Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino
Summary
Stenosi dell’innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell’impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l’impianto.
Abstract
Opzioni di trattamento per difetti tracheale congenita o secondaria lungo segmento storicamente sono state limitate a causa di un’incapacità di sostituire il tessuto funzionale. Ingegneria tissutale tiene la grande promessa come potenziale soluzione con la sua capacità di integrare le cellule e molecole di segnalazione di un’impalcatura 3-dimensionale. Lavoro recente con innesti di tessuto ingegnerizzato tracheale (TETGs) ha visto un certo successo, ma loro traduzione è stata limitata dalla stenosi dell’innesto, innesto crollo e ritardato epithelialization. Al fine di indagare i meccanismi che guidano questi problemi, abbiamo sviluppato un modello murino per l’impianto di protesi tracheale ingegnerizzata. TETGs sono stati costruiti utilizzando elettrofilate polimeri in polietilene tereftalato (PET) e poliuretano (PU) in una miscela di PET e PU (20: 80 per cento del peso). Ponteggi sono state seminate utilizzando cellule mononucleari del midollo osseo isolate da 6-8 settimana-vecchi topi C57BL/6 tramite centrifugazione di pendenza. 10 milioni di cellule per innesto sono state seminate sul lume dell’impalcatura e lasciate Incubare durante la notte prima dell’impianto tra i terzi e settimo tracheali anelli. Questi innesti sono stati in grado di riassumere i risultati di stenosi e ritardato epithelialization come dimostrato dall’analisi istologica e la mancanza di cheratina 5 e la cheratina 14 cellule epiteliali basali su immunofluorescenza. Questo modello servirà come uno strumento per indagare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nel rimodellamento di host.
Introduction
Lungo-segmento tracheali difetti possono presentare come congenite rare condizioni come completi anelli tracheali e agenesia della trachea, così come traumi, malignità e infezione. Quando superiore a 6 cm in 30% della lunghezza trachea in bambini o adulti, questi difetti non possono essere trattati con ricostruzione chirurgica. Tentativo di sostituire le vie respiratorie con tessuto autologo, trapianto cadaverico e costrutti artificiali è stati afflitti da infezione cronica, granulazione, guasto meccanico e stenosi.
Innesti di tessuto ingegnerizzato tracheali (TETGs) possono potenzialmente risolvere questi problemi, evitando la necessità di immunosoppressione tutta la vita. Nell’ultimo decennio, TETGs sono stati testati in modelli animali e utilizzate clinicamente in rari casi di uso compassionevole1,2,3. Negli studi sugli animali sia clinici che grandi, recupero post-operatorio da tessutale delle vie respiratorie sostituzione necessari numerosi interventi per stenosi combattimento (definita come > 50% lo stringimento luminal) e mantenere la pervietà delle vie aeree. Lavoro supplementare TETG ha cercato di ridurre questa stenosi attraverso valutare il ruolo della semina scelta, vascolarizzazione e impalcatura design cellulare. Impalcatura design finalizzate al ripristino nativo trachea struttura/funzione e scelte semina delle cellule sono stati concentrati principalmente su cellule epiteliali respiratorie e condrociti seminati su vari ponteggi riassorbibili, non riassorbibile e decellularizzati. Come vascolarizzazione probabilmente gioca un ruolo importante nello sviluppo di stenosi, altri gruppi hanno messo a fuoco sull’ottimizzazione in vitro o eterotopica modelli per accelerare la rivascolarizzazione o neoangiogenesi4. Ciò nonostante, ottenendo successo vascolarizzazione pur mantenendo un TETG meccanicamente competenti e funzionale rimane una sfida. Nonostante i recenti progressi, riducendo al minimo la stenosi rimane un ostacolo fondamentale alla traduzione clinica.
Per studiare questa risposta istopatologica a TETG l’impianto in vivo, abbiamo sviluppato un modello ovino di sostituzione tracheale tessutale. L’innesto era composto da un misto di polietilene tereftalato (PET) e poliuretano dell’impalcatura elettrofilate (PU) seminati con cellule mononucleari derivate da midollo osseo (BM-MNC). In questo piccolo gruppo, abbiamo dimostrato che seminato autologo BM-MNC accelerata riepitelizzazione e stenosi5in ritardo. Sebbene la semina con autologo BM-MNC migliorata sopravvivenza, il meccanismo cellulare da cui BM-MNC modulano la formazione di tessuto funzionale rimane poco chiaro.
Indagine sullo sviluppo richiesto livello cellulare di un modello murino di tessuto ingegnerizzato sostituzione tracheale. Simile allo studio degli ovini, abbiamo utilizzato un ponteggio elettrofilate PET:PU seminato con BM-MNCs. coerentemente con il modello ovino, stenosi TETG sviluppato nel corso delle prime due settimane dopo l’impianto1,2,3 ,5. Ciò ha suggerito che il modello murino ha ricapitolato la patologia osservata in precedenza, che ci permette di interrogare ulteriormente i meccanismi cellulari alla base di stenosi della via aerea.
In questo rapporto, abbiamo dettaglio il nostro protocollo per ingegneria tessutale sostituzione trachea nel modello del topo tra cui impalcatura produzione, isolamento BM-MNC, innesto semina e l’impianto (Figura 1, Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppo di un modello murino per i tracheas tessutale è essenziale nella comprensione dei fattori che hanno limitato la traslazione clinica TETGs; vale a dire dell’innesto crollo, stenosi ed epithelialization in ritardo4. Alcuni fattori che contribuiscono a queste limitazioni includono la selezione del materiale dell’innesto, il processo di fabbricazione, design di impalcatura e semina protocolli cellulare. Questo modello tiene conto la valutazione più veloce di questi fattori al fine di compre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Robert Strouse e la divisione di innovazioni all’ospedale dei bambini a livello nazionale per il loro supporto e soluzioni di ricerca informazioni in progettazione grafica. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
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