Summary

Заполнение и имплантации биосинтетических ткани инженерии трахеи трансплантата в мышиной модели

Published: April 01, 2019
doi:

Summary

Трансплантат стенозом критических препятствием в инженерии ткани дыхательных путей замены. Расследовать клеточных механизмов лежащие в основе стенозом, мы используем модель мышиных трахеи замена ткани инженерии с семенами костного мононуклеарных клеток (БМ-MNC). Здесь мы подробно нашего протокола, включая эшафот производство, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации.

Abstract

Варианты лечения врожденных или вторичные длинные сегмент трахеи дефектов исторически были ограничены из-за неспособности заменить функциональные ткани. Тканевая инженерия открывает большие перспективы как потенциальное решение с его способностью интегрировать клетки и сигнальных молекул в 3-мерной леску. Последние работы с трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) наблюдается некоторый успех, но их перевод было ограничено трансплантата стенозом, прививка крах и задержки эпителизации. С целью изучения механизмов, вождение эти вопросы, мы разработали модель мыши для имплантации трахеи лоскута ткани инженерии. TETGs были построены с использованием electrospun полимеров полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) в смеси ПЭТ и ПУ (вдохновившей % веса). Подмости затем были посеяны, используя мононуклеарных клеток костного мозга, изолированных от 6-8 недели-старых мышей C57BL/6, градиентного центрифугирования. Десять миллионов клеток за графт были посеяны на просвет эшафот и разрешено инкубировать на ночь перед имплантацией между третьей и седьмой трахеи кольца. Эти смогли резюмировать выводы стеноза и задержки эпителизации, как свидетельствует гистологический анализ и отсутствием кератин 5 и 14 кератин базальных клеток эпителия на иммунофлюоресценции. Эта модель будет служить инструментом для исследования клеточном и молекулярном механизмами, задействованными в принимающей ремоделирования.

Introduction

Лонг сегмент трахеи дефекты можно представить как редких врожденных заболеваний как полный трахеи кольца трахеи агенезия, а также травмы, злокачественности и инфекции. Когда более 6 см в 30% от длины трахеи у детей или взрослых, эти дефекты не могут рассматриваться по хирургической реконструкции. Попытки заменить дыхательных путей с аутологичной ткани, трансплантации трупной и искусственные конструкции были страдает от хронической инфекции, грануляции, механических повреждений и стенозом.

Трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) потенциально может решить эти проблемы избегая необходимость непрерывного иммунодепрессией. В течение последнего десятилетия были протестированы на животных моделях и клинически используется в редких случаях сострадательного использование1,2,3TETGs. В как в клинических, так и в крупных исследованиях на животных, послеоперационное восстановление из ткани инженерии сократимость замены требуются многочисленные мероприятия по борьбе с стеноза (определяется как > 50% Люминал сужения) и поддержание проходимости дыхательных путей. Дополнительная работа TETG стремился уменьшить этот стеноз путем оценки роли ячейки посева выбора, васкуляризации и дизайн эшафот. Высева выбор ячейки и дизайн эшафот, направленных на восстановление родной трахеи структуры/функции главным образом уделялось эпителиальных клеток дыхательных путей и хондроцитов посеян на различных рассасывающимся, не рассасывающимся и decellularized леса. Как васкуляризации вероятно играет важную роль в развитии стенозом, другие группы были сосредоточены на оптимизации в пробирке или heterotopic модели для ускорения реваскуляризации или neoangiogenesis4. Тем не менее достижение успешных васкуляризации, сохраняя при этом механически компетентным и функциональной TETG остается проблемой. Несмотря на недавние успехи минимизации стенозом остается критическим препятствием для клинических перевод.

Расследовать этот гистопатологические ответ TETG имплантации в естественных условиях, мы разработали баранину модель инженерии ткани трахеи замены. Трансплантат состояла из смешанного полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) electrospun леску семенами с костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ-МНК). В этой небольшой когорты мы показали, что посеяны аутологичной BM-МНК ускоренного эпителизация и задержки стенозом5. Хотя заполнение с аутологичной BM-МНК улучшение выживаемости, сотовой механизм, по которому BM-МНК модулировать формирования функциональных neotissue остается неясным.

Расследование на сотовой уровне требуется развитие мышиных модели ткани инженерии трахеи замены. Подобно к изучению баранину, мы использовали PET:PU electrospun леску семенами с БМ-МНК. в соответствии с моделью баранину, TETG стеноза разработаны в течение первых двух недель после имплантации1,2,3 ,5. Это предполагает, что мышиных модель резюмировалась патологии, отмечалось ранее, позволяя нам далее опросить клеточных механизмов лежащие в основе стеноз дыхательных путей.

В настоящем докладе мы подробно наш протокол для ткани инженерии трахеи замена в модель мыши, включая производство эшафот, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации (рис. 1, рис. 2).

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в стране детской больнице. 1. эшафот производства Приготовляют раствор полимера нановолокно прекурсоров путем: 1) растворения 8 wt % ПЭТ в 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol и Отопле…

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует схема TETG посева и имплантации. Костный мозг был собран от мышей C57BL/6 и культивировали в пробирке. BM-МНК были изолированы центрифугированием плотности и посеян на TETG. TETGs в сеяный были имплантированы в получателей мышь сингенн?…

Discussion

Разработка модели мыши для инженерии ткани трахеи имеет важное значение в понимании тех факторов, которые имеют ограниченные клинические перевод TETGs; а именно крах трансплантата, стеноз и задержки эпителизации4. Несколько факторов, которые способствуют эти ограничения вк?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы признать Роберт Strouse и исследований информации решения и инновации отдела Национальная Детская больница для их поддержки в области графического дизайна. Эта работа была поддержана грантом от НИЗ (NHLBI K08HL138460).

Materials

0.9% Sodium chloride injection APP Pharmaceuticals NDC 63323-186-10
10cc serological pipet Falcon 357551
18G 1.5in. Needle BD 305190
1mL Syringe BD 309659
24-well plate Corning 3526
25cc serological pipet Falcon 356535
25G 1in. Needle BD 305125
50cc tube BD 352070
Alcohol prep pads Fisher Healthcare NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution Bayer Healthcare, LLC NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0 AROSurgical Instruments Corporation T05A09N10-13
C57BL/6, female Jackson laboratories 664 6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate ThermoFisher 5000
Colibri retractors F.S.T 17000-04
Cotton tipped applicators Fisher scientific 23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody ThermoFisher MA5-11599
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20
Dumont #5/45 forceps F.S.T 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps F.S.T 11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody Bio-Rad MCA497R
Ficoll Sigma 10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt F.S.T 14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses ThermoFisher 12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI Abcam ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 ThermoFisher A-21247
Ibuprofen Precision Dose, Inc NDC 68094-494-59
Iodine prep pads Professional disposables international, Inc. NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified BioLegend 905501
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps F.S.T 11018-12
Microscope Leica M80
Non-woven sponges Covidien 441401
Opthalmic ointment Dechra Veterinary products NDC 17033-211-38
PBS Gibco 10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds Nanofiber solutions Custom ordered
Petri dish BD 353003
RPMI 1640 Medium Gibco 11875-093
TISH Needle Holder/Forceps Micrins MI1540
Trimmer Wahl 9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors F.S.T 15008-08
Warm water recirculator Gaymar TP-700
Xylazine sterile solution Akorn animal health NDC 59399-110-20

References

  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  3. Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
  4. Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
  5. Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
  6. Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
  7. Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
  8. Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
  9. Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
  10. Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
  11. Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wiet, M. G., Dharmadhikari, S., White, A., Reynolds, S. D., Johnson, J., Breuer, C. K., Chiang, T. Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (146), e59173, doi:10.3791/59173 (2019).

View Video