Summary
היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.
Abstract
אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.
Introduction
פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס"מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.
שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,-2,-3. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis4. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.
כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות5. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.
חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה1,2,3 ,5. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.
בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית.
1. לגרדום הייצור
- להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת החדר.
- ברגע מקורר, לשלב את הפתרונות כדי ליצור תערובת פולימר הסופי של חיית המחמד, פו (20:80).
- Electrospin הפתרון PET+ פו על גבי מוט פלדה אל חלד (1 מ"מ קוטר), ניצול מחט קצה קהה 20 גרם על מזרק 60 מ ל מלא הפתרון PET:PU באמצעות ערכה אספקת החשמל של DC מתח גבוה כדי +14 kV המחט, עוד כוח DC מתח גבוה לספק מוגדר כ-3 kV , קצב זרימה מ ל/h, ובמרחק עצה-אל-המצע 20 ס מ. לסובב את המוט ב 350 סל"ד במהלך התצהיר סיבים.
- המשך electrospinning עד עובי קיר לגרדום הרצוי מיקרומטר 300 מושגת. שקופית לגרדום את המוט, ולאחר מכן להחזיק אותו מתחת ואקום למשך הלילה כדי להסיר כל הממס שיורית.
- לחטא לגרדום באמצעות של מינון אור אולטרה סגול של mJ/ס מ 3502 לפני ההשתלה.
2. מח עצם-Derived תא תאי (מוניטור-MNC) קציר
- המתת חסד של 6-8 שבועות העכבר הישן, נקבה, C57BL/6 עם קוקטייל של קטאמין (200 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (10 מ"ג/ק"ג). בדוק המתת חסד מוחלט בשיטה הזנב-קורט. הקפד לעקוב אחר הנחיות מקומיות המתת חסד.
- תחת תנאים סטריליים, מסירים את העור של עצמות הירך ושל tibias לחשוף את העצם באמצעות מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. השתמש דומונט #5 מלקחיים מלקחיים דומונט #5/45 כדי להסיר את הגידים fascia. להפריד בין העצמות וחותכים כל אחד מהם על שני הקצוות. באמצעות מזרק 5 מ ל ו מחט 25 גרם, לרוקן את מח העצם בצלוחית המכילה 30 מ של מדיה המכון ממוריאל פארק Rosewell (RPMI). לסנן את RPMI עם מח עצם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ניילון לתוך צינור 50 מ.
- במקום ארון אבטחה, 5 מ של diatrizoate polysurcrose ו נתרן בצינור 15 מ"ל. להוסיף בעדינות את RPMI המכיל תאים תאי מח העצם בצד של הצינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות. צנטריפוגה ב x 461 g למשך 30 דקות עם "בלם 1" ב- 24 מעלות צלזיוס.
הערה: על שלנו צנטריפוגה, בלם 1 עומד על פרק הזמן הארוך ביותר להפעיל את משך זמן ההאטה. - ללא שלושת השכבות נוצרו, למחוק את השכבה העליונה (ורוד) של פלסמה ולאסוף את השכבה האמצעית (ברור) המורכב של תאי תאי מח העצם. למחוק את התמיסה של כדוריות דם אדומות.
- לדלל התאים תאי מח העצם (מוניטור-MNC) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) יחס 1:1, צנטריפוגה ב 461 x g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.
- הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם 5 מ של PBS. צנטריפוגה ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.
- הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם ~ 10 מ"ל של RPMI.
- לדלל 10 µL של הפתרון BM-MNC עם אמצעי אחסון שווה של 0.4% trypan blue צינור 1 מ"ל. מקום 10 µL של הפתרון בתא ספירה קאמרית שקופית. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. חזור על השלב ולחשב את המספר הממוצע של תאים.
הערה: ספירת התאים הממוצע של עונה 1 פרק 108 תאים הושג משימוש של שני עכברים התורם. . זה יהיה שווה ערך ל שתי עצמות הירך, שני tibias אשר עצם מח מנותקת. - Centrifuge הפתרון BM-MNC ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, לדלל את ריכוז תא 107 תאים/שתל.
הערה: יש למד זריעה יעילות בין 1, 10, 100 מיליון תאים ואנו נמצאו 10 מיליון תאים לכל שתל התשואות זריעה היעילות הגבוהה ביותר.
3. תא זריעה על השתלים
- למדוד את האורך של פיגומים, במידת הצורך, לחתוך אותם לאורך של 5 מ מ.
- טרום רטוב לגרדום עם 5 µL של RPMI עבור 5 דק. להסיר RPMI.
- להוסיף 5 µL של הפתרון BM-MNC לומן של לגרדום במשך 10 דקות.
- לעבור מחט 21G דרך לומן של השתל, דגירה השתל ב 1000 µL של RPMI בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.
4. להשתיל השרשה
הערה: להקפיד לשמור על הטכניקה aseptic במהלך ההליך השרשה שתל.
- שימוש עכברים C57BL/6 נקבות 6-8-בת שבוע הנמענים עבור השתלים תא נזרע. להזריק enrofloxacin (10 מ"ג/ק"ג) subcutaneously 24 שעות לפני הניתוח, קצת לפני החיתוך.
- שוקל את העכבר ולפקח מנה 0.1 מ"ל/10 גרם של הקוקטייל הרדמה קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) כמו שיכוך כאבים intraperitoneally.
- בדוק אם המטוס של הרדמה הושג בזכות שיטת הזנב-קורט. על המאשרת את הרמה של הרגעה, להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים ולגזור את השיער באתר כירורגית של הסנטר הכסל. במקום החיה על כרית במצב שכיבה הגבי. לחטא באתר כירורגית באמצעות קודם פנקס ההכנה povidone יוד, ואחריו כרית ההכנה אלכוהול (70% אלכוהול), ולא פעם נוספת משטח ההכנה povidone יוד.
- מקם את החיה תחת המיקרוסקופ ויבתר עם הראש שלה מן המנתח. עושים חתך קו האמצע החל את עצם הבריח עצם הלשון בעזרת מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. נקה fascia דומונט #5, מלקחיים בסדר דומונט #7, יחד עם ספוגית כותנה סטרילי אם צריך, הוספת מפסק קוליברי שהגנו עצמית.
- פתח את השרירים רצועה (איור 3א') עם מלקחיים בסדר דומונט #5 ו- 7 # דומונט לחשוף סחוס התריס, הסחוס הטבעתי, קנה הנשימה. בלשון בוטה להפריד את קנה הנשימה העצבים בגרון חוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדדיו, ואחריה ההפרדה במבניו של חוליות הצוואר הוושט (איור 3ב).
- באמצעות המחט 20 גרם סמן כירורגי, מכתים את החלק הקדמי של קנה הנשימה.
- לזהות את קנה הנשימה בחתך מתחת הצלצול השלישי. הסחוס בקנה הנשימה, transect קנה הנשימה באמצעות מספריים האביב Vannas-Tubingen וזוג מלקחיים בסדר דומונט #7. מחזיק את זה עם המלקחיים מעוקל בסדר, לאבטח קנה הנשימה דיסטלי לעצם החזה באמצעות סטרילי 9-0 תפר ניילון כדי ליצור מיכשור וציוד זמניים (איור 3C). הערה: חומר תפרים אלטרנטיביים שיכולים לשמש היא PDS 9-0 עבור reapproximation השרשה ושרירים בקנה הנשימה.
- עם מחט 20 גרם, סמן כירורגי, כתם השתל לייצג את החלק הקדמי.
- להשתיל את השתל הוספת צינתור-האחורי, צינתור-צדדי, התפרים proximal הקדמי, הסדר הזה באמצעות תפר ניילון סטרילי 9-0 (איור 3ד'), דומונט #7 עדינים מלקחיים בעל מחט.
- פונים בעלי חיים ליד ב 180 מעלות כדי למקם את הזנב שלו מן המנתח. שחרר את זמני מיכשור וציוד. קנה הנשימה דיסטלי שהיישום transected כדי להתיר את השימוש של המקטע resected כמו גזע עבור הכחשה. כאשר אין בה צורך, קטע קנה הנשימה של 5 מ מ מוסר לחלוטין.
- להשלים את ההשקה דיסטלי על-ידי הצבת התפרים בצורה דומה כמו ההשקה הפרוקסימלית.
- להעריך מחדש את מיקום השתל והשרירים רצועה. סגור את החתך בעזרת תפרים ניילון סטרילי 9-0 בתבנית פועל.
- מזריקים 0.1 מ"ל של הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously ומניחים את החיה בתוך כלוב ההתאוששות מונחת כרית החימום ללא בעלי חיים אחרים בתוך הכלוב.
- להתבונן על העכבר עד שזה המודעים והבלתי מודעים, היכולת ambulate, ולאחר מכן העבר את העכבר לכלוב חדש עם מצעים רכים, צ'או לחות ומים תרופות (איבופרופן, 30 מ"ג/ק"ג) במשך 48 שעות. לאחר פרק זמן זה, להחזיר את העכבר כלוב רגיל עם עכברים אחרים.
הערה: עכברים לשמור על מצוקה נשימתית או ירד פעילות לאחר ההשתלה הם נצפו על ידי צוות המעבדה ו/או בעלי חיים בחממה 32 מעלות צלזיוס. אם זה נמשך יותר מ 48 שעות, ואז העכברים צריך להיות מורדמים.
5. היסטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה
הערה: כתמים Hematoxylin ואאוזין בוצעו באמצעות טכניקה סטנדרטית על-ידי הליבה מורפולוגיה של בית החולים לילדים ארצית. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על פי להלן השלבים.
- Deparaffinize השקופיות באמצעות 1) קסילן במשך 5 דקות, קסילן 2) במשך 5 דקות, 3) 100% אתנול 5 דקות, 4) 90% אתנול במשך 5 דקות, 5) 70% אתנול ' מזערי ' 5, 6) מזוקקים H2O (dH2O) במשך 5 דקות.
- להטביע את השקופיות במאגר ציטראט ומניחים בסיר לחץ מלא מים. חום במשך 10 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף עם אלבומין שור 0.1% ב- PBS (BSA-PBS) עבור 5 דק שטיפה עם dH2O.
הערה: חימום יכול להעשות גם עם אמבט מים חמים או במיקרוגל למשך 15 דקות. - דגירה של השקופיות עם סרום עז רגיל 3% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר. תשטוף עם 0.1% BSA-PBS עבור 5 דק דגירה של נוגדן ראשוני עם ריכוזים של קרטין 5 קרטין 14 (1:250)6 (1:1000)6, ו- F4/80 (1: 100)7 עבור 18 h בין לילה ב 4 º C.
- לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף. דגירה עם נוגדן המשני המתאים-ריכוז שבערך K5/K14, 1:300 F4/80 לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף.
- הר באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenolindole (דאפי) המכיל הרכבה מדיה וזכוכית שער גולשת. אפשר לשבת במשך 30 דקות לפני הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6.
איור 2 הוא סקירה של לגרדום PET:PU TETG תהליך הייצור. פתרון PET:PU היה electrospun על גבי מחט בוטה 20 גרם כדי להשיג את עובי הקיר TETG הסופי של 300 מיקרומטר ו לומן בקוטר של 1 מ"מ עד משוער העכבר יליד קנה הנשימה. פני השטח של TETG ניתן לראות בתמונה לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון עם תאי תאי אנימציה.
בהליך ניתוחי ההשתלה המותווה באיור 3 עם הצעדים החשובים ביותר המוצג. איור 3 מראה את ההפרדה, הכחשה של השרירים רצועה (איור 3א) ובידוד הבאים במבניו של חוליות הצוואר מ סביב רקמות (איור 3ב). איור 3 ג מדגים את זמני מיכשור וציוד דיסטלי עם קובץ מצורף אל החריץ בחזה ובצלעות כדי להבטיח דרכי הנשימה הפטנטים במהלך ההליך. לבסוף, איור 3D מראה השתל במקום לאחר חיבור הסופי.
במחקר עוקבה קטן, ארבעה עכברים היו מושתלים עם TETGs, עקבו במשך שבועיים. כמה תאים אפיתל הבזליים ניתן להערכה של קרטין הבזליים 5 ו- 14 מכתים שמוצג באיור 4A-C. התמונה משולב (איור 4C) מציגה הנוכחות של התאים הבזליים על פני השטח luminal של השתל ב 7 ימים לאחר ההשתלה.
שלוש מתוך ארבע חיות הראה סימנים של מצוקה נשימתית, סטרידו, שניים מהם נדרש סיום מוקדם בימים שלאחר הניתוח 1 ו- 7. על explantation וניתוח היסטולוגית, היצרות שתל זוהה כגורם תורם מרכזי לסיבוכים. איור 5 A-E מעניק תצוגה של החיה יום לאחר הניתוח 7 אזור stenotic TETG. ראוי לציין, telescoping של השתל, יליד קנה הנשימה הוא ממצא נפוץ בשל טכניקה כירורגית. נמוך (איור 5א) וגבוה (איור 5B) מופעל photomicrograph של היצרות מדגים אחד הסיבוכים העיקריים של TETG-השרשה. איור 5 C הוא כתם F4/80 נציג וחושפים הנוכחות של המארח המקרופאגים באזור stenotic. איור 5 איור 5E ו- D שוב להראות תאים אפיתל הבזליים סמני הקרטין 5 ו-14 על האזור stenotic של השתל.
איור 1 : TETG seeding, השרשה סכמטי. תאי תאי מח עצם-derived המתקבל עכבר התורם היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גרדום, מושתל לתוך עכבר הנמען. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Electrospinning של רקמות מהונדסים שתל והכו אותי. (א) סקירה של תהליך electrospinning. (B) 20 גרם מחט בוטה לשמש סיבוב מוט לייצר פיגומים העכבר. (ג) אנימציה SEM סכמטי של משטח לגרדום אחרי תאי תאי נוספו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סקירה של השתלה כירורגית של לגרדום. (א) ההפרדה, הכחשה של רצועה השרירים. (B) במבניו פרידתה של חוליות הצוואר סביב רקמות/איברים. (ג) יצירה של מיכשור וציוד זמני וקובץ מצורף אל החריץ בחזה ובצלעות. (ד) מושתל שתל לאחר חיבור הפרוקסימלית ו דיסטלי. סרגל קנה מידה = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : עדות היסטולוגית של תאי אפיתל הבזליים. מיזוג תמונה immunofluorescence של התאים הבזליים סמני קרטין 5 (א), קרטין 14 (B), הקרטין הממוזג 5, קרטין 14 (ג). החץ מסמל צמיחה רקמת האפיתל בצומת לגרדום-יליד רקמות. לומן, לגרדום מסומנים (*) ו (
), בהתאמה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ויזואליזציה היסטולוגית של אזור stenotic של שתל. (א) למחלקה Longitudinally H & E באורך של קנה הנשימה כולל שתל עם היצרות דיסטלי ליד ההשקה. סרגל קנה מידה = 500 מתח גבוה תמונות מיקרומטר. האזור stenotic שנבחר באמצעות H & E (B), F4/80 (ג), קרטין 5 (ד) ו- 14 קרטין (E). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על מנת להבין את המנגנונים תאית ומולקולרית משפיע עליהם.
שהראתי כאן הנוכחות של תאי אפיתל (איור 4), כמו גם את היכולת של המודל מסכם את הדברים שתל היצרות (איור 5); עם זאת, שימוש מוצלח של המודל תלוי כמה צעדים מפתח במהלך תהליך ההשתלה. ראשית, במהלך החתך הראשוני ובידוד של קנה הנשימה העכבר, זה חיוני כדי למנוע פציעות או מתיחה של העצבים בגרון חוזרים ונשנים סמוך ממוקם ב- tracheoesophageal groove. גורם חשוב נוסף במהלך כריתה של קנה הנשימה הטבעית היא למנוע נזק הוושט יושבת אחורי לקנה הנשימה.
צנרור אנדוטרכאליות ניתן למנוע על-ידי יצירה של מיכשור וציוד זמני כדי לאפשר זרימת אוויר במהלך ההליך. חשוב, עם זאת, כדי למנוע כל דבר (קרי, רקמות) חוסם את מיכשור וציוד דיסטלי זמניים, וכן שמירה על קנה הנשימה מחוץ לתוך חלל הגוף כדי להקל על הנשימה. שתל telescoping תופעה שכיחה בקרב שתל השתלות, ניתן לראות על חלקים היסטולוגית.
דגמים בעלי חיים אחרים, כי כבר מנוצל בלימוד TETGs כוללים ניו זילנד וארנבים לבנים, כלבים, חולדות, חזירים, כבשים8,9,10,11; רבים מהם יכולים להיות העלות אוסרני וחסרי כימות מקיף שיטות (קרי, ELISAs, נוגדנים אימונוהיסטוכימיה, תחל PCR וכו ') ו/או אפשרויות מהונדס. כך, מודלים בעלי חיים גדול המשמש לעיתים חלשה או אינם מסוגלים לענות על שאלות מכניסטית. השימוש של העכברים הטרנסגניים מודל זה, כמו גם תהליך עיצוב וייצור של שתל פשוטה להפוך אותו אידיאלי ללימודי מהר מכניסטית מסתכלים שתל היצרות epithelialization מחדש. השתלת orthotopic בשימוש במודל זה TETG מספק את התועלת של השתל חשופים לסביבה החיצונית ואת היכולת למדוד פוטנציאל התמיינות תאים אפיתל. עם זאת, חשוב לזכור את התרגום של מחקרים הטרנסגניים דגמי חיות גדולות, ניסויים קליניים יכול להיות קשה. יתר על כן, בעוד המודל העכבר הזה עלולה להיות עלות יותר אפקטיבי להגדיל את גודל האוכלוסייה, כיום אין את אותן קליניים לאבחון היכולות כמו מודלים בעלי חיים גדולים יותר (קרי, ברונכוסקופיה עם אנדוסקופי התערבויות) שהופך אותו מאתגר כדי להשוות בין תוצאות.
העבודה עם מודל זה יתרכז חוקרים תא אופטימלית לתנאי זריעה (סוג התא, צפיפות, וכו ') ותפקידו היצרות שתל המגביל, שיפור epithelialization. עיצוב לגרדום היא גם משתנה חשוב, שיש לו השפעות משמעותיות על להשתיל ביצועים ויוו , ידרוש יותר לחקירה ולביטול לגרדום אופטימלית חומר מיקרו. מחקרים אלה יסייעו התרגום של TETGs מודלים בעלי חיים גדולים, ניסויים קליניים בבני בסופו של דבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
