シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植
Summary
グラフト狭窄組織気道交換に重大な障害を引き起こします。狭窄症の基になる細胞のメカニズムを調べるためには、エンジニア リング組織シード骨髄単核細胞 (BM MNC) で代用気管のマウスモデルを駆使します。ここでは、私たちプロトコルの足場製造、BM MNC 分離、移植はシード、および注入を詳しく説明します。
Abstract
先天性またはセカンダリ セグメントを長い気管欠損に対する治療の選択肢は、歴史的に機能的な組織を置き換えることができないのため限られています。ティッシュ エンジニア リングは、3 次元足場に細胞シグナリング分子を統合する能力と潜在的なソリューションとして大きい約束を保持します。設計組織気管移植片 (TETGs) と最近の研究は、いくつかの成功を見ているが、その翻訳グラフト狭窄によって制限されており、崩壊を移植し上皮化を延期します。これらの問題を駆動機構を調査するために組織気管移植移植モデルマウスを開発しました。TETGs は、ペットと PU (20: 80% 重量) の混合物のエレクトロスピニング ポリマー ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) を使用して構築されました。足場は、6-8 週から骨髄単核細胞を用いた播種-勾配遠心法によって古い c57bl/6 マウス。移植あたり 1000 万の細胞足場の内腔にシード, 3 番目と 7 番目気管リング間の注入の前に一晩インキュベートする許可。これらのグラフト狭窄所見を要約することが、組織学的解析と蛍光抗体法で 5 ケラチンとケラチン 14 の基底上皮細胞の欠如によって示されるように、上皮化を遅延しました。このモデルは、ホストの改造に関与する細胞および分子メカニズムを調査するためのツールとなります。
Introduction
長いセグメント気管欠陥を完全な気管軟骨輪と気管無形成と同様、外傷、悪性腫瘍、感染症などの稀な先天性の条件として提示できます。大人または小児の気管の長さの 30% で 6 cm を超える場合これらの欠陥は再建術によって処理されません。自家組織、脳死移植、人工気道を置き換える試みは、慢性感染、肉芽、機械の故障、および狭窄症に悩まされています。
設計組織気管移植片 (TETGs) 潜在的生涯免疫抑制療法の必要性を回避しながらこれらの問題に対応できます。過去 10 年間で TETGs は動物モデルでテストし、まれに思いやりの使用1,2,3の臨床的に利用されています。臨床と大規模な動物実験、設計組織気道交換から術後の回復必要戦闘狭窄する多数の介入 (として定義 > 50% の内腔狭小化) し、気道の開存性を維持します。TETG の追加作業は、細胞播種の選択、血管新生と足場設計の役割を評価することによってこの狭窄を削減を求めています。細胞播種選択肢とネイティブの気管の構造・機能の回復を目指した足場設計が主に呼吸の上皮細胞と軟骨細胞の様々 な吸収性、非吸収性、脱足場でシードに注目されています。可能性があります血管新生は、狭窄の開発で主要な役割を果たしている、他のグループは、体外または血行再建術または促進4を促進するために異所性モデルを最適化することに焦点を当てています。それにもかかわらず、課題のまま機械的に有能で機能的な TETG をまた維持しながら成功した血管新生を達成します。最近の進歩にもかかわらず臨床的翻訳に重要な障害のまま狭窄を最小限に抑えることです。
この病理組織学的応答 TETG 注入体内を調べるため、組織代用気管の羊モデルを開発しました。移植された混合ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) エレクトロスピニング足場骨髄単核細胞 (BM 多国籍企業) のシードで構成されます。この小さなコホートでシード自家 BM-多国籍企業が再上皮化を加速し、狭窄5を遅延を行った。自己改善 BM 多国籍企業生存の播種が、BM 多国籍企業は、機能 neotissue の形成を調節する細胞のメカニズムは不明のまま。
組織のマウスモデルの細胞レベル必要な発達に関する研究には、気管が設計されています。羊の研究と同様に、我々 は BM とシード PET:PU エレクトロスピニング足場を活用-多国籍企業羊モデル、TETG 狭窄注入1,2,3 に続く最初の 2 週間にわたって開発に一致して。 ,5。これはマウスのモデルがさらに気道狭窄の基になる細胞のメカニズムを調査する私たちを有効にする以前は、観測された病理を締めくくっていることが示唆されました。
本報告では、組織設計足場製造、BM MNC 分離、播種、移植、注入 (図 1図 2) を含むマウス モデルの気管の交換のため、我々 のプロトコルを詳しく説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
設計組織気管マウス モデルの開発は臨床 TETGs; 翻訳が限られている点を理解する上で不可欠であります。すなわち移植崩壊、狭窄と遅延上皮化4.これらの制限に貢献するいくつかの要因には、移植材料、製造プロセス、足場設計および細胞播種プロトコルの選択が含まれます。このモデルは、それらに影響を与える細胞および分子メカニズムを理解するためにこれらの要因?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
グラフィック デザインのロバート ・ ストラウス ・研究情報ソリューション支援全国の小児病院で技術革新部門を認識したいと思います。この作品は、NIH (米国 K08HL138460) からの助成金によって支えられました。
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
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