Summary
グラフト狭窄組織気道交換に重大な障害を引き起こします。狭窄症の基になる細胞のメカニズムを調べるためには、エンジニア リング組織シード骨髄単核細胞 (BM MNC) で代用気管のマウスモデルを駆使します。ここでは、私たちプロトコルの足場製造、BM MNC 分離、移植はシード、および注入を詳しく説明します。
Abstract
先天性またはセカンダリ セグメントを長い気管欠損に対する治療の選択肢は、歴史的に機能的な組織を置き換えることができないのため限られています。ティッシュ エンジニア リングは、3 次元足場に細胞シグナリング分子を統合する能力と潜在的なソリューションとして大きい約束を保持します。設計組織気管移植片 (TETGs) と最近の研究は、いくつかの成功を見ているが、その翻訳グラフト狭窄によって制限されており、崩壊を移植し上皮化を延期します。これらの問題を駆動機構を調査するために組織気管移植移植モデルマウスを開発しました。TETGs は、ペットと PU (20: 80% 重量) の混合物のエレクトロスピニング ポリマー ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) を使用して構築されました。足場は、6-8 週から骨髄単核細胞を用いた播種-勾配遠心法によって古い c57bl/6 マウス。移植あたり 1000 万の細胞足場の内腔にシード, 3 番目と 7 番目気管リング間の注入の前に一晩インキュベートする許可。これらのグラフト狭窄所見を要約することが、組織学的解析と蛍光抗体法で 5 ケラチンとケラチン 14 の基底上皮細胞の欠如によって示されるように、上皮化を遅延しました。このモデルは、ホストの改造に関与する細胞および分子メカニズムを調査するためのツールとなります。
Introduction
長いセグメント気管欠陥を完全な気管軟骨輪と気管無形成と同様、外傷、悪性腫瘍、感染症などの稀な先天性の条件として提示できます。大人または小児の気管の長さの 30% で 6 cm を超える場合これらの欠陥は再建術によって処理されません。自家組織、脳死移植、人工気道を置き換える試みは、慢性感染、肉芽、機械の故障、および狭窄症に悩まされています。
設計組織気管移植片 (TETGs) 潜在的生涯免疫抑制療法の必要性を回避しながらこれらの問題に対応できます。過去 10 年間で TETGs は動物モデルでテストし、まれに思いやりの使用1,2,3の臨床的に利用されています。臨床と大規模な動物実験、設計組織気道交換から術後の回復必要戦闘狭窄する多数の介入 (として定義 > 50% の内腔狭小化) し、気道の開存性を維持します。TETG の追加作業は、細胞播種の選択、血管新生と足場設計の役割を評価することによってこの狭窄を削減を求めています。細胞播種選択肢とネイティブの気管の構造・機能の回復を目指した足場設計が主に呼吸の上皮細胞と軟骨細胞の様々 な吸収性、非吸収性、脱足場でシードに注目されています。可能性があります血管新生は、狭窄の開発で主要な役割を果たしている、他のグループは、体外または血行再建術または促進4を促進するために異所性モデルを最適化することに焦点を当てています。それにもかかわらず、課題のまま機械的に有能で機能的な TETG をまた維持しながら成功した血管新生を達成します。最近の進歩にもかかわらず臨床的翻訳に重要な障害のまま狭窄を最小限に抑えることです。
この病理組織学的応答 TETG 注入体内を調べるため、組織代用気管の羊モデルを開発しました。移植された混合ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) エレクトロスピニング足場骨髄単核細胞 (BM 多国籍企業) のシードで構成されます。この小さなコホートでシード自家 BM-多国籍企業が再上皮化を加速し、狭窄5を遅延を行った。自己改善 BM 多国籍企業生存の播種が、BM 多国籍企業は、機能 neotissue の形成を調節する細胞のメカニズムは不明のまま。
組織のマウスモデルの細胞レベル必要な発達に関する研究には、気管が設計されています。羊の研究と同様に、我々 は BM とシード PET:PU エレクトロスピニング足場を活用-多国籍企業羊モデル、TETG 狭窄注入1,2,3 に続く最初の 2 週間にわたって開発に一致して。 ,5。これはマウスのモデルがさらに気道狭窄の基になる細胞のメカニズムを調査する私たちを有効にする以前は、観測された病理を締めくくっていることが示唆されました。
本報告では、組織設計足場製造、BM MNC 分離、播種、移植、注入 (図 1図 2) を含むマウス モデルの気管の交換のため、我々 のプロトコルを詳しく説明します。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 全国こども病院で承認されています。
1. 足場製造
- による高分子ナノファイバー前駆体溶液を準備: 1) 溶解 8 wt % ペット 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol と 2) 3 wt % PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol 室温で溶解することにより 60 ° c とのソリューションを加熱します。
- 冷却、ペットと PU (20: 80) の最終的なポリマーの混合物を作成するソリューションを結合します。
- PET:PU 液でいっぱい 60 mL の注射器に 20 G 鈍い先端針を利用したステンレス鋼の棒 (直径 1 mm) に PET+ PU ソリューション +14 に高電圧 DC 電源供給セットを使用して針、別の高電圧 DC 電源に kV 供給-3 に設定 Electrospin kV、5 mL/h の流量と 20 cm のヒント-基板距離。繊維堆積時 350 rpm にロッドを回転させます。
- 300 μ m の目的足場壁の厚さが達成されるまでは、エレクトロスピニングを続けます。ロッド、足場をスライドし、任意の残留溶媒を除去するためには一晩を真空下でそれを保持します。
- 注入前に 350 mJ/cm2の紫外線光量を使用して足場を滅菌します。
2. 骨髄由来単核細胞 (BM 多国籍企業) の収穫
- 6-8 週間を安楽死させるケタミン (200 mg/kg)、キシラジン (20 mg/kg) およびケトプロフェン (10 mg/kg) のカクテルが古い、女性、C57BL/6 マウス。尾ピンチによる完全な安楽死をチェックします。安楽死のための地域のガイドラインに従ってください。
- 無菌条件下で大腿骨と脛骨高級はさみおよびアドソン マイクロ鑷子を使用して骨を公開する皮膚を削除します。筋膜や腱を削除するのに・ デュモン #5 鉗子とデュモン #5/45 鉗子を使用します。骨を分離し、両端にそれらのそれぞれをカットします。5 mL シリンジ、25 G 針を使用して、ローズウェル公園記念研究所 (RPMI) メディアの 30 mL を含むペトリ皿の骨髄をフラッシュします。50 mL のチューブに 70 μ m ナイロン携帯こし器を通ってこの RPMI 骨髄をフィルターします。
- 安全キャビネット、polysurcrose、ナトリウム diatrizoate 15 mL チューブに 5 mL を配置します。2 つの層の混合を避けるために管の下側骨髄単核細胞を含む RPMI をそっと追加します。24 ° C で「ブレーキ 1」461 x gで 30 分間遠心
注: 当社の遠心ブレーキ 1 略最長を減速時に時間を実行します。 - 形成された 3 つの層、外 (ピンク) 上層部にプラズマを破棄し、骨髄単核細胞から成る中間 (クリア) 層を収集します。赤血球沈殿を破棄します。
- 24 の ° C のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1:1 の比率で 461 × gで 10 分間遠心する「ブレーキ 9」で骨髄単核細胞 (BM MNC) を希釈します。
- 上澄みを除去し、5 mL の PBS でペレットを希釈します。24 の ° C で「ブレーキ 9」461 x gで 10 分間遠心
- 上澄みを除去し、RPMI 〜 10 mL にペレットを希釈します。
- 0.4% トリパン ブルー 1 mL 管の等しいボリューム BM MNC ソリューションの 10 μ L を希釈します。チェンバー スライドを数える細胞における解の場所 10 μ L。自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。手順を繰り返し、細胞の平均の数を計算します。
注: 1 X 10 の8セルの平均セル数は、2 つのドナー マウスの使用から得られました。これは 2 つの大腿骨に相当するだろうし、骨髄 2 脛骨から分離されます。 - 遠心分離機の 24 ° c. で「ブレーキ 9」と 461 x gで 10 分間で BM MNC ソリューション上澄みを除去し、107セル/移植する細胞濃度を希釈します。
メモ: 我々 がシード 1、10、1 億の細胞間の効率を検討して移植あたり 1000 万の細胞が最高の播種効率を生成することを発見します。
3. 細胞播種、移植
- 足場の長さを測定し、必要な場合、5 mm の長さに切り取ります。
- あらかじめ 5 分削除、RPMI RPMI の 5 μ L で足場を濡れています。
- 10 分の足場の内腔に BM MNC ソリューションの 5 μ L を追加します。
- 移植を 21 G 針を渡し、インキュベーターの 37 ° C で一晩 RPMI の 1000 μ L で移植を孵化させなさい。
4. 移植注入
注: 移植移植手術中の無菌技術を維持するために注意する必要があります。
- シード細胞移植の受信者として 6-8 週齢女性 c57bl/6 マウスを使用します。エンロフロキサシン (10 mg/kg) を皮下 24 h 手術前に、と切開の直前に挿入します。
- マウスの重さし、鎮痛法として腹腔内麻酔薬ケタミン (100 mg/kg)、キシラジン (10 mg/kg) およびケトプロフェン (5 mg/kg) のカクテルの 0.1 mL/10 g の投与量を管理します。
- 尾ピンチによる麻酔の平面が達成されているかどうか確認してください。鎮静のレベルを確認するには、滅菌の眼軟膏を目に適用し、あごから鎖骨に手術部位の毛をクリップします。背臥位でパッドに動物を配置します。最初にポビドン ヨードの準備パッド、アルコール準備パッド (70% アルコール)、続いてもう一度ポビドン ヨード準備パッドを使用する手術部位を消毒します。
- 外科医からその頭を解剖顕微鏡の下で動物を配置します。高級はさみやアドソン マイクロ鑷子の助けを借りて、舌骨鎖骨からまでの正中切開を行います。デュモン #5 とデュモン #7 微細鉗子、自己保持のコリブリ リトラクターを挿入し、必要に応じて滅菌綿棒と一緒に筋膜をきれいに。
- 甲状軟骨、輪状軟骨、気管を公開するデュモン #5 とデュモン #7 微細鉗子でストラップの筋肉 (図 3A) を開きます。にべもなく続く円周方向分離気管食道 (図 3B) から、両側に並列実行している反回神経から気管を区切ります。
- 20 G 針、手術用マーカーを使用して、気管の前方部分を染色します。
- 気管を識別し、第 3 気管軟骨輪の下切開 Vannas テュービンゲン春はさみのペアとデュモン #7 微細鉗子のペアを使用して気管のトランセクトします。良いカーブタイプ鉗子でそれを保持、一時的な気管切開 (図 3C) を作成する 9-0 ナイロン縫合糸の滅菌を使用して胸骨に気管を保護します。注: 使用できる代替縫合材料は気管注入、筋肉 reapproximation の 9-0 PDS です。
- 20 G 針、手術用マーカー汚れの前方部分を表す移植を実行します。
- インプラントの移植、近位後方、近位側を挿入して 9-0 滅菌ナイロン縫合糸 (図 3D) ・ デュモン #7 を使用してその注文の近位前方縫合糸微細鉗子、持針器。
- 外科医から尻尾を配置する動物の 180 ° を回します。一時的な気管切開をリリースします。気管は、切り株として切除の撤回のための使用を許可する不完全離断します。不要になったときは、5 MM の気管セグメントが完全に削除されます。
- 近位吻合術と同様の方法での縫合糸を置くことによって遠位吻合を完了します。
- おおよその再移植位置とストラップの筋肉。実行中のパターンで 9-0 滅菌ナイロン縫合糸を使用して切開を閉じる。
- ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) の 0.1 mL を皮下に注入し、動物回復ケージ、檻の中で他の動物なし加熱パッドの上に配置します。
- 意識であり、及ぶ、柔らかい寝具、しっとり食事 48 h の薬用水 (イブプロフェン、30 mg/kg) と新しいケージへマウスを移動することができるまでは、マウスを観察します。この期間の経過後、マウスを他のマウスと通常ケージに戻ります。
注: 呼吸困難を維持または注入後活性が低下したマウスは 32 ° C の定温器でスタッフが研究室や動物観察されます。この状態が 48 時間以上続く場合、マウスが安楽死する必要があります。
5 組織および免疫組織化学
注: ヘマトキシリンとエオシン汚れによって行われた標準的な技術を使用して全国の子供たちの病院形態コア。よると免疫組織染色を行った、以下の手順を実行します。
- スライドを deparaffinize H2O (dH2O) 5 分の 5 分、2) キシレン 5 分、5 分、5 分の 4) 90% エタノール、5) 70% のエタノールの 5 分の 3) 100% エタノールをキシレン 1) 6) 蒸留します。
- クエン酸バッファー内のスライドを水没、水で満たされた圧力鍋に配置します。10 分間加熱し、室温まで冷まします。0.1% ウシ血清アルブミン (BSA PBS) PBS の dH2o ・ 5 分すすぎ洗浄します。
注: 浴槽にお湯や電子レンジで 15 分加熱を行うもできます。 - 室温で 1 時間 PBS で 3% ヤギ血清とスライドを孵化させなさい。0.1% でよく洗って 5 分間 BSA PBS はケラチンの濃度と一次抗体の孵化 5 (1: 1000)6、ケラチン 14 (1: 250)6 4 ° C で一晩 18 h の F4/80 (1: 100)7
- 0.1% BSA PBS 2 回 10 分の各洗浄で洗ってください。K5/K14 と室温で 1 時間 1: 300 F4/80 の 1: 500 の濃度で適切な二次抗体とインキュベートします。0.1% BSA PBS 2 回 10 分の各洗浄で洗ってください。
- 使用してマウント 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) 取付・ ガラス カバー スリップを含みます。イメージングの前に 30 分間座ることができます。
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Representative Results
TETG 播種および注入の概略図を図 1に示します。骨髄は c57bl/6 マウスから収穫され、の in vitro培養します。BM 多国籍企業は、密度遠心分離によって分離され、シード、TETG に。シードの TETGs は、同系 c57bl/6 受信者マウスに移植されました。
図 2は、製造工程 PET:PU TETG 足場の概要です。PET:PU ソリューションは、300 μ m とルーメン ネイティブ マウスの気管を近似する 1 mm 直径の最終的な TETG の壁の厚さを達成するために 20 G の鈍針にエレクトロスピニングをでした。TETG の表面は、アニメーションの単核細胞の走査型電子顕微鏡画像で見ることができます。
外科的移植手順は、図 3に示されている最も重要なステップで囲まれます。図 3は、分離とストラップの筋肉 (図 3A) の取り消しおよび周囲の組織 (図 3B) から気管の後続の円周方向分離を示しています。図 3Cは、手順中に気道を確保する胸骨切痕への愛着と遠位の一時的な気管切開を示します。最後に、図 3Dは最終的な吻合後の場所で移植を示しています。
小さなコホート研究では、4 つのマウスは TETGs 注入され 2 週間にわたって続きます。図 4A ~ Cに示すように基底細胞ケラチン 5 と 14 の染色のいくつかの基底上皮細胞ことができるいただければ幸いです。合成した画像 (図 4C) では、注入後 7 日目にグラフトの内腔の表面に基底細胞の存在を示しています。
4 匹の動物のうち 3 人は呼吸困難、喘鳴、1 と 7 日に術後早期終了に必要な 2 つの兆候を示した。植と組織学的解析、グラフト狭窄に対する治療は、合併症を引き起こす主な要因として同定されました。図 5A ~ Eは、術後 7 日目動物の狭窄部、TETG のビューを提供します。注、移植とネイティブの気管の伸縮式手技による一般的な発見です。低 (図 5A)、高 (図 5B) 電源, 狭窄部の顕微鏡写真を示して TETG 注入の主な合併症の一つ。図 5Cは F4/80 の代表的な染色狭窄領域におけるホスト マクロファージの存在を明らかです。図 5Dと図 5Eグラフト狭窄部で基底上皮細胞のマーカー ケラチン 5 と 14 が表示再度。
図 1: TETG シードと注入模式。ドナー マウスから得られた骨髄由来単核細胞が密度遠心分離によって分離、足場にシードし、受信者のマウスに移植しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 組織のエレクトロスピニング設計気管移植。(A) 紡糸過程の概要です。(B) 20 G 鈍針マンドレルの回転としてマウス足場の製造に使用します。(C) アニメ足場表面単核のセルを追加した後の SEM の概略。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 足場の外科的移植の概要。(A) 分離とストラップの筋肉の収縮。(B) 気管の組織/臓器を周囲から円周方向分離。(C) 一時的な気管切開と胸骨切痕に添付ファイルの作成。(近位と遠位吻合後 D) 注入移植。スケール バー = 2 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 基底上皮細胞の組織学的証拠。マージされたケラチン 5 とケラチン 14 (B) (A) 基底細胞マーカー ケラチン 5 の蛍光イメージをマージおよびケラチン 14 (C)。矢印は、足場ネイティブ組織接合上皮組織の成長を示します。ルーメンと足場は (*) で示された、(
)、それぞれ。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 狭窄部移植の組織学的可視化。(A) 縦断面 H & E のグラフト吻合部近く遠位部の狭窄を含む気管の長さ。スケール バー = 500 μ m 高出力 H & E (B)、F4/80 (C)、ケラチン 5 (D) およびケラチン 14 (E) を使用して選択した梅干しの画像。スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
設計組織気管マウス モデルの開発は臨床 TETGs; 翻訳が限られている点を理解する上で不可欠であります。すなわち移植崩壊、狭窄と遅延上皮化4.これらの制限に貢献するいくつかの要因には、移植材料、製造プロセス、足場設計および細胞播種プロトコルの選択が含まれます。このモデルは、それらに影響を与える細胞および分子メカニズムを理解するためにこれらの要因の高速評価できます。
我々 がここで示したをグラフト狭窄 (図 5) を要約するモデルの能力と同様に、上皮細胞 (図 4) の存在モデルの使用の成功は注入プロセスの間にいくつかのキーの手順と異なります。まず、初期の切開とマウスの気管の分離の間に損傷を避けるために不可欠または気管食道溝にある隣接する反回神経のストレッチです。ネイティブ気管切除時にもう一つの重要な要因は、気管に後方に座っている食道への損傷を避けるためです。
気管内挿管は、プロシージャの間に空気の流れを許可する一時的な気管切開を作成することによって回避できます。しかし、呼吸を容易にする体腔外気管の維持し同様、一時的な遠位気管をブロックから何か (すなわち、組織) を保つために重要、です。移植伸縮移植で実行した場合の一般的な発生は、組織学的セクションで見られるかもしれない。
ニュージーランド白ウサギ、犬、ラット、ブタ、羊8,9,10,11; TETGs の勉強で利用されている他の動物モデルが含まれます多くはコストにすることができる、包括的な定量方法 (すなわち、Elisa、免疫抗体、PCR のプライマー等) を欠いている形質転換オプションおよび/または。したがって、大動物モデルの使用はパワー不足が多いまたは機械論的質問に答えることができません。簡単な移植の設計と製造プロセスと同様に、このモデルでトランスジェニック マウスの使用では、グラフト狭窄と再上皮化を見て高速解明適しています。この TETG モデルで使用されている同所性同種移植は、潜在的に上皮細胞の分化を測定する能力と外部環境にさらされて移植の利点を提供します。大動物モデルに遺伝子組換え研究の翻訳を覚えていることが重要ですし、臨床試験が難しいことができます。さらに、このマウス モデルことができます潜在的人口サイズを増やすことで費用対効果が、それは現在ありません大きい動物モデル (すなわち、気管支内視鏡でうに同じ臨床診断・治療機能介入) 結果の間で比較を困難に作る。
このモデルで今後の作業は、最適な細胞播種条件 (セルの種類、密度、等) および制限グラフト狭窄に対する治療と改善上皮形成におけるその役割の調査に集中されます。重大な影響のある重要な変数パフォーマンス生体内移植し、最適な足場材料および微細構造についてさらに調査が必要になります足場設計しています。これらの研究は、TETGs の大動物モデルおよび最終的に人間の臨床試験への変換に役立ちます。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
グラフィック デザインのロバート ・ ストラウス ・研究情報ソリューション支援全国の小児病院で技術革新部門を認識したいと思います。この作品は、NIH (米国 K08HL138460) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
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