Summary
Single-fiber opptak er en effektiv elektrofysiologisk teknikk som gjelder for den sentrale og perifere nervesystemet. Sammen med utarbeidelse av intakt DRG med vedlagte ischias nerven, er mekanismen for Lednings svikt undersøkt. Begge protokollene forbedre forståelsen av perifere nervesystemet forhold til smerte.
Abstract
Single-fiber innspillingen har vært en klassisk og effektiv elektrofysiologisk teknikk de siste ti årene på grunn av sin spesifikke anvendelse for nervefibre i den sentrale og perifere nervesystemet. Denne metoden er spesielt anvendelig på rygg rot ganglia (DRG), som er primære sensoriske neurons som viser en pseudo-Unipolare struktur av nervøse prosesser. Mønstrene og funksjonene i handlingen potensialer gått langs axons er skrivbar i disse neurons. Den nåværende studien bruker in vivo single-fiber innspillinger for å observere Lednings svikt av ischias nerver i fullstendig Freund ' s adjuvant (CFA)-behandlet rotter. Som den underliggende mekanismen ikke kan bli studert ved hjelp av in vivo single-fiber innspillinger, patch-Clamp-innspillinger av DRG neurons utføres på preparater av intakt DRG med vedlagte ischias nerven. Disse opptakene avslører en positiv korrelasjon mellom Lednings svikt og den stigende skråningen av hyperpolarization potensialet (AHP) av DRG neurons i CFA-behandlede dyr. Protokollen for in vivo single fiber-innspillinger gjør at klassifisering av nervefibre via måling av Lednings hastighet og overvåking av unormale forhold i nervefibre i visse sykdommer. Intakt DRG med vedlagt perifer nerve tillater observasjon av aktiviteten til DRG neurons i de fleste fysiologiske forhold. Endelig, Single-fiber opptak kombinert med elektrofysiologisk innspilling av intakt DRGs er en effektiv metode for å undersøke rollen til Lednings svikt under smertestillende prosess.
Introduction
Den normale overføring av informasjon langs nervefibre garanterer normal funksjon av nervesystemet. Unormal funksjon av nervesystemet er også reflektert i det elektriske signalet overføring av nervefibre. For eksempel kan graden av demyelinisering i sentrale demyelinisering lesjoner klassifiseres via sammenligning av endringer i nerve Lednings hastighet før og etter intervensjon søknad1. Det er vanskelig å intracellulært posten nervefibre, bortsett fra i spesielle forberedelser som blekksprut gigantiske axon2. Derfor er elektrofysiologisk aktivitet bare skrivbar via ekstracellulære innspilling av enkelt fibre. Som en av de klassiske elektrofysiologisk metoder, Single-fiber innspillingen har en lengre historie enn andre teknikker. Men færre electrophysiologists fatte denne metoden til tross for sin omfattende anvendelse. Derfor en detaljert innføring av standardprotokollen for single-fiber opptak er nødvendig for det aktuelle programmet.
Selv om ulike patch-Clamp teknikker har dominert moderne elektrofysiologisk studie, Single-fiber innspillingen fortsatt spiller en uerstattelig rolle i innspillingen av aktiviteter av nervefibre, spesielt fibre overfører perifere sensasjon med sine Sensorisk celle kroppen ligger i rygg rot Ganglion (DRG). Fordelen med å bruke single-fiber innspillingen her er at in vivo fiber innspillingen gir en lang observasjon tid med kapasitet til å registrere svar på naturlige stimuli i prekliniske modeller uten forstyrrelse av intracellulære miljø3 , firetil.
Et økende antall studier de siste to ti årene har undersøkt komplekse funksjoner langs nervefibre5, og Lednings svikt, som er definert som en tilstand av mislykket nerve impuls overføring langs axon, var til stede i mange forskjellige perifere nerver6,7. Tilstedeværelsen av Lednings svikt i etterforskningen vår tjente som en iboende selv hemmende mekanisme for modulering av vedvarende nociceptive innspill langs C-fibre8. Denne Lednings svikt ble betydelig svekket under forholdav hyperalgesia. Derfor, rettet mot de faktorene som er involvert i Lednings svikt kan representere en ny behandling for nevropatisk smerte. For å observere Lednings svikt, skal skyte mønsteret bli registrert og analysert på grunnlag av sekvensielt utladet pigger basert på single-fiber opptak.
For å grundig forstå mekanismen for Lednings svikt, er det nødvendig å identifisere overførings egenskapene til axon, eller mer presist, membran egenskapene til DRG neurons, basert på deres pseudo-Unipolare Anatomiske egenskaper. Mange tidligere studier på dette feltet har blitt utført på dissosiert DRG neurons10,11, som kanskje ikke er gjennomførbart for etterforskningen av Lednings svikt på grunn av to hindringer. Først er ulike mekaniske og kjemiske metoder som brukes i dissosiasjon prosessen til gratis DRG neurons, som kan resultere i usunne celler eller endre fenotype/egenskapene til neurons og forvirre funnene. For det andre, de vedlagte perifere nerver er i utgangspunktet fjernet, og Lednings svikt fenomener er ikke synlig i disse forberedelsene. Derfor har en forberedelse av intakt DRG neurons med en vedlagt nerve blitt forbedret for å unngå ovennevnte hindringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende protokollen fulgte guide for USA Public Health Service ' s policy på Human Care og bruk av laboratorium dyr, og komiteen for etikk Animal eksperimenter av den fjerde militære Medical University godkjent protokollen.
1. dyr
- Dividere 24 Sprague-Dawley rotter (4-8 ukens gamle) i to holdene. Tilvirke fullstendig Freund ' adjuvant (CFA) modell av intraplantar injeksjon av 100 μL av CFA inne ettall gruppe av 14 rotter og en annen gruppe av 10 rotter av handling med saltvann.
Merk: alle dyrene ble kjøpt fra Animal Center av fjerde Military Medical University. Voksen mannlig og kvinner Sprague-Dawley rotter (150-200 g) var anvendt by all means prosedyrer, og rotter var tilfeldig bestemt å burene. To rotter var huset per bur under en 12-/12-Hour lyset/mørk syklus med ett bestandig temperatur (25 ± 1 ° c) med ledig adgang å næringen og vann.
2. in vivo single-fiber Recording
- Forbered og desinfisere alle kirurgiske instrumenter (skalpell, pinsett, øye-saks, skjær saks, glass skille nål, Sutur nål, bein rongeur) før kirurgi. Forbered 1 L eller 2 L av normal ringer ' s ekstracellulære løsning (i mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glukose 15; pH 7,4 og 305 mOsm). Oppbevares ved 4 ° c til bruk.
- Bedøve rotter. På dager 3 til 7 etter CFA injeksjon, bruk intraperitoneal injeksjon av en blandet løsning (1% chloralose og 17% polyuretan, 5 mL/kg kroppsvekt) for å holde dyrene i en stabil estetisk tilstand under eksperimentet. Påfør supplerende injeksjon av anestesi, om nødvendig, etter å ha sjekket elevene og responsen på smerte stimulering. Overvåk og Oppretthold en kroppstemperatur nær 37 ° c.
-
Eksponering av ischias nerve stammen for opptak
- Skjær åpne huden og muskelen på rygg delen av låret. Utfør en stump disseksjon langs lår biceps. Nøye isolere ischias nerven stammen ved hjelp av øyen saks og et glass separasjon nål. Holde vevet vått med ringer løsning.
- Fest dyret på en hjemmelaget metall bøyle (3 cm lang, 2 mm bred metall bøyle med en jern ledning 1 mm i diameter) via sy huden inn i sporet rundt den. Trekk huden opp litt slik som å etablere et flytende bad.
- Utsett 1 cm av ischias nerve stammen på proksimale side. Plasser en liten brun plattform under nerve stammen for å forbedre kontrasten og observere den fine nerve stammen tydelig. Varm flytende parafin i et vannbad til 37 ° c og slipp den på toppen av nerve stammen for å hindre tørking av overflaten av fiber. Fjern pia mater spinalis og Dura mater rundt ischias nerven.
-
Innspilling
- Velg en platina filament (29 μm i diameter) som opptaks elektroden. Heat over for enklere støping, og lage en liten krok helt på slutten. Fest elektroden til en micromanipulator for å flytte elektroden etter behov.
- I badekaret, plassere en referanse elektrode i tilstøtende under Huds vev. Split spinal Dura og pia mater. Skill ischias nerven i en enkelt fiber (15-20 μm i diameter) i opptaks bassenget. Deretter plukke opp en fin fascicle av axon og suspendere den proksimale enden av axon på kroken av innspillingen elektroden under en stereoscope ved 25x forstørrelse.
Merk: Det rettferdig-dissekert filamenter har tendens til være tykkere og forlange fremme atskillelse til en enkelt enhet kanskje være registrert. - Identifiser mottakelig felt av en enkelt nociceptive C-fiber ved hjelp av en mekanisk stimulans (von Frey hår) og termisk stimulans (liten bomullsdott med 50-55 ° c vann). Kort, hvis avfyring av nerve fiber svare på mekaniske stimuli og varmt vann, og deretter vurdere det som en polymodal nociceptive C-fiber4. Deretter setter du inn to nål stimulans elektroder (2 mm intervall) inn i huden av det identifiserte feltet for levering av elektriske stimuli.
- Vis bølgeform av en handling potensial på oscilloskop og ansette en datamaskin A/D bord med et signal samplingsfrekvens på 20 kHz for å forsterke og registrere toppene.
- Samle inn data ved hjelp av programvare for datainnhenting (tabell med materialer). Lagre data på en datamaskin og analyser senere med profesjonell programvare (tabell av materialer).
3. måling av Lednings svikt
- Levere repeterende elektriske stimuli (0,8 MS varighet, 1.5 x terskel intensitet) i forskjellige frekvenser (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) til en C-fiber for 60 s4,8,9. Tillat en 10 min intervall for fiber å slappe av mellom stimuli. Beregn forholdet mellom antall feil til antall leverte repeterende stimulans pulser og multiplisere med 100% for å få graden av Lednings svikt.
4. utarbeidelse av Iintact DRG festet med ischias nerven
- Klargjør kirurgiske verktøy og ringe ekstracellulære løsning som beskrevet i trinn 2,1.
- Skill DRG med den vedlagte ischias nerven.
- Bedøve rottene som beskrevet i trinn 2,2 (på dager 3 til 7 etter CFA injeksjon). Skjær håret på ryggen og beinet med skjær saks, og sterilisere huden med anstrøk av jod.
- For DRG-eksponering må du først åpne huden fra midtlinjen på baksiden ved L4 til L5 segmentnivå. Fjern muskler, prosessen med ryggraden, vertebra bord, og tverrgående prosess ved hjelp av et bein rongeur å eksponere ryggmargen og DRG kroppen. Dekk til eksponert ryggmargen og DRG med bomull infiltrere av normal ringer ' s ekstracellulære løsning for å opprettholde nevrale aktivitet. Stopp blødningen og Tøm blodet i tide.
- Utsett ischias nerven fra to retninger: Fjern L4 til S1 beinstruktur over vertebrale foramen ved hjelp av øye-saks for å eksponere spinal nerven koblet til DRG som er på proksimale enden av ischias nerven. Skjær åpne huden for å avdekke ischias nerven på midten lår. Skill og koble ischias nerven fra den andre enden av nerven der den går inne i muskelen, og ombinde nerve stammen med kirurgisk linje på slutten av nerve før klipping.
- Skill ischias nerven fra det underliggende bindevevet ved hjelp av øye sakser via løfting av nerve ligation punktet. Fjern Dura fra ryggmargen og skille DRG fra underliggende bindevev via løfte rygg roten til den når den tilstøtende delen av ischias nerven. Dermed isolere hele utarbeidelsen av DRG med en vedlagt ischias nerven.
- Tøm overflaten på DRG.
- Forsiktig fjerne spinal Dura på overflater av L4 − L6 DRG bruker pinsett under en stereoscope ved 4X forstørrelse.
- Plasser DRG med festet ischias nerven i et glass rør som inneholder 1 mL blandede enzymer (0,2% proteinase og 0,32% kollagenase) og fordøye i en 37 ° c vannbad i 15 min (blås litt med en plast dropper på et intervall på 5 min).
- Løft slutten av ligation linjen og flytte forberedelsene til en tallerken fylt med en normal ringer ' s ekstracellulære løsning for å vaske ut enzymet. Deretter overføre fordøyd DRG til en container (figur 1a) fylt med oksygenert ringer ' s ekstracellulære løsning for opptak.
- Innspilling
- Forbered intracellulære løsning (i mM: kalium gluconate 120, KCl 18, MgCl2 2, etylen glykol-BIS (β-aminoethyl Eter)-N, N, n ', N'-Tetraacetic acid [EGTA] 5, HEPES 10, na2-ATP 5, na-GTP 0,4, CaCl2 1; pH 7,2 og 300 mOsm). Oppbevares ved 0 ° c til bruk.
- Stabilisere ganglia ved hjelp av et stykke anker og koble nerve enden til en suge-stimulerende elektrode (figur 1a). Visualiser og velg en DRG Nevron med en vann-nedsenking mål på 40x forstørrelse.
- Trekk en elektrode (tabell med materialer) og fyll den med intracellulære løsning. Sett elektroden på holderen og påfør positivt trykk i pipette med en endelig motstand på 4-7 MΩ.
- Bring elektroden nær cellen og berør den. Gi et negativt trykk i pipette, når GΩ segl er nådd, sette membranen potensialet på ca-60 mV og deretter etablere hel-celle opptaksmodus.
- Lever repeterende stimuli av 5-50 Hz til ischias nerven gjennom suge elektroden til skjermen for Lednings svikt. Mål amplituden til afterhyperpolarization potensial (AHP) fra Baseline til topp, og 80% AHP varighet.
Merk: Enveis analyse av varians (ANOVA; for mer enn to grupper) eller student t-test (for bare to grupper) ble brukt til å analysere dataene. Data presenteres som betyr ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Det statistiske betydelige nivået ble satt til p < 0,05.
- Avslutte eksperimentet
- Når det eksperimentelle oppgave er ferdig stund rottene er fremdeles under bedøvelse plassering, rotter er humant euthanized med en intrakardielle injeksjoner av overdose pentobarbital Sodium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utfallet av single-fiber opptaks protokoll avhenger av kvaliteten på fiber disseksjon. Dyret for in vivo eksperimenter må være i en god situasjon for å holde nerve stammen frisk for enkel disseksjon (se råd i diskusjonen delen). Et medikament søknad bad er nødvendig i mange tilfeller for narkotika levering på fibre. Figur 1 illustrerer hvordan in vivo single-fiber innspillingen ble operert (figur 1a) og presenterer en klassisk innspilling fra ischias nerven av CFA-behandlede dyr (figur 1B).
Følgende eksperimenter undersøkte eksistensen av Lednings svikt i CFA-behandlede dyr. Denne undersøkelsen var basert på antagelsen om at Lednings svikt langs nociceptive C-fibre var et vanlig fenomen, og graden av Lednings svikt ble signifikant svekket under forhold med hyperalgesia, som støttes av våre forrige studier4,8,9,12. Figur 2a viser at C-fiber Lednings svikt ble observert hos normale dyr. Imidlertid ble graden av Lednings svikt redusert betydelig etter opprettelsen av CFA-indusert hyperalgesia etter CFA injeksjon i foten i forhold til kontroll (figur 2b). Disse dataene viser at Lednings svikt av smerte-relevant polymodal nociceptive C-fibre er svekket i CFA modell av inflammatoriske smerter.
Å undersøke intracellulære mekanisme under Lednings svikt, utarbeidelse av intakt DRG med vedlagt ischias nerven ble brukt (figur 3a,B). Figur 3c viser at innenfor stimulans serien, toppene som svar på repeterende stimuli stablet opp på forrige etter-hyperpolarization potensial (AHP) og resulterte i en nedgang i den stigende skråningen av følgende AHP (figur 3c,D ). Tilstedeværelsen av AHP i liten DRG neurons potensielt aktiverer hyperpolarization-aktivert, syklisk nukleotid-modulert (blåsyre) kanaler13,14,15. Den kumulative effekten av AHP spiller en rolle i forekomsten av Lednings svikt. Derfor hypotetisk gjennomsnitt vi at blokkering av BLÅSYRE-kanaler vil øke Lednings svikt effekten betraktelig. Følgende eksperiment brukte en blokkering av BLÅSYRE kanaler, ZD7288. Kontinuerlige opptak avdekket en økning i Lednings svikt i nærvær av ZD7288 i en konsentrasjon-avhengig måte. Inn data er utvidede spor for de angitte intervallene. En positiv korrelasjon mellom Lednings svikt og den stigende skråningen av AHP i små DRG neurons av CFA-behandlede dyr ble observert (figur 3e).
Figur 1: in vivo single-fiber innspillinger av rotte ischias nerver. (A) skjematisk diagram av single-fiber opptak indikerer regionene for opptak (R) (før splitte en filament for innspilling, pia mater spinalis og Dura mater ble fjernet her), narkotika-programmet (D), stimulering (S), og stedet for CFA Injeksjon. (B) representative innspilling av en ischias enkelt fiber viser en tonic avfyring mønster. Dette tallet er endret fra Wang et al.9 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Skikkelsen 2: ledning dårlig inne CFA-behandlet rotter var svekket sammenlignet med administrere rotter. (A) Original påfølgende innspillinger av enkelt C-fiber firings fra kontroll rotter som svar på 10 Hz elektrisk stimulering. Hver tjuende feie vises (påfølgende feier var på 2-s intervaller) og vises topp til bunn. Det innfelte feltet viser et representativt handlings potensiale. (B) opptak av enkelt C-FIBRE fra CFA-injisert rotter som svar på samme stimulering som i panel A. Dette tallet er endret fra Wang et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: måling av C-fiber Lednings svikt ved hjelp av preparater av INTAKT DRG med vedlagt ischias nerven. (A) skjematisk diagram som illustrerer oppsett og plassering av DRG-preparater. SE: stimulering elektrode; SN: ischias nerven; FM: fluorescens mikroskop; RE: opptak elektrode. (B) hele DRG prøven observert under en 40x visning, en microelectrode (høyre skygge) ble brukt til patching en liten DRG Nevron. (C) kontinuerlige innspillinger av serie avfyring svar på 5-Hz stimulering under kontroll forhold eller administrasjon av ulike KONSENTRASJONER av ZD7288 i en liten diameter DRG NEVRON fra CFA-behandlet rotter. Inn-opptakene viser utvidede spor for de angitte opptaks periodene. Mørke flekker representerer Spike feil. (D) representative spor som brukes til å måle den stigende SKRÅNINGEN av AHP. Den stigende skråningen var lik amplitude forskjellen mellom maksimum og minimum AHP spenninger (mV) dividert med varighet (intervall av stimuli, i sekunder). Det venstre panelet illustrerer en større stigende skråning (fra første spor i panel C merket med "*"), og høyre panel viser en mindre stigende skråning (fra den fjerde spor i panel C merket med "#") etter ZD7288 søknad (125 μM). (E) forholdet mellom graden av Lednings svikt og den stigende skråningen av AHP som svar på ulike konsentrasjoner av ZD7288. * og # P < 0,05 kontra kontroll. Dette tallet er endret fra Wang et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om nyere studier har oppnådd kalsium Imaging av DRG neurons in vivo16, utfører in vivo patch-Clamp opptak fra individuelle DRG nociceptors fortsatt svært utfordrende. Derfor, en in vivo single-fiber tilnærming for smerten feltet er av fortsatt betydning. Single-fiber opptak i den nåværende protokollen tillater objektiv observasjon av Lednings svikt fenomener, og kombinasjonen av denne teknikken med ex vivo forberedelse utviklet i dagens studie tillater undersøkelse av underliggende mekanismer i nociceptor excitability endringer i prekliniske modeller. Tre trinn i opptaks protokollen med én fiber er avgjørende for vellykkede innspillinger. Først er det viktig å ta hensyn til anestesi av dyret. I forseggjort i vivo opptaks eksperimenter, er lengden på den tynne fiber som er pakket rundt 29 μm platina elektroden bare 2-3 mm, som er lett forstyrret under innspillingen prosessen. Hvis anestesi betingelsen er ikke spesielt stabil, små bevegelser av dyrene kan føre til opptak feil av elektrofysiologisk aktiviteter. For det andre må preparatet være kontinuerlig dekket med parafin. Hensikten med denne manipulasjon er å opprettholde aktiviteten av fibrene. En passende innspilling sporet ble vanligvis konstruert ved hjelp av huden av dyr. For å hindre parafin oljelekkasje, kan veggen av sporet styrkes ved hjelp av super lim, og parafinolje bør tilsettes når det er nødvendig. Fibrene kan ikke tørke under hele testen. Til slutt må miljøet rundt nerve stammen være sunt vedlikeholdt. Det er alltid noen effusjon væske tilstede rundt innspillingen området, og dette effusjon er en hindring for god kvalitet innspillinger. Amplituden til fiber aktiviteten vil fortsette å avta og til slutt bli umulig å skille fra ekstrem Baseline støy, noe som fører til en opptaks svikt. Et hjemmelaget sprøyte rør er nødvendig for å nå dypt inn i bunnen av sporet for å suge ut den effusjon væsken. Noen ganger, en semidry bomullsdott dynket i saltvann er også nyttig.
I denne studien ble CFA-modellen brukt som produserer fot betennelse og hyperalgesia etter CFA-injeksjon. For å undersøke egenskapene til perifere afferente utslipp samt underliggende mekanismer, ingen smertestillende ble brukt i forsøket, som er en rutinemessig praksis i smerte forskning og er godkjent av IACUC/etikk komiteen. Den nåværende studien introduserer en in vivo single-fiber opptaksteknikk for å observere endringer i overføringsprosessen som oppstår i nociceptive C-fibre som følger med repeterende elektriske stimuli. Det ble demonstrert at graden av Lednings svikt ble betydelig svekket i hyperalgesic forhold, men vi kunne ikke undersøke den underliggende mekanismen ved hjelp av single-fiber opptak på grunn av tekniske problemer i patch-klemme C-fibre. Derfor er etterforskningen av forholdet mellom Lednings svikt og endringer i membran potensialet i liten diameter DRG neurons ble oppdaget ved hjelp av utarbeidelse av intakt DRG med vedlagte ischias nerven. I stedet for single-fiber opptak, patch-klemme ved hjelp av slike preparater Utforsker AHP-avhengige mekanismer for produksjon av Lednings svikt. Ved hjelp av denne protokollen, men bare noen få overflate neurons kan velges, graden av Lednings svikt på nivå med DRG neurons var fortsatt i stand til å bli registrert, selv med stoffet administrasjonen.
DRG har to ytre membraner: pia mater spinalis og Dura mater. Den Dura mater må fjernes ved hjelp av Spring pinsett, og pia mater spinalis må være fordøyd (moderat fordøyelse, ikke så serien som brukes i isolasjon av enkelt DRG-celler) for å sikre at plasteret-klemme elektroder kan nå overflaten av DRG celler for å danne en forsegling; ellers er det umulig å få tak i patch-Clamp innspillinger. Den nåværende tilnærmingen mer fullstendig bevarer den perifere nerve input i forhold til skiver av DRG pluss nerve og sikrer at plasteret-klemme opptak av DRG neurons er lett oppnås. Denne protokollen har bred søknad utsiktene til å forbedre forståelsen av det perifere nervesystemet knyttet til smerte, slik som undersøkelse av elektrofysiologisk endringer i ulike DRG neurons i ulike kroniske smerter modeller17 ,18 og molekylære mekanismer underliggende unormal spontan aktivitet i DRG med myelinated eller unmyelinated axons19,20.
Utarbeidelse av intakt DRG med vedlagt ischias nerven presentert her har mange fordeler i forhold til den tradisjonelle dissosiert Ganglion metoden, fordi strukturen i DRG er fortsatt i utgangspunktet ubrutt i dette preparatet. Derfor simulerer det reelle forhold i vivo og gir en foretrukket mikromiljøet for fysiologisk aktivitet. Utarbeidelse av intakt DRG med vedlagt ischias nerven produserer mindre neuronal skade enn dissosiert DRG forberedelse fordi sistnevnte prosessen bruker mer fordøyelsesenzymer og eksterne fysiske handlinger (f. eks, klipping og blåser av cellene), som fører til mer skade på cellene. De fleste elektrofysiologisk studier er fortsatt utført på dissosiert DRG neurons21,22, og dissosiasjon prosessen selv skader cellene, som resulterer i unormale hyperexcitations av neurons23. En annen fordel med denne protokollen er at ekstracellulære afferente elektrofysiologisk aktiviteter er også innhentet fordi nerve anslagene gjenstår, noe som gjør at undersøkelser av interaksjoner mellom afferente pigger og somatiske DRG spontan Utslipp. Til slutt, bevarer dette preparatet DRG neurons og satellitt gliacellene celler, og bare DRG neurons forbli i dissosiasjon protokoller. Satellitt gliacellene celler, som er avgjørende for å opprettholde mikromiljøet av DRG, er en barriere som beskytter individuelle DRG neurons24, og disse cellene garanterer videre studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Natural Science Foundation i Kina (31671089 og 81470060) og Shaanxi provinsielle Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
