fluoro-guld3,4,5,6,7 , 8. dessa spårämnen anses guldmyntfoten men kan ha vissa nackdelar såsom upptag av skadade axoner, eller axoner i passage i den vita substansen kring en injektion webbplats9,10,11 . Detta kan leda till felaktiga tolkningar av väg anslutning och kan vara en nackdel i regenerering studier där färgämne absorption av skadade eller avhuggna axoner kan misstas för regenererande fibrer under senare analys12.
Lentiviral vektorer är populära i gen terapi studier, eftersom de ger stabil, långsiktig uttryck i neuronala populationer13,14,15,16,17,18 ,19. Men traditionellt paketerade lentiviral vektorer kan ha begränsad retrograd transport och kan utlösa immunsystemet när den används i vivo4,20,21. En mycket effektiv retrograd transport vektor kallas HiRet har producerats av Kato et al. genom att ändra virala kuvertet med en rabies virus glykoprotein att skapa en hybrid-vektor som förbättrar retrograd transport22,23.
Retrograd spårning introducerar en vektor i synaptiska utrymmet av en target neuron, så att den kan tas av cellens axon och transporteras till cellkroppen. Framgångsrika transport av HiRet har påvisats från nervcellernas synapser i hjärnan hos möss och primater23,24 och från muskeln till motoriska nervceller22. Detta protokoll visar injektion i ländryggen ryggmärgen, särskilt inriktad på propriospinal interneuronen och hjärnstammen nervceller synaptiska terminaler. PNs ta emot anslutningar från många olika spinal vägar och kan således användas för att rikta en mångskiftande befolkningen av nervceller i ryggmärgen och hjärnstammen. Märkt nervceller i denna studie utgör kretsar innervating motorneuronen pooler avser bakbenet motorik. Robust märkning ses i ryggmärgen och hjärnstammen, inklusive HiFi Detaljer för dendritiska arbors och axon terminaler. Vi har också använt denna metod i tidigare studier inom den cervikala ryggmärgen för att märka propriospinal och hjärnstammen reticulospinal vägar25.
Detta protokoll visar injektion av en viral vektor i ländryggen ryggmärgen på en råtta. Som kan ses i filmen 1, riktar snittet genom att identifiera den L1-kotan som ligger på revbenet. Detta används som ett kaudala landmärke för en 3-4 cm snitt som exponerar muskulatur över L1-L4 ryggmärgen. Laminectomies av de dorsala aspekterna av T11-T13 kotorna utförs och avfasade glas nål är riktad 0,8 mm i sidled från mittlinjen och sänkt 1,5 mm djupt in i den grå substans att injicera viruset.
Genmanipulation av nervceller i hjärnan och ryggmärgen har tjänat till att markera sensorisk, motorisk och autonoma vägar via fluorescerande spårning och att utforska återväxt potential av neuronala skrifter efter skada27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkt injektion av ett retrogradel…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades genom ett bidrag från de nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke R01 R01NS103481 och Shriners sjukhuset för pediatrisk forskning bidrag SHC 84051 och SHC 86000 och försvarsdepartementet (SC140089).
#10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors. |
Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |