Summary
Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.
Abstract
Behandlungsmöglichkeiten bei angeborenen oder sekundäre langes Segment trachealen Mängel wurden historisch beschränkt aufgrund einer Unfähigkeit, funktionale Gewebe ersetzen. Gewebetechnik hält großes Versprechen als eine mögliche Lösung mit seiner Fähigkeit, Zellen und Signalmoleküle in eine 3-dimensionale Gerüst zu integrieren. Neuere Arbeiten mit Gewebezüchtungen trachealen Transplantationen (TETGs) hat einige Erfolge gesehen, aber ihre Übersetzung von Transplantat Stenose begrenzt, Transplantat Zusammenbruch und Epithelisierung verzögert. Um die Mechanismen fahren diese Fragen zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell für Gewebezüchtungen trachealen Graft Implantation entwickelt. TETGs wurden unter Verwendung Electrospun Polymere Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU) in einer Mischung aus PET und PU (20: 80 Prozent Gewicht) konstruiert. Gerüste wurden dann ausgesät mit Knochenmark mononukleären Zellen isoliert von 6-8 Wochen-alte C57BL/6 Mäusen durch gradient zentrifugieren. 10 Millionen Zellen pro Graft waren auf das Lumen des Gerüstes ausgesät und erlaubt über Nacht vor der Implantation zwischen dem dritten und siebten trachealen Ringe auszubrüten. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der Stenose zu rekapitulieren und Epithelisierung verzögert, wie histologische Analyse und Mangel an Keratin 5 und Keratin 14 basalen Epithelzellen auf Immunfluoreszenz zeigen. Dieses Modell dient als Instrument für die Untersuchung von zellulärer und molekularer Mechanismen Host Umgestaltung beteiligt.
Introduction
Long-Segment trachealen Mängel können als seltene angeborene Erkrankungen wie komplette trachealen Ringe und trachealen Agenesie sowie Trauma, Bösartigkeit und Infektion darstellen. Bei Überschreitung von 6 cm bei Erwachsenen oder 30 % der trachealen Länge bei Kindern können diese Mängel durch chirurgische Rekonstruktion behandelt werden. Versuche, die Atemwege mit Eigengewebe, cadaveric Transplantationen und künstliche Konstrukte zu ersetzen haben chronische Infektion, Granulation, mechanisches Versagen und Stenose geplagt.
Gewebezüchtungen trachealen Transplantate (TETGs) können möglicherweise diese Probleme anzugehen, unter Vermeidung der Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression. In den letzten zehn Jahren wurden TETGs im Tiermodell getestet und klinisch eingesetzt, in seltenen Fällen von compassionate-Use1,2,3. In sowohl großen als auch klinische Untersuchungen an Tieren, postoperative Erholung von Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz benötigt zahlreiche Interventionen zur Bekämpfung Stenose (definiert als > 50 % luminalen Verengung) und Durchgängigkeit der Atemwege zu erhalten. Zusätzliche TETG Arbeit hat versucht, diese Stenose durch Bewertung der Rolle der Zelle Aussaat Wahl, Vaskularisierung und Gerüst Design zu reduzieren. Zelle seeding Entscheidungen und Gerüst Design zur Wiederherstellung der native Luftröhre Struktur/Funktion haben sich vor allem auf respiratorische Epithelzellen und Chondrozyten auf verschiedenen decellularized, resorbierbaren und nicht resorbierbaren Gerüsten ausgesät konzentriert. Wie Vaskularisierung wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Stenose spielt, haben andere Gruppen fokussiert auf die Optimierung in Vitro oder heterotopisch Modelle Revaskularisation oder Neoangiogenese4zu beschleunigen. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, erfolgreiche Vaskularisierung und gleichzeitig mechanisch kompetent und funktionelle TETG zu erreichen. Trotz der jüngsten Fortschritte bleibt die Minimierung der Stenose eine kritische Hindernis für klinische Übersetzung.
Um diese histopathologische Reaktion auf TETG Implantation in Vivozu untersuchen, haben wir eine Schafe Gewebezüchtungen trachealen Ersatz-Modell entwickelt. Das Transplantat bestand aus einer gemischten Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU)-Electrospun-Gerüst mit dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNU) ausgesät. In dieser kleinen Kohorte haben wir bewiesen, dass gesetzte autologe BM-MNCs Re Epithelisierung beschleunigt und Stenose5 verzögert. Aussaat mit autologen BM-MNCs verbessert überleben, bleibt unklar jedoch der zelluläre Mechanismus durch den BM-MNCs die Bildung von funktionalen Neotissue modulieren.
Untersuchung auf der zellulären Ebene erforderlichen Entwicklung ein Mausmodell des Gewebes entwickelt trachealen Ersatz. Ähnlich wie bei den Schafen Studie, wir nutzten ein PET:PU Electrospun Gerüst ausgesät mit BM-MNCs. in Übereinstimmung mit den Schafen Modell TETG Stenose entwickelt im Laufe der ersten zwei Wochen nach Implantation1,2,3 ,5. Dies suggeriert, dass das Mausmodell die Pathologie zuvor beobachtet es uns ermöglicht, weiter die zellulären Mechanismen, die Atemwege Stenose Verhören zusammengefaßt.
In diesem Bericht beschreiben wir unser Protokoll für Tissue Engineering trachealen Ersatz im Mausmodell einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation (Abbildung 1, Abbildung 2).
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am bundesweiten Kinderkrankenhaus genehmigt.
(1) Gerüst Herstellung
- Vorbereiten eine Polymerlösung Nanofaser Vorläufer von: (1) Auflösung 8 Gew.-% PET in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol und Heizlösung auf 60 ° C und durch 2) auflösen 3 Gew.-% PU in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol bei Raumtemperatur.
- Sobald Sie abgekühlt, kombinieren Sie die Lösungen um eine endgültige Polymer-Mischung aus PET und PU (20: 80) zu erstellen.
- Electrospin die PET+ PU-Lösung auf einem Stab aus rostfreiem Stahl (Durchmesser 1 mm) unter Verwendung einer 20 G stumpfe Spitze Nadel auf eine 60 mL-Spritze gefüllt mit der PET:PU-Lösung mit einem Hochspannungs-DC Power Supply Satz bis + 14 kV auf der Nadel, ein weiterer Hochspannungs-Gleichstrom liefern auf-3 kV , eine 5 mL/h Durchflussmenge und Tipp-Substrat 20 cm Abstand. Drehen Sie die Rute bei 350 u/min während der Abscheidung der Faser.
- Elektrospinnen weiter, bis die gewünschte Gerüst Wandstärke von 300 µm erreicht ist. Schieben Sie das Gerüst aus der Rute, dann halten sie unter Vakuum über Nacht, restliche Lösungsmittel zu entfernen.
- Das Gerüst mit einer ultravioletten Licht Dosierung von 350 mJ/cm2 vor der Implantation zu sterilisieren.
(2) dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNC) Ernte
- Einschläfern ein 6-8 Wochen alt, Weiblich, C57BL/6 Maus mit einem Cocktail von Ketoprofen (10 mg/kg), Ketamin (200 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg). Suchen Sie komplette Euthanasie von Heck-Pinch-Methode. Achten Sie darauf, lokale Richtlinien für die Sterbehilfe.
- Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Haut über den Oberschenkelknochen und Schienbeine, Knochen mit feinen Schere und Micro-Adson Pinzette verfügbar zu machen. Verwenden Sie Dumont Nr. 5 Zangen und Pinzetten Dumont Nr. 5/45, die Faszie und die Sehnen entfernen. Trennen Sie die Knochen zu und schneiden Sie jeder von ihnen an den beiden Enden. Mit einer 5 mL Spritze und Nadel 25G, spülen Sie das Knochenmark in einer Petrischale mit 30 mL eine Park Memorial Institute (RPMI) Medien. Filtern Sie diese RPMI mit Knochenmark durch eine 70 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.
- Legen Sie in einem Schrank Biosafety 5 mL Polysurcrose und Natrium-Diatrizoate in der 15 mL Tube. Fügen Sie sanft die RPMI Knochenmark mononukleären Zellen auf der Seite des Rohres, um zu vermeiden, Mischen der beiden Schichten. Zentrifuge bei 461 X g für 30 min mit "Bremse 1" bei 24 ° C.
Hinweis: Auf unserer Zentrifuge laufen Bremse 1 steht für die längste Zeit während der Verzögerung. - Verwerfen Sie aus den drei Schichten gebildet die oberste (rosa) Schicht des Plasmas und sammeln Sie die Mittelschicht (klare), bestehend aus dem Knochenmark mononukleären Zellen zu. Entsorgen Sie die Ausfällung von roten Blutkörperchen.
- Verdünnen Sie die Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem Verhältnis 1:1 und Zentrifuge bei 461 X g für 10 min mit "Bremse 9" bei 24 ° C.
- Den Überstand zu entfernen und das Pellet mit 5 mL PBS verdünnen. Zentrifuge bei 461 X g für 10 min mit "Bremse 9" bei 24 ° C.
- Den Überstand zu entfernen und das Pellet mit ~ 10 mL RPMI verdünnen.
- Verdünnen Sie 10 µL der BM-MNC-Lösung mit einem gleichen Volumen 0,4 % Trypan blau in einer 1-mL-Tube. Platz 10 µL der Lösung in einer Zelle zählen Kammer Folie. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Wiederholen Sie den Schritt und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen.
Hinweis: Die Verwendung von zwei Spender Mäusen wurde eine durchschnittliche Zellzahl von 1 X 10-8 -Zellen entnommen. Dies wäre gleichbedeutend mit zwei Oberschenkelknochen und zwei Schienbeine, die Knochen Knochenmark von isoliert ist. - Zentrifugieren Sie die BM-MNC-Lösung bei 461 X g für 10 min. mit "Bremse 9" bei 24 ° C. Den Überstand zu entfernen und die Zellkonzentration, 107 Zellen/Transplantat verdünnen.
Hinweis: Wir haben Aussaat Effizienz zwischen 1, 10 und 100 Millionen Zellen untersucht und festgestellt, dass 10 Millionen Zellen pro Graft ergibt die höchste Effizienz der Aussaat.
3. Zelle Aussaat auf die Transplantate
- Messen Sie die Länge der Gerüste und wenn nötig, schneiden Sie sie auf eine Länge von 5 mm.
- Vornässen Sie das Gerüst mit 5 µL RPMI für 5 min. entfernen die RPMI.
- Das Lumen des Gerüstes für 10 min 5 µL der BM-MNC-Lösung hinzufügen.
- Führen Sie eine Nadel 21G durch das Lumen des Transplantats und inkubieren Sie das Transplantat in 1000 µL RPMI über Nacht bei 37 ° C in einem Inkubator.
(4) Graft Implantation
Hinweis: In der Graft-Implantation aseptischen Technik weiterhin sollte darauf geachtet werden.
- Verwenden Sie 6-8 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen als Empfänger für die Zelltransplantation ausgesät. Enrofloxacin (10mg/kg) subkutan 24 h vor der Operation und unmittelbar vor Schnitt zu injizieren.
- Wiegen die Maus und Verwalten einer 0,1 mL/10 g-Dosis von der Narkose Cocktail Ketoprofen (5 mg/kg), Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) als Analgesie intraperitoneal.
- Überprüfen Sie, ob das Flugzeug der Anästhesie von Heck-Pinch-Methode erreicht worden ist. Bestätigung der Höhe der Sedierung, gelten eine sterile ophthalmologische Salbe für die Augen und die Haare an der Operationsstelle vom Kinn, Schlüsselbeine clip. Legen Sie das Tier auf ein Pad in einem Liegerad Rückenlage. Desinfizieren der Operationsstelle zunächst mit einer Povidon-Jod Prep Pad, gefolgt von einer Prep Alkoholtupfer (70 % Alkohol), und einmal mehr eine Povidon-Jod Prep Pad.
- Legen Sie das Tier unter dem sezierenden Mikroskop mit seinem Kopf entfernt der Chirurg. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt von den Schlüsselbeinen bis hin zu Zungenbeins mit Hilfe von feinen Schere und Micro-Adson Pinzette. Reinigen Sie die Faszie mit Dumont Nr. 5 und Dumont #7 feine Pinzette, zusammen mit einem sterilen Wattetupfer, wenn nötig, und fügen Sie einen selbsthaltenden Colibri-Retraktor.
- Öffnen Sie die Gurt Muskeln(Abbildung 3)mit Dumont #5 und #7 Dumont feine Pinzette, setzen die Schilddrüse Knorpel, Ringknorpel Knorpel und der Luftröhre. Unverblümt trennen Sie die Luftröhre von der wiederkehrenden Kehlkopfnerven laufen parallel auf beiden Seiten, gefolgt von umlaufenden Trennung der Luftröhre vom Ösophagus (Abb. 3B).
- Mit einem 20G Nadel und chirurgische Marker, Flecken Sie auf den vorderen Teil der Luftröhre.
- Die Luftröhre zu identifizieren und einen Einschnitt unter dem dritten trachealen Knorpel-Ring und Transekt der Luftröhre mit Vannas-Tübingen Frühjahr Schere und ein paar feine Pinzette Dumont Nr. 7. Halten es mit der feinen gebogenen Pinzette, sichern der distalen Luftröhre, das Brustbein mit sterilen 9-0-Nylon-Naht erstellen Sie eine temporäre Tracheostomie (Abb. 3C). Hinweis: Eine alternative Nahtmaterial, das verwendet werden kann ist der 9-0 PDS für trachealen Implantation und Muskel Wiederannäherung.
- Färben Sie mit einer 20G-Nadel und eine chirurgische Marker das Transplantat um den vorderen Teil darzustellen.
- Implantation der Prothese einsetzen der proximalen-Posterior, proximal Lateral und proximalen vorderen Nähte, in dieser Reihenfolge mit 9-0 sterile Nylon Naht (Abbildung 3D), Dumont #7 feinen Pinzette und einem Nadelhalter.
- Drehen Sie die tierischen 180° um seine Rute entfernt der Chirurg zu platzieren. Lassen Sie die temporäre Tracheostomie. Die distale Luftröhre ist unvollständig durchtrennten um die Verwendung des Segments resezierten als einem Baumstumpf auf Widerruf zu ermöglichen. Wenn nicht mehr benötigt, ist das 5 MM Luftröhre Segment vollständig entfernt.
- Füllen Sie die distale Anastomose, indem man die Fäden in ähnlicher Weise wie die proximale Anastomose.
- Wieder annähernd die Transplantat-Position und das Gurtband Muskeln. Schließen Sie den Schnitt mit 9-0 sterile Nylon Fäden in einem laufenden Muster.
- Injizieren Sie 0,1 mL von Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zu und legen Sie das Tier in einem Recovery-Käfig auf ein Heizkissen ohne andere Tiere in den Käfig gesetzt.
- Beobachten Sie die Maus, bis es ist bewusst und in der Lage, ambulate, dann übertragen Sie die Maus zu einem neuen Käfig mit weichen Betten, feucht Chow und heilkräftige Wasser (Ibuprofen, 30 mg/kg) für 48 h. Nach dieser Zeit die Maus zurück zu einem normalen Käfig mit anderen Mäusen.
Hinweis: Die Mäuse, die Atemnot zu erhalten oder verringerte Aktivität nach der Implantation werden von Laborstudien und/oder Tier Personal in einem Inkubator 32 ° C beobachtet. Wenn dies für mehr als 48 Stunden anhält, sollte die Mäuse eingeschläfert werden.
5. Histologie und Immunhistochemie
Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Flecken wurden mit Standardtechnik durch bundesweit Kinder Krankenhaus Morphologie Kern durchgeführt. Immunohistochemistry erfolgte entsprechend der unten aufgeführten Schritte.
- Die Folien deparaffinize H2O (dH2O) für 5 min mit Xylol (1) für 5 min, 2) Xylol für 5 min, 3) 100 % Ethanol für 5 min, 4) 90 % Ethanol für 5 min, 5) 70 % Ethanol für 5 min, 6) destilliert.
- Tauchen Sie die Folien in Citrat-Puffer und in Wasser gefüllten Topf legen. Hitze für 10 Minuten dann auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. Waschen Sie mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA-PBS) PBS für 5 min. Spülen mit dH2O.
Hinweis: Heizung kann auch mit einem heißen Wasserbad oder Mikrowelle für 15 min erfolgen. - Inkubieren Sie die Folien mit 3 % normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen mit 0,1 % BSA-PBS für 5 min. inkubieren im primären Antikörper mit Konzentrationen für Keratin 5 (1: 1000)6, Keratin 14 (1: 250)6 und F4/80 (1: 100)7 18 h über Nacht bei 4 ° C.
- Mit 0,1 % BSA-PBS zweimal für 10 min jeweils waschen waschen. Mit entsprechenden Sekundärantikörper in Konzentration von 1: 500 für K5/K14 und 1: 300 F4/80 für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit 0,1 % BSA-PBS zweimal für 10 min jeweils waschen waschen.
- Halterung mit 4', 6-Diamidino-2-Phenolindole (DAPI) mit Montage Medien und Glas Deckel rutscht. Für 30 min vor Bildgebung sitzen lassen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des TETG Aussaat und Implantation. Knochenmark von Mäusen C57BL/6 geerntet wurde und in Vitrokultiviert. BM-MNCs wurden durch Dichte Zentrifugierung isoliert und auf den TETG ausgesät. Kernigen TETGs wurden in einem Phänomen C57BL/6 Empfänger Maus implantiert.
Abbildung 2 zeigt eine Übersicht über die PET:PU TETG Gerüst Herstellungsverfahren. PET:PU Lösung war Electrospun auf einer stumpfen Nadel 20 G zur Erreichung eine endgültigen TETG Wandstärke von 300 µm und Lumen Durchmesser von 1 mm, die native Maus Luftröhre anzugleichen. Die Oberfläche der TETG kann im Raster-Elektronenmikroskop-Bild mit animierten mononukleären Zellen gesehen werden.
Der chirurgische Implantation ist mit den wichtigsten Schritten gezeigt in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Trennung und Retraktion der Gurt Muskeln(Abbildung 3)und umlaufende isoliert von der Luftröhre aus den umliegenden Geweben (Abbildung 3B). Abbildung 3 C zeigt die distalen temporäre Tracheostomie mit Befestigung an der sternalen Kerbe um patent Atemwege während des Verfahrens zu gewährleisten. Schließlich zeigt Abbildung 3D das Transplantat im Ort nach der endgültigen Anastomosen.
In einer kleinen Kohortenstudie wurden vier Mäuse mit TETGs implantiert und über einen Zeitraum von zwei Wochen verfolgt. Ein paar basalen Epithelzellen können in Basalzellkarzinom Keratin 5 und 14 Färbung dargestellt in Abbildung 4A-Cgewürdigt werden. Das kombinierte Bild (Abbildung 4C) zeigt die Anwesenheit von Basalzellen an der luminalen Oberfläche des Transplantats 7 Tage nach der Implantation.
Drei von den vier Tieren zeigte Anzeichen von Atemnot und Stridor, von denen zwei vorzeitigen Beendigung an den postoperativen Tagen 1 und 7 erforderlich. Bei der Explantation und histologische Analyse wurde als der wichtigste Faktor für die Komplikationen Graft Stenose identifiziert. Abbildung 5 A-E gibt einen Überblick über das post-operativen Tag 7 Tier Herzklappenprothese Region der TETG. Der Hinweis ist Teleskopieren des Transplantats und native Luftröhre ein häufiger Befund aufgrund Operationstechnik. Die niedrig (Abb. 5A) und hoch (Abb. 5B) angetrieben Mikrophotographie der Stenose zeigt eine der wichtigsten Komplikationen der TETG Implantation. Abbildung 5 C ist eine repräsentative F4/80 Fleck enthüllt die Anwesenheit von Host Makrophagen in der Herzklappenprothese Region. Abbildung 5 D und Abbildung 5E zeigen wieder die basalen Epithelzelle Marker Keratin 5 und 14 an der Herzklappenprothese Region des Transplantats.
Abbildung 1 : TETG Aussaat und Implantation schematische. Knochenmark abgeleitet Mononukleäre Zellen aus einer Spender-Maus wurden durch Dichte Zentrifugierung isoliert, auf ein Gerüst entkernt und in einem Empfänger Maus implantiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Elektrospinnen des Gewebes entwickelt trachealen Transplantat. (A) Überblick über Elektrospinnen Prozess. (B) 20 G stumpfen Nadel verwendet als rotierende Dorn Maus Gerüste herzustellen. (C) animierte SEM schematische Gerüst Oberfläche nach Mononukleäre Zellen hinzugefügt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Übersicht der chirurgischen Implantation von Gerüst. (A) Trennung und Retraktion der Gurt Muskeln. (B) umlaufende Trennung der Luftröhre aus den umliegenden Gewebe/Organe. (C) Erstellung von temporären Tracheostoma und Verbundenheit mit der sternalen Kerbe. (D) implantierten Prothese nach proximalen und distalen Anastomosen. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Histologischen Nachweis der basalen Epithelzellen. Immunfluoreszenz Bild der basalen Zelle Marker Keratin 5 (A) und Keratin 14 (B) und das zusammengeführte Keratin 5 zusammengeführt und Keratin 14 (C). Der Pfeil kennzeichnet Epithelgewebe Wachstum an der Kreuzung der Gerüst-Native Gewebe. Lumen und Gerüst mit (*) gekennzeichnet sind und (
), beziehungsweise. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Histologische Visualisierung der Herzklappenprothese Region des Transplantats. (A) längs geschnitten, H & E Länge der Luftröhre einschließlich Transplantat mit distalen Stenose in der Nähe der Anastomose. Maßstabsleiste = 500 µm. Hochleistungs-Bilder der ausgewählten Herzklappenprothese Region mit H & E (B), F4/80 (C), Keratin 5 (D) und Keratin 14 (E). Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Entwicklung von einem Maus-Modell für Gewebezüchtungen Tracheas ist wesentlich für das Verständnis der Faktoren, die klinische Übersetzung von der TETGs begrenzt haben; nämlich Transplantat Zusammenbruch, Stenose und verzögerte Epithelisierung4. Ein paar Faktoren, die zu diesen Einschränkungen zählen Transplantat Materialauswahl, den Herstellungsprozess, Gerüst Design und Zelle Aussaat Protokolle. Dieses Modell ermöglicht eine schnellere Auswertung dieser Faktoren Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die sie betreffen.
Wir haben hier gezeigt, das Vorhandensein von Epithelzellen (Abbildung 4) sowie die Fähigkeit des Modells zu rekapitulieren Transplantat Stenose (Abbildung 5); erfolgreichen Einsatz des Modells hängt jedoch ein paar wichtige Schritte bei der Implantation. Erstens ist es im ersten Schnitt und Isolierung der Maus Luftröhre, wesentlich zur Vermeidung von Verletzungen oder Dehnung von den angrenzenden wiederkehrende Kehlkopfnerven befindet sich in der tracheoesophageal Nut. Ein weiterer wichtiger Faktor während der Resektion der native Luftröhre ist eine Schädigung der Speiseröhre sitzen nach der Luftröhre zu vermeiden.
Endotracheale Intubation kann vermieden werden, indem man eine temporäre Tracheostomie um Luftstrom während des Verfahrens zu ermöglichen. Es ist jedoch wichtig, nichts (d. h. Gewebe) verhindern, blockieren die temporäre distalen Tracheostoma sowie die Aufrechterhaltung der Luftröhre außerhalb der Körperhöhle, die Atmung zu erleichtern. Teleskop-Prothese ist ein gemeinsames Auftreten in Transplantat Implantationen und auf histologischen Abschnitten gesehen werden kann.
Anderen Tiermodellen, die verwendet worden sein, bei der Untersuchung TETGs gehören Neuseeland weiße Kaninchen, Hunde, Ratten, Schweine und Schafe8,9,10,11; viele davon können kostenintensiv und fehlen umfassende Quantifizierungsmethoden (z.B. Elisa, Immunohistochemistry Antikörper, PCR-Primer, etc.) und/oder transgenen Optionen. So große Tiermodelle verwendet sind oft zu schwach oder sind keine mechanistische Fragen beantworten. Die Verwendung von transgenen Mäusen in dieses Modell sowie die unkomplizierte Transplantat Konstruktion und Fertigung machen es ideal für schneller mechanistische Studien Transplantat Stenose und erneute Epithelisierung betrachten. Die orthotopen Transplantation verwendet in diesem TETG Modell bietet den Vorteil des Transplantats ausgesetzt der äußeren Umgebung und die Fähigkeit, potentiell epithelialen Zell-Differenzierung zu messen. Aber es ist wichtig zu erinnern, diese Übersetzung von transgenen Untersuchungen zur großen Tiermodellen und klinische Studien können schwierig sein. Darüber hinaus während dieses Mausmodell möglicherweise kostengünstiger in zunehmender Bevölkerungsgröße sein kann, hat es derzeit die gleichen klinischen diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten wie in größeren Tiermodellen (d.h., Bronchoskopie mit endoskopischen keinen Interventionen) machen es schwierig, um zwischen Ergebnissen zu vergleichen.
Zukünftige Arbeit mit diesem Modell konzentriert sich auf die Untersuchung von Aussaat Bedingungen optimale Zelle (Zelltyp, Dichte, etc.) und ihre Rolle in begrenzenden Transplantat Stenose und Verbesserung Epithelisierung. Gerüst-Design ist auch eine wichtige Variable, die erhebliche Auswirkungen auf Leistung in Vivo Transplantat und erfordert weitere Untersuchungen hinsichtlich der optimalen Gerüst Material und Mikrostruktur. Diese Studien werden in der Übersetzung von TETGs große Tiermodelle und schließlich menschliche klinische Studien unterstützen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir würden gerne Robert Strouse und die Forschung Information Solutions & Innovationen Division bei Nationwide Children Hospital für ihre Unterstützung in Grafik-Design zu erkennen. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der NIH (NHLBI K08HL138460) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
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