Summary
تضيق الفساد يشكل عقبة حاسمة في استبدال الأنسجة المهندسة مجرى الهواء. للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق، نستخدم نموذج موريني لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى مع الخلايا وحيدات النوى المبذورة نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات). هنا، نحن التفصيل لدينا البروتوكول، بما في ذلك تصنيع السقالة BM-الشركات متعددة الجنسيات العزلة والبذر الاختلاس، وغرس.
Abstract
خيارات العلاج للعيوب الخلقية أو الثانوي قطعة طويلة الرغامى تاريخيا محدودة بسبب عدم قدرة على استبدال أنسجة وظيفية. هندسة الأنسجة يحمل وعدا كبيرا كحل محتمل مع قدرته على دمج الخلايا والجزيئات الإشارات في سقالة ثلاثي الأبعاد. عمل مؤخرا مع ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) وقد شهد بعض النجاح ولكن ترجمتها كان محدودا بالاختلاس تضيق graft انهيار وتأخر ابيثيلياليزيشن. من أجل التحقيق في آليات القيادة في هذه القضايا، قمنا بتطوير نموذج ماوس لزرع الأنسجة المهندسة الاختلاس الرغامى. وشيدت تيتجس باستخدام اليكتروسبون البوليمرات البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان (PU) في خليط من الحيوانات الأليفة والبلوتونيوم (20:80 نسبة الوزن). كانت تبذر السقالات ثم استخدام خلايا النخاع وحيدات النوى معزولة من الأسبوع 6-8-الفئران C57BL/6 القديم بالتدرج في استخدام الطرد المركزي. 10 مليون من الخلايا الواحدة والاختلاس المصنفة على التجويف السقالة ويسمح لاحتضان بين عشية وضحاها قبل غرس بين الحلقات الثالثة والسابعة الرغامى. كانت قادرة على تلخيص نتائج تضيق هذه الطعوم وتأخر ابيثيلياليزيشن كما يتبين من التحليل النسيجي ونقص الكيراتين 5 و 14 الكيراتين القاعدية الخلايا الظهارية في الفلورة. هذا النموذج سيكون بمثابة أداة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تشارك في استضافة يعيد البناء.
Introduction
يمكن أن يقدم العيوب الرغامى طويل-الجزء كالشروط الخلقية النادرة مثل حلقات القصبة الهوائية كاملة و agenesis الرغامى، فضلا عن الصدمات النفسية، وخبيثة والعدوى. عندما يتجاوز 6 سم في 30% من طول القصبة الهوائية في الأطفال أو الكبار، لا يمكن أن تعامل هذه العيوب التعمير الجراحية. محاولات لاستبدال مجرى الهواء بنسيج ذاتي وزرع المأخوذة بنيات مصطنعة ابتليت بعدوى مزمنة وتحبيب والاعطال الميكانيكية، وتضيق.
ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) يمكن أن يحتمل أن تعالج هذه المشاكل مع تجنب الحاجة للكبت المناعي مدى الحياة. في العقد الماضي، تم اختبارها في نماذج حيوانية وتستخدم سريرياً في حالات نادرة من استخدام الرأفة1،،من23تيتجس. في الدراسات الحيوانية السريرية والكبيرة على حد سواء، يتطلب الشفاء بعد العمليات الجراحية من الأنسجة المهندسة مجرى الهواء استبدال العديد من التدخلات لمكافحة تضيق (يعرف > تضييق لومينال 50%)، والحفاظ على مجرى الهواء سالكيه. عمل إضافي تيتج سعت إلى تخفيض هذا التضيق من خلال تقييم دور خلية بذر خيار والأوعية الدموية وتصميم سقالة. خلية بذر الخيارات وتصميم سقالة تهدف إلى استعادة هيكل/الدالة الأصلية القصبة الهوائية تركزت أساسا على الخلايا الظهارية التنفسية و chondrocytes المصنف على السقالات ريسوربابل وغير ريسوربابل وديسيلولاريزيد المختلفة. كما الأوعية الدموية المحتمل يلعب دوراً رئيسيا في التنمية لتضيق، ركزت المجموعات الأخرى على النحو الأمثل في المختبر أو نماذج هيتيروتوبيك للتعجيل بعودة التوعي أو نيوانجيوجينيسيس4. ومع ذلك، تحقيق الأوعية الدموية الناجحة مع أيضا الحفاظ على تيتج ميكانيكيا المختصة والفنية لا يزال يشكل تحديا. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تقليل تضيق يظل عقبة حاسمة لترجمة السريرية.
للتحقيق في هذه الاستجابة نسيجية إلى تيتج غرس في فيفو، قمنا بتطوير نموذج الأغنام لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى. وتألفت الاختلاس مختلطة البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان سقالة اليكتروسبون (PU) المصنف مع الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظم (بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات). في هذا الفوج الصغيرة، أظهرنا أن BM ذاتي المبذورة-الشركات المتعددة الجنسيات التعجيل بإعادة ابيثيلياليزيشن وتأخر تضيق5. على الرغم من أن البذر مع بقاء BM-الشركات المتعددة الجنسيات تحسين ذاتي، الآلية الخلوية التي تعدل BM-الشركات المتعددة الجنسيات تشكيل نيوتيسوي الوظيفية لا يزال غير واضح.
التحقيق بشأن وضع نموذج مورين من الأنسجة المطلوبة المستوى الخلوية المهندسة استبدال القصبة الهوائية. مماثلة للدراسة الأغنام، علينا الاستفادة من سقالة اليكتروسبون PET:PU المصنف مع بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات-تمشيا مع النموذج الأغنام، وتضيق تيتج نمواً على مدى الأسبوعين الأولين بعد غرس1،2،3 ،5. هذا يشير إلى أن نموذج مورين لخص الباثولوجيا لوحظ سابقا، مما مكننا من مواصلة استجواب الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق مجرى الهواء.
في هذا التقرير، نحن التفصيل لدينا بروتوكول لهندسة الأنسجة استبدال القصبة الهوائية في طراز الماوس بما في ذلك تصنيع السقالة والعزلة BM-الشركات متعددة الجنسيات والاختلاس بذر وغرس (الشكل 1و الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مستشفى "الأطفال على الصعيد الوطني".
1-سقالة التصنيع
- إعداد حل بوليمر سلائف نانوفيبير من: 1) حل 8 wt % الحيوانات الأليفة في 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورويسوبروبانول، وتدفئة الحل إلى 60 درجة مئوية وب 2) يذوب و 3% بو في 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورويسوبروبانول في درجة حرارة الغرفة.
- عندما يبرد، الجمع بين الحلول لخلق خليط بوليمر نهائي من الحيوانات الأليفة والبلوتونيوم (20:80).
- اليكتروسبين محلول PET+ بو على قضيب من فولاذ المقاوم للصدأ (1 مم) استخدام إبرة نصيحة كليلة 20 غراما في 60 مل حقنه مليئة بالحل PET:PU استخدام مجموعة إمدادات طاقة العاصمة الفولت عالي إلى + 14 كيلوفولت في الإبرة، الطاقة DC الفولت العالي آخر توريد مجموعة إلى-3 كيلو فولت ، بمعدل تدفق 5 مل/ساعة، وعلى مسافة 20 سم تلميح إلى الركيزة. قم بتدوير قضيب 350 لفة في الدقيقة خلال ترسب الألياف.
- تستمر اليكتروسبينينج حتى يتحقق سمك الجدار سقالة المرجوة من 300 ميكرون. الشريحة السقالة قبالة القضيب، ثم أنه عقد تحت الفراغ بين عشية وضحاها إزالة أي المذيبات المتبقية.
- تعقيم سقالة استخدام جرعة خفيفة الأشعة فوق البنفسجية من 350 مللي جول/سم2 قبل غرس.
2-حصاد الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات)
- Euthanize من 6-8 أسابيع الماوس القديمة، أنثى، C57BL/6 مع مزيج من الكيتامين (200 مغ/كغ)، إكسيلازيني (20 مغ/كغ) وكيتوبروفين (10 مغ/كغ). البحث عن القتل الرحيم كاملة بأسلوب قرصه الذيل. تأكد من اتباع مبادئ توجيهية محلية للقتل الرحيم.
- تحت ظروف معقمة، إزالة الجلد على قصبة وتيبياس لفضح العظام باستخدام مقص جيد والملقط الصغير-أدزون. استخدام الملقط دومون #5 والملقط دومون #5/45 لإزالة اللفافة والاوتار. فصل العظام وقطع كل واحد منهم على كلا طرفي. استخدام المحاقن 5 مل وابرة ز 25، تدفق نخاع العظام في طبق بتري يحتوي على 30 مل من معهد ميموريال بارك Rosewell (ربمي) وسائل الإعلام. تصفية هذا ربمي مع نخاع العظام عن طريق 70 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة في أنبوب 50 مل.
- في خزانة السلامة الأحيائية، ضع 5 مل دياتريزواتي بوليسوركروسي والصوديوم في أنبوب 15 مل. إضافة ربمي التي تحتوي على خلايا نخاع العظام وحيدات النوى أسفل الجانب من الأنبوب لتفادي الخلط بين الطبقتين بلطف. أجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 30 دقيقة مع "الفرامل 1" في 24 درجة مئوية.
ملاحظة: على لدينا أجهزة الطرد المركزي، تشغيل الفرامل 1 يقف لأطول وقت خلال التباطؤ. - من أصل ثلاث طبقات تشكلت، تجاهل الطبقة العليا (الوردي) من البلازما وجمع الطبقة الوسطى (واضحة) تتكون من الخلايا وحيدات النوى نخاع العظام. تجاهل متسرعا خلايا الدم الحمراء.
- تمييع الخلايا وحيدات النوى نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 1:1 وأجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع الفرامل "9" في 24 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وتمييع بيليه مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع "الفرامل 9" في 24 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وتمييع بيليه مع ~ 10 مل ربمي.
- تمييع 10 ميليلتر من الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات مع حجم متساوية من 0.4% تريبان الأزرق في أنبوب 1 مل. المكان 10 ميليلتر من الحل في خلية العد الشريحة الدائرة. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية. كرر الخطوة وحساب متوسط عدد الخلايا.
ملاحظة: تم الحصول على حصيلة متوسط خلية من الخلايا 1 × 108 من استخدام اثنين من الفئران المانحين. هذا سيكون معادلاً لقصبة اثنين، وهما تيبياس أن نخاع العظام معزولة من. - الطرد المركزي الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع "الفرامل 9" في 24 درجة مئوية. إزالة المادة طافية وتخفف من تركيز خلية إلى خلايا7 10/الاختلاس.
ملاحظة: لقد درس البذر الكفاءة بين 1 و 10 و 100 مليون من الخلايا ووجد أن الخلايا 10 مليون كل الابتزاز غلة أعلى كفاءة بذر.
3-خلية البذر في الطعوم
- قياس أطوال السقالات وإذا لزم الأمر، قطع منها بطول 5 ملم.
- قبل الرطب السقالة مع 5 ميليلتر من ربمي لأدنى 5 إزالة ربمي.
- إضافة 5 ميليلتر من الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات إلى التجويف سقالة لمدة 10 دقائق.
- تمرير إبرة ز 21 من خلال التجويف الاختلاس واحتضان الفساد في 1000 ميليلتر من ربمي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة.
4-الكسب غير المشروع غرس
ملاحظة: ينبغي الحرص على الحفاظ على تقنية معقمة أثناء إجراء زرع الفساد.
- استخدام الفئران C57BL/6 الإناث البالغ من العمر 6-8 أسبوع كمتلقين ترقيع خلايا المصنف. حقن انروفلوكساسين (10 مغ/كغ) 24 ساعة قبل الجراحة وقبل شق تحت الجلد.
- وزن الماوس وإدارة جرعة 0.1 مل/10 غرام كوكتيل مخدر الكيتامين (100 مغ/كغ)، إكسيلازيني (10 مغ/كغ) وكيتوبروفين (5 مغ/كغ) التسكين إينترابيريتونيلي.
- تحقق إذا كانت طائرة التخدير قد تحقق بالأسلوب قرصه الذيل. في تأكيد مستوى التخدير، تنطبق مرهم العيون عقيمة للعيون وقص الشعر على موقع الجراحية من الذقن إلى ترقوة. ضع الحيوان على لوح في موقف راقد الظهرية. تطهير الموقع الجراحي باستخدام أول وسادة بوفيدون الإعدادية، تليها منصة الإعدادية الكحول (الكحول 70%)، ومرة أخرى منصة الإعدادية بوفيدون.
- وضع الحيوان تحت مجهر تشريح رأسه بعيداً عن الجراح. جعل شق خط الوسط تتراوح ترقوة عظم اللاوي بالمساعدة من غرامة المقص والملقط الصغير-أدزون. تنظيف اللفافة مع دومون #5 والملقط غرامة دومون #7، جنبا إلى جنب مع مسحه القطن معقمة إذا لزم الأمر، وإدراج ضام Colibri الاحتفاظ الذاتي.
- فتح عضلات حزام (الشكل 3أ) مع الملقط غرامة دومون #5 و 7 # دومون للكشف عن غضروف الغدة الدرقية والغضاريف cricoid والقصبة الهوائية. صراحة فصل القصبة الهوائية من أعصاب الحنجرة المتكررة مواز على جانبي، يليه فصل كفافى من القصبة الهوائية من المريء (الشكل 3ب).
- باستخدام إبرة 20 غ وعلامة الجراحية، وصمة عار في الجزء الأمامي من القصبة الهوائية.
- تحديد القصبة الهوائية وجعل شق أدناه الحلقة الثالثة غضروف الرغامى وقطاع القصبة الهوائية باستخدام مقص ربيع فانس-توبنجن وزوج من الملقط غرامة دومون #7. عقد مع الملقط المنحنية الجميلة، تأمين القصبة الهوائية القاصي على القص باستخدام معقم خياطة نايلون 9-0 لإنشاء القصبة الهوائية مؤقتة (الشكل 3ج). ملاحظة: هو مادة خياطة بديلة التي يمكن استخدامها PDS 9-0 لريبروكسيميشن العضلات وزرع القصبة الهوائية.
- مع إبرة 20 غ وعلامة جراحية، وصمة عار الفساد تمثل الجزء الأمامي.
- زرع الفساد إدراج الدانية-الخلفي، الدانية الجانبية وغرامة خيوط الدانية الأمامي، بهذا الترتيب دومون #7 9-0 نايلون معقمة خياطة (الشكل 3د)، باستخدام الملقط وحامل إبرة.
- تشغيل 180° الحيوان مكان ذيله بعيداً عن الجراح. الإفراج عن القصبة الهوائية مؤقتة. القصبة الهوائية القاصي هو غير كامل بحف للسماح باستخدام الجزء ريسيكتيد كَجِذْعِ في تراجع. عندما لم تعد هناك حاجة، يتم إزالة الجزء القصبة الهوائية 5 ملم تماما.
- إكمال ملامسة البعيدة عن طريق وضع في خياطة الجروح بطريقة مماثلة كملامسة الدانية.
- إعادة تقريب موقف الاختلاس وعضلات حزام. إغلاق شق استخدام خيوط النايلون العقيمة 9-0 في نمط قيد تشغيل.
- حقن 0.1 مل البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) تحت الجلد ووضع الحيوان في قفص انتعاش على وسادة تدفئة دون غيرها من الحيوانات في القفص.
- ملاحظة الماوس حتى أنها واعية وقادرة على أمبولاتي، ثم نقل الماوس إلى قفص جديد مع الفراش لينة ورطبة تشاو والماء العلاج (آيبوبروفين، 30 ملغ/كغ) من أجل ح 48. وبعد هذه الفترة الزمنية، العودة الماوس إلى قفص عادي مع الفئران الأخرى.
ملاحظة: الفئران أن الحفاظ على الضائقة التنفسية أو انخفاض النشاط بعد زرع يتم مراقبتها من قبل موظفي المختبر و/أو الحيوانات في حاضنة 32 درجة مئوية. إذا استمرت المشكلة لأكثر من 48 ساعة، وينبغي أن يكون euthanized الفئران.
5-علم الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري
ملاحظة: توضع وويوزين البقع أجريت باستخدام تقنية معيارية من "صميم مورفولوجيا مستشفى" للأطفال على الصعيد الوطني. Immunohistochemistry قد أنجز وفقا للخطوات أدناه.
- ديبارافينيزي الشرائح باستخدام 1) زيلين نفط لمدة 5 دقائق، زيلين نفط 2) لمدة 5 دقائق، 3) 100 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق، الإيثانول 4) 90% لمدة 5 دقائق، الإيثانول 5) 70% لمدة 5 دقائق، 6) المقطر ح2س (dH2س) لمدة 5 دقائق.
- غمر الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت لسترات ووضعه في طنجرة الضغط مملوءة بالمياه. الحرارة لمدة 10 دقائق ثم السماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. غسل مع ألبومين المصل البقري 0.1% في برنامج تلفزيوني (جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقيقة شطف مع dH2o.
ملاحظة: يمكن أن يتم تدفئة أيضا مع حمام الماء الساخن أو الميكروويف لمدة 15 دقيقة. - احتضان الشرائح مع مصل الماعز العادي 3% في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة. أغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5 احتضانها في جسم الأولية مع تركيزات كيراتين 5 (1: 1000)6وكيراتين 14 (1: 250)6 و F4/80 (1: 100)7 لح 18 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقائق كل غسل. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بتركيز 1: 500 K5/K14 ورافعة F4/80 ح 1 في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقائق كل غسل.
- التحميل باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينوليندولي (DAPI) التي تحتوي على كشوف تغطية وسائل الإعلام والزجاج المتصاعدة. السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تخطيطي تيتج بذر وغرس. وكان حصادها من الفئران C57BL/6 نخاع العظام ومثقف في المختبر. BM-الشركات المتعددة الجنسيات كانت معزولة بسبب كثافة استخدام الطرد المركزي والمصنفة على تيتج. تم زرع تيتجس المصنف في ماوس المتلقية C57BL/6 سينجينيك.
الرقم 2 لمحة عامة عن سقالة تيتج PET:PU عملية التصنيع. وكان الحل PET:PU اليكتروسبون على إبرة حادة ز 20 تحقيقا بسمك جدار تيتج نهائي قطرها 300 ميكرومتر والتجويف 1 مم لتقريب الماوس الأصلي القصبة الهوائية. سطح تيتج يتبين في الصورة المسح الإلكتروني المجهري مع الخلايا وحيدات النوى المتحركة.
ويرد الإجراء الجراحي غرس في الشكل 3 مع أهم الخطوات الموضحة. ويبين الشكل 3 بالانفصال وانكماش العضلات حزام (الشكل 3أ) والعزلة كفافى اللاحقة من القصبة الهوائية من المحيطة بالانسجة (الشكل 3ب). الشكل 3 ج يدل القصبة الهوائية المؤقتة القاصي مع المرفقات إلى درجة القصية لضمان البراءة مجرى الهواء أثناء الإجراء. وأخيراً يظهر الشكل 3د الاختلاس في المكان بعد أناستوموسيس النهائي.
في دراسة الأتراب صغيرة، كانت الفئران الأربعة مزروع مع تيتجس واتباعها خلال فترة أسبوعين. يمكن تقدير عدد قليل من الخلايا الظهارية القاعدية في الكيراتين الخلايا القاعدية 5 و 14 تلطيخ هو موضح في الشكل 4أ-ج. وتوضح الصورة مجتمعة (الشكل 4ج) وجود الخلايا القاعدية على سطح لومينال الاختلاس في 7 أيام بعد زرع.
ثلاثة من أصل أربعة الحيوانات أظهرت علامات الضائقة التنفسية والصرير، اثنتان منها يتطلب الإنهاء المبكر في الأيام اللاحقة للعمليات الجراحية 1 و 7. واعتبرت تضيق الابتزاز عند اكسبلانتيشن والتحليل النسيجي، العوامل الرئيسية للمضاعفات. الشكل 5 ألف-هاء يعطي رؤية لمنطقة تيتج ضيق الحيوان بعد العمليات الجراحية يوم 7. من المذكرة، تصغير للابتزاز والقصبة الهوائية الأصلي استنتاج مشترك بسبب تقنية جراحية. منخفض (الشكل 5ألف) وعالية (الشكل 5ب) مدعوم يوضح الصورة المجهرية تضيق من المضاعفات الرئيسية لزرع تيتج. الشكل 5 ج وصمة عار F4/80 ممثل يكشف عن وجود الضامة المضيف في منطقة ضيق. الشكل 5 د و الرقم 5ه ومرة أخرى تبين الكيراتين علامات القاعدية الخلايا الظهارية 5 و 14 في منطقة ضيق الاختلاس.
الشكل 1 : تيتج بذر وغرس التخطيطي. الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظام التي تم الحصول عليها من الجهات مانحة ماوس معزولة بسبب كثافة استخدام الطرد المركزي، والمصنفة على سقالة، ومزروع في ماوس المتلقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : اليكتروسبينينج أنسجة المهندسة الاختلاس القصبة الهوائية. (أ) نظرة عامة على عملية اليكتروسبينينج. (ب) 20 غ إبرة حادة تستخدم مغزل بالتناوب لتصنيع السقالات الماوس. (ج) الرسوم المتحركة SEM التخطيطي للسطح سقالة بعد أن تم إضافة الخلايا وحيدات النوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : لمحة عامة عن زرع جراحية من السقالة. (أ) فصل وسحب عضلات حزام. (ب) فصل كفافى من القصبة الهوائية من المحيطة بالانسجة/الأجهزة. (ج) إقامة مؤقتة في القصبة الهوائية والمرفقات إلى درجة القصية. (د) مزروع الاختلاس بعد أناستوموسيس القريبة والبعيدة. شريط مقياس = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : دليل النسيجي للخلايا الظهارية القاعدية. دمج الصورة الفلورة من الخلايا القاعدية علامات كيراتين 5 (أ) وكيراتين 14 (ب) الكيراتين المدمجة 5 وكيراتين 14 (ج). السهم يشير إلى نمو الأنسجة الظهارية تقاطع أصلي سقالة الأنسجة. تتم الإشارة إلى التجويف والسقالة مع (*) و (
)، على التوالي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التصور نسيجية من المنطقة ضيق من الفساد. (أ) مقطوع طوليا ح & ه من طول القصبة الهوائية بما في ذلك الاختلاس مع تضيق القاصي قرب ملامسة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. عالية الطاقة الصور من منطقة ضيق مختارة باستخدام ح & ه (ب) F4/80 (ج)، كيراتين 5 (د) وكيراتين 14 (ه). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من الضروري تطوير نموذج الماوس للأنسجة المهندسة تراتشيس في فهم العوامل التي حدت من الترجمة السريرية من تيتجس؛ إلا وهي انهيار الاختلاس وتضيق وتأخر ابيثيلياليزيشن4. عدد قليل من العوامل التي تسهم في هذه القيود تشمل اختيار المواد الاختلاس، وعملية التصنيع، وتصميم سقالة وخلية البذر البروتوكولات. هذا النموذج يسمح لتقييم أسرع من هذه العوامل من أجل فهم الآليات الجزيئية والخلوية التي تؤثر عليهم.
وقد أظهرنا هنا وجود الخلايا الظهارية (الشكل 4)، فضلا عن قدرة هذا النموذج على الخص تضيق الاختلاس (الشكل 5)؛ ومع ذلك، الاستخدام الناجح للنموذج الذي يعتمد على بضع خطوات رئيسية أثناء عملية زرع. أولاً، أثناء شق الأولية والعزلة من القصبة الهوائية الماوس، أنها ضرورية لتجنب الإصابة أو تمتد الأعصاب حنجري المتكررة مجاورة تقع في أخدود تراتشيويسوفاجيل. عامل هام آخر خلال بتر من القصبة الهوائية الأصلي لتفادي حدوث أي تلف المريء الجلوس الخلفي إلى القصبة الهوائية.
التنبيب داخل الرغامى يمكن تجنبها عن طريق إنشاء القصبة الهوائية مؤقتة للسماح بتدفق الهواء أثناء الإجراء. ومع ذلك، من المهم أن تبقى أي شيء (أي، الأنسجة) من حظر القصبة الهوائية القاصي المؤقتة، فضلا عن الحفاظ على القصبة الهوائية خارج تجويف الجسم لتسهيل التنفس. تصغير الفساد أمر شائع في توطين الفساد ويمكن أن ينظر إليها في المقاطع النسيجي.
وتشمل النماذج الحيوانية الأخرى التي استخدمت في دراسة تيتجس نيوزيلندا أرانب بيضاء والكلاب والجرذان، والخنازير، والغنم8،9،،من1011؛ والكثير منها يمكن أن تكون تكلفة باهظة وتفتقر إلى أساليب القياس الكمي الشامل (أي، الساس، إيمونوهيستوتشيميستري الأجسام المضادة، [بكر] كبسولة تفجير، إلخ) و/أو الخيارات المعدلة وراثيا. وهكذا، النماذج الحيوانية الكبيرة المستخدمة غالباً ما تكون أضعفت أو غير قادر على الإجابة على الأسئلة آليا. استخدام الفئران المعدلة وراثيا في هذا النموذج، فضلا عن عملية تصميم وتصنيع الفساد واضحة تجعله مثاليا لأسرع آليا إلى دراسات تبحث في تضيق الاختلاس وإعادة ابيثيلياليزيشن. زرع أورثوتوبيك المستخدمة في هذا النموذج تيتج يوفر الاستفادة الاختلاس التعرض للبيئة الخارجية، والقدرة على قياس يحتمل أن تمايز الخلايا الظهارية. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن ترجمة الدراسات المعدلة وراثيا للنماذج الحيوانية الكبيرة والتجارب السريرية يمكن أن يكون صعباً. وعلاوة على ذلك، بينما يمكن أن يكون هذا الطراز الماوس يحتمل أن تكون أكثر فعالية من حيث التكلفة في زيادة حجم السكان، لا يوجد نفس القدرات التشخيصية والعلاجية السريرية كما في نماذج حيوانية أكبر (أي، القصبات بالمنظار التدخلات) مما يجعل صعوبة مقارنة بين النتائج.
العمل مع هذا النموذج في المستقبل ستتركز على التحقيق في ظروف بذر الخلية المثلى (نوع من الخلايا، والكثافة، إلخ) ودورها في تضيق الحد من الفساد وتحسين ابيثيلياليزيشن. تصميم سقالة هو أيضا متغيراً هاما له آثار كبيرة على graft الأداء في فيفو وسوف تتطلب المزيد من التحقيقات بشأن المواد سقالة الأمثل والمجهرية. وستساعد هذه الدراسات في ترجمة تيتجس للنماذج الحيوانية الكبيرة والتجارب السريرية البشرية في نهاية المطاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
نود أن نعترف روبرت Strouse وحلول المعلومات البحثية وشعبة الابتكارات في مستشفى "الأطفال على الصعيد الوطني" لدعمها في تصميم الرسوم البيانية. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (نهلبي K08HL138460).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
