Summary
Single-fiber optagelse er en effektiv elektrofysiologisk teknik, der gælder for de centrale og perifere nervesystemer. Sammen med forberedelsen af intakt DRG med vedlagte iskiasnerven nerve, er mekanismen for lednings svigt undersøgt. Begge protokoller forbedre forståelsen af det perifere nervesystem forhold med smerte.
Abstract
Single-fiber optagelse har været en klassisk og effektiv elektrofysiologisk teknik i løbet af de sidste par årtier på grund af sin specifikke anvendelse for nervefibre i det centrale og perifere nervesystem. Denne metode er især gældende for dorsale root basale ganglier (DRG), som er primære sensoriske neuroner, der udviser en pseudo-unipolær struktur af nerve processer. De mønstre og funktioner i handlings potentialerne bestået langs axoner er skrivbar i disse neuroner. Den nuværende undersøgelse anvender in vivo single-fiber optagelser til at observere lednings svigt af sciatiske nerver i komplet Freunds adjuverende (CFA)-behandlede rotter. Da den underliggende mekanisme ikke kan undersøgt ved hjælp in vivo single-fiber optagelser, patch-clamp-optagelser af DRG neuroner udføres på præparater af intakt DRG med vedlagte iskiasnerven nerve. Disse optagelser afslører en positiv korrelation mellem lednings svigt og den stigende hældning af efter-hyperpolariserings potentialet (AHP) af DRG neuroner i CFA-behandlede dyr. Protokollen for in vivo single fiber-optagelser tillader klassifikation af nervefibre via måling af lednings hastighed og overvågning af unormale forhold i nervefibrene i visse sygdomme. Intakt DRG med påsat perifer nerve giver observation af aktiviteten af DRG neuroner i de fleste fysiologiske forhold. Endegyldigt, single-fiber optagelse kombineret med elektrofysiologisk optagelse af intakte DRG er en effektiv metode til at undersøge rollen som lednings svigt under den analgetiske proces.
Introduction
Den normale overførsel af information langs nervefibre garanterer den normale funktion af nervesystemet. Unormal funktion af nervesystemet afspejles også i den elektriske signaltransmission af nervefibre. For eksempel, graden af demyelinering i centrale demyelinering læsioner kan klassificeres via sammenligning af ændringer i nerveledning hastighed før og efter intervention ansøgning1. Det er svært at intracellulært registrere nervefibre, undtagen i særlige præparater såsom Squid Giant Axon2. Derfor kan elektrofysiologisk aktivitet kun optages via den ekstracellulære optagelse af enkeltfibre. Som en af de klassiske elektrofysiologiske metoder, single-fiber optagelse har en længere historie end andre teknikker. Men, færre elektro fysiologer fatte denne metode på trods af sin omfattende anvendelse. Derfor er en detaljeret introduktion af standardprotokollen for single-fiber optagelse nødvendig for sin passende anvendelse.
Selv om forskellige patch-clamp teknikker har domineret moderne elektrofysiologisk undersøgelse, single-fiber optagelse stadig spiller en uerstattelig rolle i registrering af aktiviteter af nervefibre, især fibre sende perifer fornemmelse med deres sensorisk celle legeme placeret i dorsalrodsganglion (DRG). Fordelen ved at bruge Single-fiber optagelse her er, at in vivo fiber optagelse giver en lang observationsperiode med kapacitet til at registrere reaktioner på naturlige stimuli i prækliniske modeller uden forstyrrelse af det intracellulære miljø3 , 4.
Et stigende antal undersøgelser i løbet af de sidste to årtier har undersøgt komplekse funktioner langs nervefibre5, og lednings svigt, som er defineret som en tilstand af mislykket nerve impuls transmission langs Axon, var til stede i mange forskellige perifere nerver6,7. Tilstedeværelsen af lednings svigt i vores undersøgelse tjente som en iboende selv hæmmende mekanisme til graduering af vedvarende nociceptive input langs C-fibre8. Denne lednings svigt blev signifikant svækket under forhold med hyperalgesi4,9. Derfor, målretning de faktorer, der er involveret i lednings svigt kan repræsentere en ny behandling for neuropatiske smerter. For at observere lednings svigt skal affyrings mønsteret registreres og analyseres på grundlag af sekventielt afladede pigge baseret på single-fiber optagelse.
For grundigt at forstå mekanismen af lednings svigt, er det nødvendigt at identificere transmissions egenskaberne af Axon, eller mere præcist, membran egenskaberne af DRG neuroner, baseret på deres pseudo-unipolar anatomiske egenskaber. Mange tidligere undersøgelser på dette område er blevet udført på dissocierede DRG neuroner10,11, hvilket måske ikke er muligt for undersøgelsen af lednings svigt på grund af to forhindringer. For det første anvendes forskellige mekaniske og kemiske metoder i dissociations processen til gratis DRG neuroner, hvilket kan resultere i usunde celler eller ændre fænotype/egenskaber af neuronerne og forvirre resultaterne. For det andet, de vedlagte perifere nerver er dybest set fjernet, og lednings svigt fænomener er ikke observerbare i disse præparater. Derfor er et præparat af intakt DRG neuroner med en vedhæftet nerve blevet forbedret for at undgå de ovennævnte forhindringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende protokol fulgte vejledningen for Usa's sundhedstjenestes politik vedrørende human pleje og brug af forsøgsdyr, og Udvalget for etik i dyreforsøg under det fjerde militær medicinske universitet godkendte protokollen.
1. dyr
- Dividerer 24 Sprague-Dawley-rotter (4-8 uger gamle) i to grupper. Fremstil komplet Freunds adjuverende (CFA) model ved intraplantar injektion af 100 μL CFA i en gruppe på 14 rotter og en anden gruppe på 10 rotter ved behandling med saltvand.
Bemærk: alle dyrene blev erhvervet fra dyre centeret i det fjerde militær medicinske universitet. Voksne mandlige og kvindelige Sprague-Dawley rotter (150-200 g) blev anvendt til alle procedurer, og rotter blev tilfældigt tildelt bure. To rotter blev anbragt pr. bur under en 12-/12-timers lys/mørk cyklus ved en konstant temperatur (25 ± 1 °C) med fri adgang til mad og vand.
2. in vivo single-fiber optagelse
- Forbered og Desinficer alle kirurgiske instrumenter (skalpel, pincet, oftalmisk saks, skære saks, glas separerende nål, sutur nål, knogle rongeur) før operationen. Forbered 1 L eller 2 L normal Ringer's ekstracellulære opløsning (i mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, Nah2PO4 1,25, glucose 15; pH 7,4 og 305 mosm). Opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Anæstetize rotter. På dag 3 til 7 efter CFA injektion, brug intraperitoneal injektion af en blandet opløsning (1% chloralose og 17% urethan, 5 mL/kg legemsvægt) at holde dyrene i en stabil æstetisk tilstand under forsøget. Påfør supplerende injektion af anæstetika, hvis det er nødvendigt, efter kontrol af eleverne og reaktionen på smerte stimulation. Overvåg og vedligehold en kropstemperatur i nærheden af 37 °C.
-
Eksponering af iskiasnerven nerve stammen til optagelse
- Skær åbne huden og musklen på rygdelen af låret. Udfør en stump dissektion langs femorale biceps. Isoler forsigtigt iskiasnerven nerve stammen ved hjælp af oftalmisk saks og en glas separations nål. Opbevar vævet vådt ved hjælp af Ringer's Solution.
- Fastgør dyret på en hjemmelavet metalbøjle (3 cm lang, 2 mm bred metalbøjle med en jern wire 1 mm i diameter) via syning af huden ind i åbningen omkring den. Træk huden lidt op for at etablere et flydende bad.
- Udsæt 1 cm iskiasnerven nerve stammen på den proximale side. Placer en lille brun platform under nerve stammen for at øge kontrasten og observere den fine nerve stammen tydeligt. Opvarm flydende paraffin i et vandbad til 37 °C og slip det på toppen af nerve stammen for at forhindre tørring af overfladen af fibrene. Fjern Pia mater spinalis og dura mater omkring iskiasnerven nerve.
-
Optagelse session
- Vælg en platin filament (29 μm i diameter) som optagelses elektrode. Varme over for lettere støbning, og skabe en lille krog i slutningen. Fastgør elektroden til en micromanipulator for at flytte elektroden efter behov.
- I badet placeres en referenceelektrode i tilstødende subkutane væv. Opdel spinal dura og Pia mater. Adskil iskiasnerven-nerven i en enkelt fiber (15-20 μm i diameter) i optagelses puljen. Derefter afhente en fin fascicle af Axon og suspendere den proksimale ende af Axon på krogen af optagelsen elektrode under et stereoskop ved 25x forstørrelse.
Bemærk: De Just-dissekerede filamenter har tendens til at være tykkere og kræver yderligere adskillelse, indtil en enkelt enhed kan optages. - Identificer det modtagelig felt af en enkelt nociceptive C-fiber ved hjælp af en mekanisk stimulus (von Frey hår) og termisk stimulus (lille bomuld kugle med 50-55 °C vand). Kort, hvis fyring af nerve fiber reagerer på de mekaniske stimuli og varmt vand, så Overvej det som en polymodal nociceptive C-fiber4. Dernæst indsættes to nåle stimulus-elektroder (2 mm interval) ind i huden på det identificerede felt til levering af elektriske stimuli.
- Vis bølgeform af et aktionspotentiale på oscilloskop og ansætte en computer a/D Board med en signal sampling sats på 20 kHz at forstærke og registrere pigge.
- Indsamle data ved hjælp af dataindsamling software (tabel over materialer). Gem data på en computer, og analysér senere med professionel software (tabel over materialer).
3. måling af lednings svigt
- Levere de gentagne elektriske stimuli (0,8 MS varighed, 1.5 x tærskel intensitet) i forskellige frekvenser (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) til en C-fiber for 60 s4,8,9. Tillad en 10 minutters interval for fiber til at slappe af mellem stimuli. Beregn forholdet mellem antallet af svigt i antallet af leverede gentagne stimulus impulser og multipliceres med 100% for at opnå graden af lednings svigt.
4. klargøring af Iintakt DRG fastgjort med Sciatic nerve
- Forbered kirurgiske værktøjer og Ringer's ekstracellulære opløsning som beskrevet i trin 2,1.
- Adskil DRG med den vedlagte iskiasnerven nerve.
- Anæstetize rotterne som beskrevet i trin 2,2 (på dag 3 til 7 efter CFA injektion). Skær håret på ryg og ben med skære saks, og sterilisere huden med tinktur af jod.
- Ved DRG-eksponering skal du først klippe huden ud fra midterlinjen i ryggen på L4-til L5-segmentniveau. Fjern muskler, processen med rygsøjlen, hvirvel Board, og tværgående proces ved hjælp af en knogle rongeur at udsætte rygmarven og DRG krop. Dæk den udsatte rygmarv og DRG med Cottons infiltreret af normal Ringer's ekstracellulære løsning for at opretholde neurale aktivitet. Stop blødningen og Ryd blodet i tide.
- Udsæt iskiasnerven nerve fra to retninger: Fjern L4 til S1 knoglestruktur over vertebrale foramen ved hjælp af oftalmisk saks til at udsætte rygmarvs nerve forbundet til DRG, som er i den proksimale ende af iskiasnerven nerve. Skær åbne huden for at udsætte iskiasnerven nerve i midten af låret. Adskille og frakoble iskiasnerven nerve fra den distale ende af nerven, hvor det går inde i musklen, og ligere nerve stammen med kirurgisk linje i slutningen af nerven før opskæring.
- Adskil iskiasnerven nerve fra det underliggende bindevæv ved hjælp af oftalmisk saks via løft af nerve ligations punktet. Fjern Dura fra rygmarven og adskille DRG fra det underliggende bindevæv via løft dorsalroden, indtil den når den tilstødende del af iskiasnerven nerve. Således isolere hele forberedelsen af DRG med en vedhæftet iskiasnerven nerve.
- Ryd overfladen af DRG.
- Fjern forsigtigt rygmarvs Dura på overfladerne af L4 − L6 DRG ved hjælp af en pincet under et stereoskop ved 4X forstørrelse.
- DRG med vedhæftet iskiasnerven nerve i et glasrør, der indeholder 1 ml blandede enzymer (0,2% proteinase og 0,32% collagenase) og fordøje i et 37 °c vandbad i 15 minutter (slag lidt med en plastik dropper med et interval på 5 min).
- Løft enden af ligations linjen og Flyt præparatet til en skål fyldt med en normal Ringers ekstracellulære opløsning for at skylle enzymet ud. Overfør derefter den Ford øjede DRG til en container (figur 1a) fyldt med iltet ringer's ekstracellulære opløsning til optagelse.
- Optagelse session
- Forbered intracellulær opløsning (i mM: kaliumgluconat 120, KCl 18, MgCl2 2, ethylenglycol-bis (β-amino ethyl ether)-N, N, n ', N'-tetraeddikesyre [EGTA] 5, Hepes 10, na2-ATP 5, na-GTP 0,4, CaCl2 1; pH 7,2 og 300 mosm). Opbevares ved 0 °C indtil brug.
- Stabiliserer ganglier ved hjælp af et skive anker og forbinder nerve enden med en suge-stimulerende elektrode (figur 1a). Visualiser og vælg en DRG neuron med en vand-nedsænkning mål på 40x forstørrelse.
- Træk en elektrode (tabel over materialer) og fyld den med intracellulær opløsning. Indsæt elektroden på holderen, og Påfør et positivt tryk i pipetten med en endelig modstand på 4-7 MΩ.
- Tag elektroden tæt på cellen, og Berør den. Giv et negativt tryk i pipetten, når GΩ tætning er nået, Indstil membranpotentialet på omkring-60 mV og derefter etablere hele-celle optagelse mode.
- Levere gentagne stimuli på 5-50 Hz til iskiasnerven nerve gennem suge elektroden til skærmen for lednings svigt. Mål amplituden af afterhyperpolariserings potentialet (AHP) fra baseline til peak og 80% AHP-varigheden.
Bemærk: Envejs analyse af variansen (ANOVA; for mere end to grupper) eller elevens t-test (for kun to grupper) blev brugt til at analysere dataene. Data præsenteres som middel ± standardfejl af middelværdien (SEM). Det statistiske signifikante niveau blev fastsat til p < 0,05.
- Afslutning af eksperimentet
- Når den eksperimentelle opgave er afsluttet, mens rotterne stadig er under bedøvelses situation, rotter er humant aflives med en intrakardiel injektioner af overdosering pentobarbital natrium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet af Single-fiber optagelse protokol afhænger af kvaliteten af fiber dissektion. Dyret til in vivo forsøg skal være i en god situation for at holde nerve stammen sundt for let dissektion (Se Råd i diskussionsafsnittet). En Drug ansøgning bad er nødvendig i mange tilfælde for Drug levering på fibre. Figur 1 illustrerer, hvordan den in vivo single-fiber optagelse blev opereret (figur 1a) og præsenterer en klassisk optagelse fra iskiasnerven nerve af CFA-behandlede dyr (figur 1b).
Følgende eksperimenter undersøgte forekomsten af lednings svigt i CFA-behandlede dyr. Denne undersøgelse var baseret på den antagelse, at lednings svigt langs de nociceptive C-fibre var et almindeligt fænomen, og graden af lednings svigt blev signifikant svækket under forhold med hyperalgesi, som støttes af vores tidligere undersøgelser4,8,9,12. Figur 2a viser, at der ikke blev observeret C-fiber lednings svigt hos normale dyr. Men graden af lednings svigt blev reduceret betydeligt efter etableringen af CFA-induceret hyperalgesi efter CFA injektion i foden i forhold til kontrol (figur 2b). Disse data viser, at lednings svigt af smerte relevante polymodal nociceptive C-fibre dæmpes i CFA-modellen af inflammatoriske smerter.
For at undersøge den intracellulære mekanisme under lednings svigt blev fremstillingen af intakt DRG med vedhæftet sciatisk nerve anvendt (figur 3a,B). Figur 3c viser, at i stimulus-serien, pigge som reaktion på gentagne stimuli stablet op på den tidligere efter-hyperpolarisering potentiale (Ahp) og resulterede i et fald i den stigende hældning af følgende Ahp (figur 3c,D ). Tilstedeværelsen af Ahp i små DRG neuroner potentielt aktiverer hyperpolarisering-aktiverede, cykliske nukleotid-modulerede (HCN) kanaler13,14,15. Den kumulative virkning af AHP spiller en rolle i forekomsten af lednings svigt. Derfor, vi hypotese, at blokering af HCN kanaler ville betydeligt forbedre lednings svigt effekt. Følgende eksperiment brugte en blokering af HCN-kanaler, ZD7288. Kontinuerlige optagelser afslørede en stigning i lednings svigt i nærværelse af ZD7288 i en koncentrationsafhængig måde. Indsættene viser udvidede spor for de angivne intervaller. En positiv sammenhæng mellem lednings svigt og den stigende hældning af AHP i små DRG neuroner af CFA-behandlede dyr blev observeret (figur 3E).
Figur 1: in vivo single-fiber optagelser af rotte iskiasnerven nerver. A) skematisk diagram over en enkelt fiber optagelse, der angiver de regioner, der skal optages (R) (før opdeling af en glødetråd til optagelse, blev Pia mater spinalis og dura mater fjernet her), Drug ansøgning (D), stimulation (S), og stedet for CFA Injektion. (B) repræsentativ optagelse af en iskiasnerven enkelt fiber udviser en tonic fyring mønster. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.9 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: lednings svigt i CFA-behandlede rotter blev svækket sammenlignet med kontrol rotter. (A) originale fortløbende optagelser af enkelt C-fiber affyringer fra kontrol rotter som reaktion på 10-Hz elektrisk stimulation. Hver 20th Sweep vises (på hinanden følgende fejer var på 2-s intervaller) og vises top-til-bund. Justerings viser et repræsentativt aktionspotentiale. (B) optagelser af enkelt C-fibre fra CFA-injicerede rotter som reaktion på den samme stimulation som i panel A. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: måling af C-fiber lednings svigt med præparater af intakt DRG med vedhæftet iskiasnerven nerve. A) skematisk diagram, der illustrerer opsætningen og placeringen af DRG-præparater. SE: stimulerings elektrode; SN: iskiasnerven nerve; FM: fluorescens mikroskop; RE: optage elektrode. B) hele DRG-prøven observeret under en 40x-visning blev der anvendt en mikroelektrode (højre skygge) til at lappe en lille DRG-neuron. (C) kontinuerlige optagelser af serie fyring svar til 5-Hz stimulation under kontrolbetingelser eller administration af forskellige koncentrationer af ZD7288 i en lille diameter DRG neuron fra CFA-behandlede rotter. Indsættene viser udvidede spor for de angivne optagelses perioder. Mørke pletter repræsenterer Spike fiaskoer. D) repræsentative spor, der anvendes til at måle ahp's stigende hældning. Den stigende hældning var lig med amplitude forskellen mellem maksimum og minimum AHP spændinger (mV) divideret med varighed (interval af stimuli, i sekunder). Det venstre panel illustrerer en større opadgående hældning (fra det første spor i panel C markeret med "*"), og det højre panel viser en mindre opadgående hældning (fra det fjerde spor i panel C markeret med "#") efter ZD7288 applikation (125 μM). E) forholdet mellem graden af lednings svigt og den stigende hældning af AHP som reaktion på forskellige koncentrationer af ZD7288. * og # P < 0,05 vs. Control. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om nylige undersøgelser har opnået calcium-billeddannelse af DRG-neuroner i vivo16, er det fortsat yderst udfordrende at udføre in vivo patch-clamp-optagelse fra individuelle DRG-nociceptorer. Derfor, en in vivo single-fiber tilgang til smerte feltet er af fortsat betydning. Single-fiber optagelse i denne protokol tillader objektiv observation af lednings svigt fænomener, og kombinationen af denne teknik med ex vivo præparat udviklet i den nuværende undersøgelse giver mulighed for undersøgelse af underliggende mekanismer i nociceptor exciterbarhed ændringer i prækliniske modeller. Tre trin i single-fiber optagelses protokollen er afgørende for vellykkede optagelser. For det første er det afgørende at være opmærksom på anæstesi af dyret. I udførlige in vivo-optagelses eksperimenter er længden af den tynde fiber, der er pakket rundt om 29 μm platin elektroden, kun 2-3 mm, hvilket let forstyrres under optagelsesprocessen. Hvis den bedøvelses tilstand ikke er særlig stabil, kan små bevægelser af dyrene føre til registrering af svigt af elektrofysiologiske aktiviteter. For det andet skal præparatet løbende dækkes med paraffin. Formålet med denne manipulation er at opretholde aktiviteten af fibrene. En passende optagelse Slot blev generelt konstrueret ved hjælp af huden af dyr. For at forhindre paraffinolie lækage, kan væggen af slottet styrkes ved hjælp af super lim, og paraffinolie bør tilsættes når det er nødvendigt. Fibrene kan ikke tørre under hele testen. Endelig skal miljøet omkring nerve stammen være sundt vedligeholdt. Der er altid nogle effusion væske til stede omkring optagelsen område, og denne effusion er en hindring for god kvalitet optagelser. Amplituden af fiber aktiviteten vil fortsætte med at falde og i sidste ende blive umulig at skelne fra ekstreme baseline støj, som forårsager en optagelse fiasko. En hjemmelavet sprøjte slange er forpligtet til at nå dybt ind i bunden af slottet for at suge ud effusion væske. Nogle gange er en halv tør bomulds kugle gennemblødt i saltvand også hjælpsom.
I denne undersøgelse, CFA model blev anvendt som producerer mundbetændelse og hyperalgesi efter CFA injektion. For at undersøge egenskaberne af perifer afferent udledning samt de underliggende mekanismer, ingen analgetika blev anvendt i forsøget, som er en rutinemæssig praksis i smerte forskning og er godkendt af IACUC/etiske komité. Den nuværende undersøgelse introducerer en in vivo single-fiber optagelse teknik til at observere ændringer i transmissionsprocessen, der forekommer i nociceptive C-fibre forsynet med gentagne elektriske stimuli. Det blev påvist, at graden af lednings svigt var signifikant svækket i hyperalgesic-forhold, men vi kunne ikke undersøge den underliggende mekanisme ved hjælp af Single-fiber optagelse på grund af tekniske vanskeligheder i patch-fastspænding C-fibre. Derfor blev undersøgelsen af forholdet mellem lednings svigt og ændringer i membranpotentialet i små-diameter DRG neuroner opdaget ved hjælp af tilberedning af intakt DRG med vedlagte iskiasnerven nerve. I stedet for single-fiber optagelse udforsker patch-clamp ved hjælp af sådanne præparater AHP-afhængige mekanismer til produktion af lednings svigt. Ved hjælp af denne protokol, selv om kun et par overflade neuroner kunne vælges, graden af lednings svigt på niveauet af DRG neuroner var stadig i stand til at blive registreret, selv med Drug Administration.
DRG har to ydre membraner: Pia mater spinalis og dura mater. Dura mater skal fjernes ved hjælp af hårfjeder pincet, og Pia mater spinalis skal fordøjes (moderat fordøjelse, ikke som serie som anvendes i isolationen af enkelt DRG celler) for at sikre, at patch-klemme elektroderne kan nå overfladen af DRG celler til dannelse en forsegling; ellers er det umuligt at få patch-clamp optagelser. Den nuværende tilgang mere fuldstændigt bevarer den perifere nerve input i forhold til skiver af DRG plus nerve og sikrer, at patch-clamp optagelse af DRG neuroner er let opnås. Denne protokol har bred anvendelse udsigter til at forbedre forståelsen af det perifere nervesystem vedrørende smerte, såsom undersøgelse af elektrofysiologiske ændringer i forskellige DRG neuroner i forskellige kroniske smerte modeller17 ,18 og molekylære mekanismer, som underliggende unormal spontan aktivitet i DRG med myelinerede eller unmyelerede axoner19,20.
Forberedelsen af intakt DRG med vedhæftet iskiasnerven nerve præsenteret her har mange fordele i forhold til den traditionelle dissocierede ganglion metode, fordi strukturen af DRG forbliver dybest set ubrudt i denne forberedelse. Derfor simulerer det reelle forhold in vivo og giver et foretrukket mikromiljø for fysiologisk aktivitet. Fremstilling af intakt DRG med vedhæftet iskiasnerven nerve producerer mindre neuronal skade end det dissocierede DRG præparat, fordi sidstnævnte proces bruger flere fordøjelsesenzymer og eksterne fysiske handlinger (f. eks, klipning og blæser af cellerne), som forårsager mere skade på cellerne. De fleste elektrofysiologiske undersøgelser udføres stadig på dissocierede DRG neuroner21,22, og dissociations processen selv beskadiger cellerne, hvilket resulterer i unormale hyperexcitationer af neuroner23. En anden fordel ved denne protokol er, at ekstracellulære afferente elektrofysiologiske aktiviteter også opnås, fordi nerve fremskrivningerne forbliver, hvilket muliggør undersøgelser af interaktioner mellem afferente pigge og somatiske DRG spontane Udledninger. Endelig bevarer denne forberedelse DRG neuroner og satellit gliale celler, og kun DRG neuroner forbliver i dissociations protokoller. Satellit gliaceller celler, som er afgørende for at opretholde mikromiljøet i DRG, er en barriere, der beskytter individuelle DRG neuroner24, og disse celler berettiger yderligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Natural Science Foundation i Kina (31671089 og 81470060) og Shaanxi Provincial social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
