Трансплантат стенозом критических препятствием в инженерии ткани дыхательных путей замены. Расследовать клеточных механизмов лежащие в основе стенозом, мы используем модель мышиных трахеи замена ткани инженерии с семенами костного мононуклеарных клеток (БМ-MNC). Здесь мы подробно нашего протокола, включая эшафот производство, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации.
Варианты лечения врожденных или вторичные длинные сегмент трахеи дефектов исторически были ограничены из-за неспособности заменить функциональные ткани. Тканевая инженерия открывает большие перспективы как потенциальное решение с его способностью интегрировать клетки и сигнальных молекул в 3-мерной леску. Последние работы с трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) наблюдается некоторый успех, но их перевод было ограничено трансплантата стенозом, прививка крах и задержки эпителизации. С целью изучения механизмов, вождение эти вопросы, мы разработали модель мыши для имплантации трахеи лоскута ткани инженерии. TETGs были построены с использованием electrospun полимеров полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) в смеси ПЭТ и ПУ (вдохновившей % веса). Подмости затем были посеяны, используя мононуклеарных клеток костного мозга, изолированных от 6-8 недели-старых мышей C57BL/6, градиентного центрифугирования. Десять миллионов клеток за графт были посеяны на просвет эшафот и разрешено инкубировать на ночь перед имплантацией между третьей и седьмой трахеи кольца. Эти смогли резюмировать выводы стеноза и задержки эпителизации, как свидетельствует гистологический анализ и отсутствием кератин 5 и 14 кератин базальных клеток эпителия на иммунофлюоресценции. Эта модель будет служить инструментом для исследования клеточном и молекулярном механизмами, задействованными в принимающей ремоделирования.
Лонг сегмент трахеи дефекты можно представить как редких врожденных заболеваний как полный трахеи кольца трахеи агенезия, а также травмы, злокачественности и инфекции. Когда более 6 см в 30% от длины трахеи у детей или взрослых, эти дефекты не могут рассматриваться по хирургической реконструкции. Попытки заменить дыхательных путей с аутологичной ткани, трансплантации трупной и искусственные конструкции были страдает от хронической инфекции, грануляции, механических повреждений и стенозом.
Трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) потенциально может решить эти проблемы избегая необходимость непрерывного иммунодепрессией. В течение последнего десятилетия были протестированы на животных моделях и клинически используется в редких случаях сострадательного использование1,2,3TETGs. В как в клинических, так и в крупных исследованиях на животных, послеоперационное восстановление из ткани инженерии сократимость замены требуются многочисленные мероприятия по борьбе с стеноза (определяется как > 50% Люминал сужения) и поддержание проходимости дыхательных путей. Дополнительная работа TETG стремился уменьшить этот стеноз путем оценки роли ячейки посева выбора, васкуляризации и дизайн эшафот. Высева выбор ячейки и дизайн эшафот, направленных на восстановление родной трахеи структуры/функции главным образом уделялось эпителиальных клеток дыхательных путей и хондроцитов посеян на различных рассасывающимся, не рассасывающимся и decellularized леса. Как васкуляризации вероятно играет важную роль в развитии стенозом, другие группы были сосредоточены на оптимизации в пробирке или heterotopic модели для ускорения реваскуляризации или neoangiogenesis4. Тем не менее достижение успешных васкуляризации, сохраняя при этом механически компетентным и функциональной TETG остается проблемой. Несмотря на недавние успехи минимизации стенозом остается критическим препятствием для клинических перевод.
Расследовать этот гистопатологические ответ TETG имплантации в естественных условиях, мы разработали баранину модель инженерии ткани трахеи замены. Трансплантат состояла из смешанного полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) electrospun леску семенами с костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ-МНК). В этой небольшой когорты мы показали, что посеяны аутологичной BM-МНК ускоренного эпителизация и задержки стенозом5. Хотя заполнение с аутологичной BM-МНК улучшение выживаемости, сотовой механизм, по которому BM-МНК модулировать формирования функциональных neotissue остается неясным.
Расследование на сотовой уровне требуется развитие мышиных модели ткани инженерии трахеи замены. Подобно к изучению баранину, мы использовали PET:PU electrospun леску семенами с БМ-МНК. в соответствии с моделью баранину, TETG стеноза разработаны в течение первых двух недель после имплантации1,2,3 ,5. Это предполагает, что мышиных модель резюмировалась патологии, отмечалось ранее, позволяя нам далее опросить клеточных механизмов лежащие в основе стеноз дыхательных путей.
В настоящем докладе мы подробно наш протокол для ткани инженерии трахеи замена в модель мыши, включая производство эшафот, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации (рис. 1, рис. 2).
Разработка модели мыши для инженерии ткани трахеи имеет важное значение в понимании тех факторов, которые имеют ограниченные клинические перевод TETGs; а именно крах трансплантата, стеноз и задержки эпителизации4. Несколько факторов, которые способствуют эти ограничения вк?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы признать Роберт Strouse и исследований информации решения и инновации отдела Национальная Детская больница для их поддержки в области графического дизайна. Эта работа была поддержана грантом от НИЗ (NHLBI K08HL138460).
0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
1mL Syringe | BD | 309659 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
50cc tube | BD | 352070 | |
Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
Microscope | Leica | M80 | |
Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
PBS | Gibco | 10010-023 | |
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
Petri dish | BD | 353003 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |