Summary
接枝狭窄是组织工程气道置换术的关键障碍。为了研究狭窄的细胞机制, 我们利用组织工程气管替代种子骨髓单个核细胞 (BM-MNC) 的小鼠模型。在这里, 我们详细介绍了我们的协议, 包括支架制造、BM-MNC 隔离、接枝播种和植入。
Abstract
先天性或继发性长段气管缺损的治疗选择历来有限, 因为无法替换功能性组织。组织工程作为一种潜在的解决方案, 具有很大的希望, 它能够将细胞和信号分子整合到三维支架中。最近的工作与组织工程气管移植 (Ttg) 已经取得了一些成功, 但他们的翻译已受到限制的移植狭窄, 移植物塌陷, 和延迟上皮化。为了研究这些问题的驱动机制, 我们开发了一个组织工程气管移植的小鼠模型。Ttg 是用电纺聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 和聚氨酯 (PU) 在 PET 和 PU (20:80 的重量) 的混合物中构建的。然后用梯度离心法从6-8 龄的 c57bl6 小鼠身上分离出骨髓单个核细胞来播种支架。每个移植细胞被播种到支架的腔上, 并允许在第三和第七个气管环之间植入前孵育一夜。这些移植能够重述狭窄和延迟上皮化的结果, 表现在组织学分析和缺乏角蛋白5和角蛋白14基础上皮细胞的免疫荧光。该模型将作为研究宿主重塑所涉及的细胞和分子机制的工具。
Introduction
长段气管缺损可表现为罕见的先天性疾病, 如完整的气管环和气管形成, 以及创伤, 恶性肿瘤和感染。成人超过6厘米或儿童气管长度的30% 时, 这些缺陷不能通过手术重建来治疗。试图用自体组织、尸体移植和人工结构取代气道的努力一直受到慢性感染、造粒、机械衰竭和狭窄的困扰。
组织工程气管移植 (Ttg) 可以潜在地解决这些问题, 同时避免终身免疫抑制的需要。在过去的十年里, ttg 已经在动物模型中进行了测试, 并在罕见的同情使用1,2,3的情况下临床上得到了应用。在临床和大型动物研究中, 术后从组织工程气道置换术中恢复需要采取多种干预措施, 以对抗狭窄 (定义为 gt;50), 并保持气道通畅。此外, TETG 的工作还试图通过评估细胞播种选择、血管化和支架设计的作用来减少这种狭窄。细胞播种选择和支架设计旨在恢复原生气管结构功能的主要重点是呼吸上皮细胞和在各种可吸收、不可吸收和脱细胞的支架上播种的软骨细胞。由于血管化可能在狭窄的发展中发挥主要作用, 其他群体则专注于优化体外或异位模型, 以加快血运重建或新生血管生成4。然而, 在保持机械能力和功能性的 TETG 的同时实现成功的血管化仍然是一项挑战。尽管最近取得了进展, 但最大限度地减少狭窄仍然是临床翻译的一个关键障碍。
为了研究这种组织病理学对 TETG 植入在体内的反应, 我们开发了组织工程气管置换术的牛模型。接枝由混合聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 和聚氨酯 (PU) 电纺支架组成, 该支架由骨髓衍生的单核细胞 (Bm-mnc) 播种。在这个小队列中, 我们证明了种子自体 Bm-mc 加速再上皮化和延迟狭窄 5.虽然自体 Bm-mnc 播种提高了存活率, 但骨髓-mnc 调节功能新组织形成的细胞机制尚不清楚。
对细胞水平的研究需要开发一个小鼠模型的组织工程气管置换。与牛的研究类似, 我们使用了 pet: pu 电纺脚手架, 用 bm-mnc 播种. 与牛模型一致, ttg 狭窄是在植入后的前两周内发展起来的, 植入 1,2,3 ,5。这表明, 小鼠模型重述了以前观察到的病理, 使我们能够进一步询问气道狭窄背后的细胞机制。
在本报告中, 我们详细介绍了组织工程气管置换在小鼠模型中的协议, 包括支架制造、BM-MNC 隔离、移植物播种和植入 (图 1,图 2)。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了全国儿童医院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。
1. 脚手架制造
- 通过以下方式制备聚合物纳米纤维前体溶液: 1) 在 1, 1, 1, 1, 3, 3, 3, 六氟异丙醇中溶解 8 wt% PET, 并将溶液加热到 60°c, 并在室温下通过 2) 在 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟异丙醇中溶解 3 wt% pu。
- 冷却后, 将溶液结合使用, 形成 pet 和 PU 的最终聚合物混合物 (20:80)。
- 电旋转 PET + PU 解决方案到不锈钢棒 (1 毫米直径) 上使用20G 钝尖针在60毫升注射器上充满 pet: PU 解决方案使用高压直流电源设置为 + 14kv 的针, 另一个高压直流电源设置为-3 kV, 5 mlh 流速, 和20厘米的倾角到基板的距离。在纤维沉积过程中, 以350转/分旋转杆。
- 继续电纺, 直到达到所需的支架壁厚300μm。将脚手架从棒上滑落, 然后将其固定在真空下过夜, 以去除任何残留的溶剂。
- 植入前使用 350 mjcm 2 的紫外线剂量对支架进行消毒.
2. 骨髓源性单个核细胞 (BM-MNC) 采集
- 将6-8 大的雌性, c57bl6 小鼠与氯胺酮 (200 mg/kg)、xylazine (20 mg kg) 和 ketoproen (10 mg kg) 的鸡尾酒一起安乐死。用尾夹紧法检查是否有完全的安乐死。一定要遵循当地的安乐死指南。
- 在无菌条件下, 使用精细剪刀和微型 adson 钳子去除股骨的皮肤和带蒂, 以露出骨骼。使用 Dumont #5 钳子和 Dumont #5/45 钳子切除筋膜和肌腱。把骨头分开, 把每一个骨头的两端都剪掉。使用5毫升注射器和25G 针, 在含有罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基30毫升的培养皿中冲洗骨髓。用骨髓将此 RPMI 通过70μm 尼龙电池过滤器过滤成50毫升管。
- 在生物安全柜中, 将5毫升的聚超和二甲酸钠放入15毫升的管中。轻轻加入含有骨髓单个核细胞的 RPMI, 沿着试管的一侧, 以避免混合两层。在 461 x g的温度下离心 30分钟, 24°c 时使用 "制动 1"。
注: 在我们的离心机上, 制动1代表减速期间最长的运行时间。 - 在形成的三层中, 丢弃血浆的顶层 (粉红色), 收集由骨髓单个核细胞组成的中间层 (透明) 层。丢弃红血球的沉淀。
- 将磷酸盐缓冲盐 (pbs) 中的骨髓单个核细胞 (BM-MNC) 以12:1 的比例稀释, 以 461 x g 的比例稀释离心机 10分钟 , 24°c 时使用 "制动 9"。
- 用5毫升的 PBS 去除上清液, 稀释颗粒。在 461 x g的温度下离心 10分钟, 24°c 时使用 "制动 9"。
- 用 ~ 10 毫升的 RPMI 去除上清液, 稀释颗粒。
- 在 1 mL 管中稀释 BM-MNC 溶液的 10Μl, 其相同体积为0.4% 的色氨蓝色。将溶液的10Μl 放置在细胞计数室滑梯中。使用自动单元格计数器对单元格进行计数。重复此步骤并计算单元格的平均数量。
注: 使用两只供体小鼠平均可获得 1 X 108个细胞。这相当于两个股骨, 和两个组织, 骨髓被分离。 - 以 461 x g离心 BM-MNC 溶液 10分钟, 24°c 时使用 "制动 9"。去除上清液, 将细胞浓度稀释至 107 细胞移植。
注: 我们研究了 1, 1000万和1亿个细胞的播种效率, 发现每一个接枝产生的 1, 000万个细胞的播种效率最高。
3. 在移植物上播种的细胞
- 测量脚手架的长度, 如果需要, 将其切割成5毫米的长度。
- 用 5μl RPMI 预湿脚手架 5分钟. 取出 RPMI。
- 在支架的腔内加入5Μl 的 bm-mnc 溶液, 时间为10分钟。
- 通过移植器的腔传递21g 针, 在37°c 的孵化器中在 1000Μl RPMI 中孵育移植。
4. 植入物
注: 在移植过程中, 应注意保持无菌技术。
- 使用6-8 大的雌性 c57bl6 小鼠作为细胞种子移植的接受者。术前24小时和切口前注射恩罗沙星 (10mg/kg)。
- 称重小鼠, 并以 0.1 mlp 剂量的氯胺酮 (100 mL/10)、xylazine (10mg/kg) 和酮洛芬 (5mgkg) 为镇痛剂, 作为腹腔内的镇痛剂。
- 检查麻醉平面是否通过尾夹紧法实现。在确认镇静水平时, 将无菌的眼药膏涂在眼睛上, 并将手术部位的头发从下巴剪到锁骨。将动物放在背侧卧位的垫子上。首先使用 povidone-iodine 准备垫, 然后使用酒精准备垫 (70% 的酒精), 再使用 povidone-iodine 准备垫对手术部位进行消毒。
- 将动物放在解剖显微镜下, 头部远离外科医生。在精细剪刀和微型 adson 钳的帮助下, 做一个中线切口, 从锁骨到舌骨不等。用 Dumont #5 和 Dumont 清洁筋膜 #7 细钳, 以及无菌棉签 (如果需要), 并插入自固定的 Colibri 牵引器。
- 用 Dumont #5 和 Dumont 打开表带肌肉 (图 3a) #7 精细的钳子, 以暴露甲状腺软骨、环状软骨和气管。将气管与两侧平行运行的喉返神经中模糊分离, 然后从食道周围分离气管 (图 3b)。
- 使用20G 针和手术标记, 弄脏气管的前部。
- 识别气管, 并在第三个气管软骨环下方做一个切口, 并使用一把 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀和一把 Dumont #7 细钳横切气管。用精细的弯曲钳固定它, 使用无菌9-0 尼龙缝合将气管远端固定到胸骨, 以创建一个临时气管造口术 (图 3c)。注: 可用于气管植入和肌肉重绘的替代缝合材料是 9-0 PDS。
- 用20G 针和手术标记, 染色移植物, 以代表前部。
- 植入移植插入近后、近侧和近前缝合线的移植物, 按顺序使用9-0 无菌尼龙缝合线 (图 3d), dumont #7 细钳和针座。
- 转动动物 180°, 使其尾巴远离外科医生。松开临时气管造口术。远端气管被完全横切, 以允许使用切除的段作为一个树桩的收回。当不再需要时, 5 MM 气管段被完全删除。
- 完成远端吻合, 将缝合线放置在类似于近端吻合的方式。
- 重新近似移植位置和表带肌肉。用9-0 无菌尼龙缝合线在跑步模式下关闭切口。
- 皮下注射0.1 毫升丁丙诺非 (0.1 mgskg), 并将动物放置在放在加热垫上的恢复笼中, 而没有其他动物在笼子中。
- 观察鼠标, 直到它是有意识的, 并能够移动, 然后转移到一个新的笼子与柔软的床上用品, 潮湿的食物和药用的水 (布洛芬, 30 mg kg) 48小时。在此时间段后, 将鼠标与其他鼠标返回到正常的笼子。
注: 实验室和动物工作人员在32°c 的孵化器中观察到植入后维持呼吸窘迫或活动减少的小鼠。如果这种情况持续超过 48小时, 那么老鼠就应该被安乐死。
5. 组织学和免疫组化
注: 血液氧西林和 eosin 污渍是使用标准技术进行全国儿童医院形态核心。免疫组织化学是按照以下步骤进行的。
- 使用 1) 二甲苯 5分钟, 2) 二甲苯 5分钟, 3) 100% 乙醇 5分钟, 4) 90% 乙醇 5分钟, 5分钟, 5) 70% 乙醇 5分钟, 6) 蒸馏h2o (dh 2 o)5分钟。
- 将滑块浸入柠檬酸缓冲液中, 放入充水高压锅中。加热 10分钟, 然后冷却到室温。用0.1% 的牛血清白蛋白在 PBS (BSA-PBS) 中清洗 5分钟, 用 Dh2o冲洗。
注: 客人还可以使用热水浴池或微波炉加热15分钟。 - 在室温下, 用3% 正常山羊血清在 PBS 中进行1小时的切片。用 0.1% BSA-PBS 在原代抗体中清洗 5分钟, 其浓度为角蛋白 5 (1:1000)6、角蛋白 14 (1:1000)6和 f4\ 80 (1: 100) 7, 在4°c 过夜 18小时.
- 用 0.1% BSA-PBS 清洗两次, 每次清洗10分钟。在室温下, 用适当的二级抗体在 k这儿 k14 浓度为1:500 和 1:300 fn 80 时, 以1小时的浓度进行培养。用 0.1% BSA-PBS 清洗两次, 每次清洗10分钟。
- 安装使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (DAPI), 包含安装介质和玻璃盖滑块。在成像前允许坐30分钟。
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Representative Results
图 1显示了 tetg 播种和植入的示意图。从 c57bl6 小鼠身上采集骨髓, 并进行体外培养。采用密度离心分离的 Bm-mnc, 并在 TETG 上播种。将选择的 Ttg 植入共形 c57bl6 受体小鼠体内。
图 2是 PET:PU ttag 脚手架制造工艺的概述。PET:PU 溶液电纺到20G 钝针上, 以达到最终 TETG 壁厚300μm 和流明直径1毫米, 以接近本地小鼠气管。在带有动画单核细胞的扫描电子显微镜图像中可以看到 TTG 的表面。
图 3概述了外科植入术, 并显示了最重要的步骤。图 3显示了表带肌肉的分离和收缩 (图 3a) 以及随后从周围组织中分离气管的情况 (图 3b)。图 3C演示远端临时气管造口术, 并附着在胸骨凹槽上, 以确保手术期间的专利气道。最后,图 3d显示了在最后吻合后的接枝位置。
在一项小型队列研究中, 四只小鼠被植入了 Ttg, 并在两周的时间里进行了跟踪。在图 4a-c所示的基底细胞角蛋白5和14染色中可以欣赏到一些基底上皮细胞。合并后的图像 (图 4c) 显示移植物植入后7天内移植物腔表面存在基底细胞。
这4只动物中有3只出现呼吸窘迫和纹状体的迹象, 其中两种需要在术后第1天和第7天提前终止。经解释和组织学分析, 移植狭窄是并发症的主要促成因素。图 5A-e介绍了 tetg 术后第7天动物的狭窄区域。值得注意的是, 由于手术技术的原因, 移植物和原生气管的伸缩性是一个常见的发现。低 (图 5a) 和高 (图 5b) 的狭窄的动力显微镜显示了 tetg 植入的主要并发症之一。图 5C是一种具有代表性的 F4/80 染色, 揭示了狭窄区存在宿主巨噬细胞的情况。图 5D和图 5e 再次显示移植物狭窄区的基底上皮细胞标记角蛋白5和14。
图 1: Teg 播种和植入原理图.通过密度离心分离从供体小鼠身上获得的骨髓单个核细胞, 将其播种到支架上, 并植入受者小鼠体内。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 组织工程气管移植电旋.(A) 电纺工艺概述。(B) 20g 钝针用作旋转心轴制造小鼠支架。(C) 添加单个核细胞后支架表面的动画 sem 原理图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 支架的外科植入概述。(A) 分离和收回表带肌肉。(B) 从周围组织器官的气管周围分离。(C) 建立临时气管造口术并附着在胸骨凹槽上。(D) 近端和远端吻合后植入移植。刻度栏 = 2 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 基底上皮细胞的组织学证据。基部细胞标记角蛋白 5 (a) 和角蛋白 14 (b) 与合并角蛋白5和角蛋白 14 (c) 的免疫荧光图像。箭头表示在支架原生原生组织交界处的上皮组织生长。流明和脚手架分别用 (*) 和 (
) 表示。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 移植狭窄区的组织学可视化.(A) 在吻合附近, 将包括远端狭窄的移植物 & 气管长度的 h e 部分。刻度条 = 500μm. 使用 H & E (b)、F4/80 (c)、角蛋白 5 (d) 和角蛋白 14 (e) 的选定狭窄区域的高功率图像.刻度条 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
开发组织工程气管的小鼠模型对于了解临床翻译限制的因素至关重要;即移植物塌陷、狭窄和延迟上皮化4。造成这些限制的几个因素包括接枝材料的选择、制造工艺、支架设计和细胞播种协议。该模型可以更快地评估这些因素, 以便了解影响它们的细胞和分子机制。
我们在这里展示了上皮细胞的存在 (图 4), 以及模型重述移植狭窄的能力 (图 5);然而, 模型的成功使用取决于植入过程中的几个关键步骤。首先, 在小鼠气管的初始切口和隔离过程中, 必须避免位于气管食管沟槽的邻近喉返神经受伤或伸展。在切除原生气管的另一个重要因素是避免对坐在气管后面的食道造成任何损害。
气管插管可以通过创建一个临时气管造口术来避免在手术过程中的气流。然而, 重要的是要防止任何东西 (即组织) 阻塞暂时的远端气管造口术, 以及保持体腔外的气管, 以方便呼吸。嫁接伸缩是嫁接植入物中常见的现象, 可在组织学部分看到。
其他用于研究 t贩卖 g 的动物模型包括新西兰白兔、狗、老鼠、猪和羊8、9、10、11;其中许多可能成本过高, 缺乏全面的定量方法 (即 Elissa、免疫组织化学抗体、PCR 引物等) 和/或转基因选择。因此, 所使用的大型动物模型往往动力不足或无法回答机械问题。在这个模型中使用转基因小鼠以及简单的移植物设计和制造过程, 使它成为更快的机械研究, 研究移植物狭窄和重新上皮化的理想选择。在这个 TETG 模型中使用的原位移植提供了移植暴露在外部环境和潜在的能力, 以潜在的测量上皮细胞分化的好处。然而, 重要的是要记住, 将转基因研究翻译成大型动物模型和临床试验可能会很困难。此外, 虽然这种小鼠模型在增加人口规模方面可能更具成本效益, 但目前它并不像大型动物模型那样具有相同的临床诊断和治疗能力 (即内窥镜下的支气管镜检查)干预措施), 使其难以比较结果。
该模型的未来工作将侧重于研究最佳的细胞播种条件 (细胞类型、密度等) 及其在限制移植物狭窄和改善上皮化方面的作用。脚手架设计也是一个重要的变量, 对体内的接枝性能有显著影响, 需要对最佳脚手架材料和微观结构进行更多的研究。这些研究将有助于将 Tetg 转化为大型动物模型, 并最终进行人体临床试验。
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Disclosures
提交人声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢罗伯特·斯特鲁斯和全国儿童医院 & 创新部门的研究信息解决方案部门在平面设计方面的支持。这项工作得到了国家卫生研究院 (NHLBI K08HL138460) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
