Summary

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Published: April 01, 2019
doi:

Summary

היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.

Abstract

אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.

Introduction

פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס”מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.

שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,2,3. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis4. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.

כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות5. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.

חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה1,2,3 ,5. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.

בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית. 1. לגרדום הייצור להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת …

Representative Results

איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6. איור 2 הו…

Discussion

התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).

Materials

0.9% Sodium chloride injection APP Pharmaceuticals NDC 63323-186-10
10cc serological pipet Falcon 357551
18G 1.5in. Needle BD 305190
1mL Syringe BD 309659
24-well plate Corning 3526
25cc serological pipet Falcon 356535
25G 1in. Needle BD 305125
50cc tube BD 352070
Alcohol prep pads Fisher Healthcare NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution Bayer Healthcare, LLC NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0 AROSurgical Instruments Corporation T05A09N10-13
C57BL/6, female Jackson laboratories 664 6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate ThermoFisher 5000
Colibri retractors F.S.T 17000-04
Cotton tipped applicators Fisher scientific 23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody ThermoFisher MA5-11599
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20
Dumont #5/45 forceps F.S.T 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps F.S.T 11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody Bio-Rad MCA497R
Ficoll Sigma 10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt F.S.T 14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses ThermoFisher 12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI Abcam ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 ThermoFisher A-21247
Ibuprofen Precision Dose, Inc NDC 68094-494-59
Iodine prep pads Professional disposables international, Inc. NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified BioLegend 905501
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps F.S.T 11018-12
Microscope Leica M80
Non-woven sponges Covidien 441401
Opthalmic ointment Dechra Veterinary products NDC 17033-211-38
PBS Gibco 10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds Nanofiber solutions Custom ordered
Petri dish BD 353003
RPMI 1640 Medium Gibco 11875-093
TISH Needle Holder/Forceps Micrins MI1540
Trimmer Wahl 9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors F.S.T 15008-08
Warm water recirculator Gaymar TP-700
Xylazine sterile solution Akorn animal health NDC 59399-110-20

References

  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  3. Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
  4. Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
  5. Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
  6. Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
  7. Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
  8. Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
  9. Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
  10. Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
  11. Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wiet, M. G., Dharmadhikari, S., White, A., Reynolds, S. D., Johnson, J., Breuer, C. K., Chiang, T. Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (146), e59173, doi:10.3791/59173 (2019).

View Video