بذر وغرس الاختلاس الرغامى السكروز هندسة الأنسجة في طراز الماوس
Summary
تضيق الفساد يشكل عقبة حاسمة في استبدال الأنسجة المهندسة مجرى الهواء. للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق، نستخدم نموذج موريني لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى مع الخلايا وحيدات النوى المبذورة نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات). هنا، نحن التفصيل لدينا البروتوكول، بما في ذلك تصنيع السقالة BM-الشركات متعددة الجنسيات العزلة والبذر الاختلاس، وغرس.
Abstract
خيارات العلاج للعيوب الخلقية أو الثانوي قطعة طويلة الرغامى تاريخيا محدودة بسبب عدم قدرة على استبدال أنسجة وظيفية. هندسة الأنسجة يحمل وعدا كبيرا كحل محتمل مع قدرته على دمج الخلايا والجزيئات الإشارات في سقالة ثلاثي الأبعاد. عمل مؤخرا مع ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) وقد شهد بعض النجاح ولكن ترجمتها كان محدودا بالاختلاس تضيق graft انهيار وتأخر ابيثيلياليزيشن. من أجل التحقيق في آليات القيادة في هذه القضايا، قمنا بتطوير نموذج ماوس لزرع الأنسجة المهندسة الاختلاس الرغامى. وشيدت تيتجس باستخدام اليكتروسبون البوليمرات البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان (PU) في خليط من الحيوانات الأليفة والبلوتونيوم (20:80 نسبة الوزن). كانت تبذر السقالات ثم استخدام خلايا النخاع وحيدات النوى معزولة من الأسبوع 6-8-الفئران C57BL/6 القديم بالتدرج في استخدام الطرد المركزي. 10 مليون من الخلايا الواحدة والاختلاس المصنفة على التجويف السقالة ويسمح لاحتضان بين عشية وضحاها قبل غرس بين الحلقات الثالثة والسابعة الرغامى. كانت قادرة على تلخيص نتائج تضيق هذه الطعوم وتأخر ابيثيلياليزيشن كما يتبين من التحليل النسيجي ونقص الكيراتين 5 و 14 الكيراتين القاعدية الخلايا الظهارية في الفلورة. هذا النموذج سيكون بمثابة أداة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تشارك في استضافة يعيد البناء.
Introduction
يمكن أن يقدم العيوب الرغامى طويل-الجزء كالشروط الخلقية النادرة مثل حلقات القصبة الهوائية كاملة و agenesis الرغامى، فضلا عن الصدمات النفسية، وخبيثة والعدوى. عندما يتجاوز 6 سم في 30% من طول القصبة الهوائية في الأطفال أو الكبار، لا يمكن أن تعامل هذه العيوب التعمير الجراحية. محاولات لاستبدال مجرى الهواء بنسيج ذاتي وزرع المأخوذة بنيات مصطنعة ابتليت بعدوى مزمنة وتحبيب والاعطال الميكانيكية، وتضيق.
ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) يمكن أن يحتمل أن تعالج هذه المشاكل مع تجنب الحاجة للكبت المناعي مدى الحياة. في العقد الماضي، تم اختبارها في نماذج حيوانية وتستخدم سريرياً في حالات نادرة من استخدام الرأفة1،،من23تيتجس. في الدراسات الحيوانية السريرية والكبيرة على حد سواء، يتطلب الشفاء بعد العمليات الجراحية من الأنسجة المهندسة مجرى الهواء استبدال العديد من التدخلات لمكافحة تضيق (يعرف > تضييق لومينال 50%)، والحفاظ على مجرى الهواء سالكيه. عمل إضافي تيتج سعت إلى تخفيض هذا التضيق من خلال تقييم دور خلية بذر خيار والأوعية الدموية وتصميم سقالة. خلية بذر الخيارات وتصميم سقالة تهدف إلى استعادة هيكل/الدالة الأصلية القصبة الهوائية تركزت أساسا على الخلايا الظهارية التنفسية و chondrocytes المصنف على السقالات ريسوربابل وغير ريسوربابل وديسيلولاريزيد المختلفة. كما الأوعية الدموية المحتمل يلعب دوراً رئيسيا في التنمية لتضيق، ركزت المجموعات الأخرى على النحو الأمثل في المختبر أو نماذج هيتيروتوبيك للتعجيل بعودة التوعي أو نيوانجيوجينيسيس4. ومع ذلك، تحقيق الأوعية الدموية الناجحة مع أيضا الحفاظ على تيتج ميكانيكيا المختصة والفنية لا يزال يشكل تحديا. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تقليل تضيق يظل عقبة حاسمة لترجمة السريرية.
للتحقيق في هذه الاستجابة نسيجية إلى تيتج غرس في فيفو، قمنا بتطوير نموذج الأغنام لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى. وتألفت الاختلاس مختلطة البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان سقالة اليكتروسبون (PU) المصنف مع الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظم (بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات). في هذا الفوج الصغيرة، أظهرنا أن BM ذاتي المبذورة-الشركات المتعددة الجنسيات التعجيل بإعادة ابيثيلياليزيشن وتأخر تضيق5. على الرغم من أن البذر مع بقاء BM-الشركات المتعددة الجنسيات تحسين ذاتي، الآلية الخلوية التي تعدل BM-الشركات المتعددة الجنسيات تشكيل نيوتيسوي الوظيفية لا يزال غير واضح.
التحقيق بشأن وضع نموذج مورين من الأنسجة المطلوبة المستوى الخلوية المهندسة استبدال القصبة الهوائية. مماثلة للدراسة الأغنام، علينا الاستفادة من سقالة اليكتروسبون PET:PU المصنف مع بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات-تمشيا مع النموذج الأغنام، وتضيق تيتج نمواً على مدى الأسبوعين الأولين بعد غرس1،2،3 ،5. هذا يشير إلى أن نموذج مورين لخص الباثولوجيا لوحظ سابقا، مما مكننا من مواصلة استجواب الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق مجرى الهواء.
في هذا التقرير، نحن التفصيل لدينا بروتوكول لهندسة الأنسجة استبدال القصبة الهوائية في طراز الماوس بما في ذلك تصنيع السقالة والعزلة BM-الشركات متعددة الجنسيات والاختلاس بذر وغرس (الشكل 1و الشكل 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
من الضروري تطوير نموذج الماوس للأنسجة المهندسة تراتشيس في فهم العوامل التي حدت من الترجمة السريرية من تيتجس؛ إلا وهي انهيار الاختلاس وتضيق وتأخر ابيثيلياليزيشن4. عدد قليل من العوامل التي تسهم في هذه القيود تشمل اختيار المواد الاختلاس، وعملية التصنيع، وتصميم سقالة وخلية الب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف روبرت Strouse وحلول المعلومات البحثية وشعبة الابتكارات في مستشفى “الأطفال على الصعيد الوطني” لدعمها في تصميم الرسوم البيانية. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (نهلبي K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
