Summary
تسجيل الألياف الواحدة هو تقنية كهربائية فسيولوجية فعالة تنطبق على الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. جنبا إلى جنب مع إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة ، يتم فحص آلية فشل التوصيل. كلا البروتوكولين تحسين فهم علاقة الجهاز العصبي المحيطي مع الألم.
Abstract
كان تسجيل الألياف الواحدة تقنية كهرولوجية كلاسيكية وفعالة على مدى العقود القليلة الماضية بسبب تطبيقه المحدد للألياف العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تنطبق هذه الطريقة بشكل خاص على العقد الجذرية الظهرية (DRG)، وهي الخلايا العصبية الحسية الأولية التي تظهر بنية شبه أحادية القطب من العمليات العصبية. أنماط وملامح إمكانات العمل مرت على طول المحاور قابلة للتسجيل في هذه الخلايا العصبية. تستخدم هذه الدراسة في تسجيلات الألياف الواحدة في الجسم الحي لمراقبة فشل التوصيل للأعصاب الوركية في الفئران الكاملة التي تعالجها فريوند (CFA). كما لا يمكن دراسة الآلية الأساسية باستخدام في التسجيلات في الجسم الحي من الألياف الواحدة، يتم تنفيذ التصحيح المشبك التسجيلات من الخلايا العصبية DRG على الاستعدادات من DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة. تكشف هذه التسجيلات عن وجود ارتباط إيجابي بين فشل التوصيل والمنحدر الصاعد لإمكانات ما بعد فرط الاستقطاب (AHP) للخلايا العصبية DRG في الحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية. يسمح بروتوكول تسجيلات الألياف أحادية في الجسم الحي بتصنيف الألياف العصبية عن طريق قياس سرعة التوصيل ورصد الظروف غير الطبيعية في الألياف العصبية في بعض الأمراض. DRG سليمة مع العصب المحيطي المرفقة يسمح مراقبة نشاط الخلايا العصبية DRG في معظم الظروف الفسيولوجية. بشكل قاطع، تسجيل الألياف الواحدة جنبا إلى جنب مع تسجيل الكهرولوجية من DRGs سليمة هو وسيلة فعالة لدراسة دور فشل التوصيل أثناء عملية مسكن.
Introduction
يضمن الانتقال الطبيعي للمعلومات على طول الألياف العصبية الوظيفة الطبيعية للجهاز العصبي. وينعكس الأداء غير الطبيعي للجهاز العصبي أيضا في انتقال الإشارات الكهربائية للألياف العصبية. على سبيل المثال ، يمكن تصنيف درجة إزالة التمنة في آفات إزالة المليون المركزية من خلال مقارنة التغيرات في سرعة التوصيل العصبي قبل وبعد تطبيق التدخل1. من الصعب تسجيل الألياف العصبية داخل الخلايا، إلا في الاستعدادات الخاصة مثل محور الحبار العملاق أكسون2. ولذلك، فإن النشاط الكهرولوجيولوجي قابل للتسجيل فقط عن طريق التسجيل خارج الخلية للألياف واحدة. باعتبارها واحدة من الأساليب الكهرولوجية الكلاسيكية، تسجيل الألياف واحدة لديها تاريخ أطول من التقنيات الأخرى. ومع ذلك، فإن عدد أقل من علماء الفيزيولوجيا الكهربائية فهم هذه الطريقة على الرغم من تطبيقها على نطاق واسع. ولذلك، هناك حاجة إلى إدخال مفصل للبروتوكول القياسي لتسجيل الألياف الواحدة من أجل تطبيقه المناسب.
على الرغم من أن تقنيات التصحيح المشبك المختلفة هيمنت على الدراسة الكهرولوجية الحديثة، لا يزال تسجيل الألياف الواحدة يلعب دورا لا بديل له في تسجيل أنشطة الألياف العصبية، وخاصة الألياف التي تنقل الإحساس المحيطي مع جسم الخلية الحسية الموجودة في العقدة الجذرية الأورسية (DRG). ميزة استخدام تسجيل الألياف واحدة هنا هو أنه في تسجيل الألياف الحية يوفر وقت مراقبة طويل مع القدرة على تسجيل الاستجابات للمحفزات الطبيعية في نماذج ما قبل السريرية دون اضطراب في البيئة داخل الخلايا3 , 4.
وقد درس عدد متزايد من الدراسات على مدى العقدين الماضيين وظائف معقدة على طول الألياف العصبية5، وفشل التوصيل ، والذي يعرف بأنه حالة من انتقال دفعة العصب غير ناجحة على طول محور، كان موجودا في العديد من مختلف الأعصاب الطرفية6،7. وجود فشل التوصيل في تحقيقنا بمثابة آلية ذاتية المثبطة الجوهرية لتعديل المدخلات nociceptive المستمرة على طول C-الألياف8. وقد تم تخفيف هذا الفشل التوصيل بشكل ملحوظ في ظل ظروف فرط الهالجية4،9. ولذلك، فإن استهداف العوامل التي ينطوي عليها فشل التوصيل قد يمثل علاجًا جديدًا للألم العصبي. لمراقبة فشل التوصيل، يجب تسجيل نمط إطلاق النار وتحليلها على أساس المسامير التي يتم تصريفها بالتتابع على أساس تسجيل الألياف الواحدة.
لفهم آلية فشل التوصيل بدقة ، من الضروري تحديد خصائص انتقال المحاور ، أو على وجه التحديد ، خصائص غشاء الخلايا العصبية DRG ، استناداً إلى خصائصها التشريحية شبه أحادية القطب. وقد أجريت العديد من الدراسات السابقة في هذا المجال على الخلايا العصبية DRG منفصلة10,11, والتي قد لا تكون مجدية للتحقيق في فشل التوصيل بسبب اثنين من العقبات. أولا، يتم استخدام مختلف الأساليب الميكانيكية والكيميائية في عملية التفكك لتحرير الخلايا العصبية DRG، والتي قد تؤدي إلى خلايا غير صحية أو تغيير النمط الظاهري / خصائص الخلايا العصبية والخلط بين النتائج. ثانيا، تتم إزالة الأعصاب الطرفية المرفقة أساسا، والظواهر فشل التوصيل لا يمكن ملاحظتها في هذه الاستعدادات. ولذلك، تم تحسين إعداد الخلايا العصبية DRG سليمة مع العصب المرفقة لتجنب العقبات المذكورة أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتبع البروتوكول الحالي دليل سياسة دائرة الصحة العامة في الولايات المتحدة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت اللجنة المعنية بأخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة للجامعة الطبية العسكرية الرابعة على البروتوكول.
1- الحيوانات
- تقسيم 24 الفئران سبراغ-دولي (4-8 أسابيع من العمر) إلى مجموعتين. إنتاج نموذج فريد كالادفي (CFA) بحقن 100 ميكرولتر من CFA في مجموعة واحدة من 14 الفئران ومجموعة أخرى من 10 الفئران عن طريق العلاج مع المالحة.
ملاحظة: تم الحصول على جميع الحيوانات من مركز الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة. واستخدمت فئران سبراغ-دولي من الذكور والإناث البالغين (150-200 غرام) في جميع الإجراءات، وتم تعيين الفئران عشوائيا ً في أقفاص. تم إيواء اثنين من الفئران في كل قفص تحت دورة ضوء /الظلام لمدة 12-/12 ساعة في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
2. في فيفو تسجيل واحد من الألياف
- إعداد وتطهير جميع الأدوات الجراحية (مشرط، ملاقط، مقص العيون، مقص القص، الزجاج إبرة فصل، إبرة خياطة، العظام rongeur) قبل الجراحة. إعداد 1 لتر أو 2 لتر من محلول رينجر العادي خارج الخلية (في MM: NaCl 124، KCl 3، MgSO4 1.3، CaCl2 2، NaHCO3 26، NaH2PO4 1.25، الجلوكوز 15؛ درجة الحموضة 7.4 و 305 منوم). يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يُستعمل.
- تُدّس الفئران. في الأيام من 3 إلى 7 بعد حقن CFA، استخدم الحقن داخل الصفاق من محلول مختلط (1٪ كلورالوز و 17٪ يوريتان، 5 مل / كغ من وزن الجسم) للحفاظ على الحيوانات في حالة جمالية مستقرة خلال التجربة. تطبيق حقن تكميلية من التخدير، إذا لزم الأمر، بعد فحص التلاميذ والاستجابة لتحفيز الألم. مراقبة والحفاظ على درجة حرارة الجسم بالقرب من 37 درجة مئوية.
-
تعرض جذع العصب الوركي للتسجيل
- قطع فتح الجلد والعضلات على الجزء الظهري من الفخذ. إجراء تشريح حاد على طول العضلة ذات الرأسين الفخذية. عزل بعناية جذع العصب الوركي باستخدام مقص العيون وإبرة فصل الزجاج. الحفاظ على الأنسجة الرطبة باستخدام حل رينجر.
- إصلاح الحيوان على طوق معدني محلية الصنع (3 سم طويلة، 2 مم طوق معدني واسع مع سلك الحديد 1 ملم في القطر) عن طريق خياطة الجلد في فتحة من حوله. سحب الجلد حتى قليلا وذلك لإنشاء حمام السوائل.
- كشف 1 سم من جذع العصب الوركي في الجانب القريب. وضع منصة صغيرة البني تحت الجذع العصب لتعزيز التباين ومراقبة الجذع العصب غرامة بوضوح. تسخين البارافين السائل في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية وأسقطه على الجزء العلوي من جذع العصب لمنع تجفيف سطح الألياف. إزالة بيا ماتر العمود الفقري ودورا ماتر حول العصب الوركي.
-
جلسة التسجيل
- حدد خيوط البلاتين (29 ميكرومتر في القطر) كقطب التسجيل. الحرارة أكثر من أجل صب أسهل، وخلق هوك صغيرة في نهاية جدا. قم بإرفاق القطب الكهربائي بمُمِمُمِيّي لنقل القطب الكهربائي حسب الحاجة.
- في الحمام، ضع قطبًا مرجعيًا في الأنسجة تحت الجلد المجاورة. تقسيم دورا العمود الفقري والأم بيا. فصل العصب الوركي في ألياف واحدة (15-20 ميكرومتر في القطر) في بركة التسجيل. ثم، التقاط ملزمة غرامة من محور عصبي وتعليق نهاية القريبة من المحور على هوك من قطب التسجيل تحت منظار ستيريو في التكبير 25x.
ملاحظة: خيوط تشريح فقط تميل إلى أن تكون أكثر سمكا وتتطلب المزيد من الفصل حتى يمكن تسجيل وحدة واحدة. - تحديد المجال تقبلا من الألياف C nociceptive واحد باستخدام التحفيز الميكانيكي (فون فراي الشعر) والتحفيز الحراري (كرة القطن الصغيرة مع 50-55 درجة مئوية المياه). باختصار، إذا كان إطلاق الألياف العصبية تستجيب للمحفزات الميكانيكية والماء الساخن، ثم النظر في ذلك على أنه متعدد الوسائط nociceptive C-الألياف4. بعد ذلك، أدخل اثنين من أقطاب التحفيز إبرة (فاصل زمني 2 ملم) في جلد الحقل المحدد لتسليم المحفزات الكهربائية.
- عرض الموجي من إمكانية إجراء على الذبذبات واستخدام جهاز كمبيوتر A / D المجلس مع معدل أخذ العينات إشارة من 20 كيلو هرتز لتضخيم وتسجيل المسامير.
- جمع البيانات باستخدام برامجالحصول على البيانات (جدول المواد). حفظ البيانات على جهاز كمبيوتر وتحليلهافي وقت لاحق مع البرامج المهنية (جدول المواد).
3. قياس فشل التوصيل
- تقديم المحفزات الكهربائية المتكررة (0.8 مللي ثانية مدة، 1.5x كثافة عتبة) في ترددات مختلفة (2 هرتز،5 هرتز، 10 هرتز) إلى الألياف C لمدة 60 ثانية 4،8،9. السماح لفترة 10 دقيقة للألياف للاسترخاء بين المحفزات. حساب نسبة عدد حالات الفشل إلى عدد نبضات التحفيز المتكررة المسلمة ومضاعفة بنسبة 100٪ للحصول على درجة فشل التوصيل.
4. إعداد DRG Iintact تعلق مع العصب الوركي
- إعداد الأدوات الجراحية والحل خارج الخلية رينجر كما هو موضح في الخطوة 2.1.
- فصل DRG مع العصب الوركي المرفقة.
- التخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 2.2 (في الأيام 3 إلى 7 بعد حقن CFA). قص الشعر على الظهر والساق مع مقص القص، وتعقيم الجلد مع صبغة اليود.
- للتعرض DRG، قطع أولا فتح الجلد من خط الوسط من الظهر على مستوى الجزء L4 إلى L5. إزالة العضلات، وعملية العمود الفقري، وفقرة المجلس، وعملية عرضية باستخدام rongeur العظام لفضح الحبل الشوكي والجسم DRG. قم بتغطية الحبل الشوكي المكشوف وDRG بالقطن الذي تم اختراقه من خلال الحل العادي خارج الخلية لـ Ringer للحفاظ على النشاط العصبي. وقف النزيف ومسح الدم في الوقت المناسب.
- كشف العصب الوركي من اتجاهين: إزالة الهيكل العظمي L4 إلى S1 فوق اللطواب الفقرية باستخدام مقص العيون لفضح العصب الشوكي المتصل DRG الذي هو في نهاية القريب من العصب الوركي. قطع فتح الجلد لفضح العصب الوركي في الفخذ الأوسط. فصل وفصل العصب الوركي من الطرف القاصي للعصب حيث يذهب داخل العضلات، وligate الجذع العصب مع خط الجراحية في نهاية العصب قبل القطع.
- فصل العصب الوركي من النسيج الضام الكامنة باستخدام مقص العيون عن طريق رفع نقطة ربط العصب. إزالة دورا من الحبل الشوكي وفصل DRG من النسيج الضام الكامنة عن طريق رفع الجذر الظهري حتى تصل إلى الجزء المجاور من العصب الوركي. وهكذا، عزل الإعداد كله من DRG مع العصب الوركي المرفقة.
- مسح سطح DRG.
- قم بإزالة الدورة الشوكية بعناية على أسطح L4−L6 DRG باستخدام ملاقط تحت منظار مجسم في التكبير 4x.
- وضع DRG مع العصب الوركي المرفقة في أنبوب زجاجي يحتوي على 1 مل من الإنزيمات المختلطة (0.2٪ بروتيناز و 0.32٪ كولاجيناز) وهضم في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (ضربة قليلا مع قطرة بلاستيكية في فاصل زمني من 5 دقائق).
- ارفع نهاية خط الربط وحرّك التحضير إلى طبق مليء بمحلول الرينجر العادي خارج الخلية لغسل الإنزيم. ثم نقل DRG هضمها إلى حاوية (الشكل1A)مليئة محلول المؤكسج رينجر خارج الخلية للتسجيل.
- جلسة التسجيل
- إعداد حل داخل الخلايا (في MM: غلوكونات البوتاسيوم 120، KCl 18، MgCl2 2، الإيثيلين غليكول-بيس (β-aminoethyl الأثير)-N، N، N،N'، N'-tetraacetic Acid [EGTA] 5، HEPES 10، Na 2-ATP 5، Na-GTP 0.4، CaCl2 1؛ pH 7.2 و 300 mOsm). يُحفظ عند درجة حرارة 0 درجة مئوية حتى يُستعمل.
- استقرار العقد باستخدام مرساة شريحة وربط نهاية العصب إلى قطب تحفيز شفط (الشكل1A). تصور وحدد الخلايا العصبية DRG مع هدف غمر المياه في التكبير 40X.
- سحب قطبكهربائي (جدول المواد) وملء مع حل داخل الخلايا. إدراج القطب الكهربائي على حامل وتطبيق الضغط الإيجابي في ماصة مع المقاومة النهائية من 4-7 MΩ.
- ارفع القطب الكهربائي إلى الخلية والمسها. إعطاء ضغط سلبي في ماصة، بمجرد أن يتم التوصل إلى ختم GΩ، تعيين إمكانات الغشاء في حوالي -60 ملفولت ثم إنشاء وضع تسجيل الخلية الكاملة.
- تقديم محفزات متكررة من 5-50 هرتز إلى العصب الوركي من خلال قطب الشفط لفحص فشل التوصيل. قياس سعة إمكانات ما بعد الاستقطاب (AHP) من خط الأساس إلى الذروة، ومدة AHP 80٪.
ملاحظة: تم استخدام تحليل التباين في اتجاه واحد (ANOVA؛ لأكثر من مجموعتين) أو اختبار t للطلاب (لمجموعتين فقط) لتحليل البيانات. يتم عرض البيانات كوسيلة ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). وقد حُدِّد المستوى الإحصائي الهام بـ p < 0.05.
- إنهاء التجربة
- عند الانتهاء من المهمة التجريبية في حين أن الفئران لا تزال تحت حالة التخدير، يتم قتل الفئران إنسانيا مع حقن داخل القلب من الصوديوم البنتوباربيتال جرعة زائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعتمد نتيجة بروتوكول التسجيل أحادي الألياف على جودة تشريح الألياف. الحيوان لفي تجارب الجسم الحي يجب أن يكون في حالة جيدة للحفاظ على الجذع العصب صحية لتشريح سهلة (انظر المشورة في قسم المناقشة). هناك حاجة إلى حمام تطبيق المخدرات في كثير من الحالات لتسليم المخدرات على الألياف. ويوضح الشكل 1 كيف تم تشغيل التسجيل في الجسم الحي أحادي الألياف (الشكل1A)ويقدم تسجيلاً كلاسيكياً واحداً من العصب الوركي للالحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية (الشكل1B).
وبحثت التجارب التالية في وجود فشل في التوصيل في الحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية. واستند هذا التحقيق على افتراض أن فشل التوصيل على طول الألياف C nociceptive كانت ظاهرة شائعة، ودرجة فشل التوصيل تم تخفيفها بشكل كبير في ظل ظروف فرط الجهة، والتي تدعمها لدينا الدراسات السابقة4،8،9،12. ويبين الشكل 2ألف أن فشل التوصيل من الألياف C لوحظ في الحيوانات العادية. ومع ذلك، تم تخفيض درجة فشل التوصيل بشكل كبير بعد إنشاء فرط الهالجية الناجم عن CFA بعد حقن CFA في القدم مقارنة بالسيطرة (الشكل2B). وتبين هذه البيانات أن فشل التوصيل من الألياف C متعددة الوسائط ذات الصلة بالألم هو مخفف في نموذج CFA من الألم الالتهابي.
لفحص الآلية داخل الخلايا أثناء فشل التوصيل ، تم استخدام إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة (الشكل3A،B). ويبين الشكل 3C أنه في إطار سلسلة الحوافز، تراكمت الزيادات استجابة للمحفزات المتكررة على إمكانات ما بعد فرط الاستقطاب السابقة (AHP) وأسفرت عن انخفاض في المنحدر الصاعد من AHP التالية (الشكل3C،D ). وجود AHP في الخلايا العصبية DRG الصغيرة يحتمل أن ينشط فرط الاستقطاب تنشيط, دوري النيوكليوتيد التضمين (HCN) القنوات13,14,15. ويؤدي الأثر التراكمي للحصان الوظيفي دور في حدوث فشل التوصيل. لذلك، افترضنا أن حجب قنوات HCN من شأنه أن يعزز بشكل كبير تأثير فشل التوصيل. استخدمت التجربة التالية مانع قنوات HCN ZD7288. كشفت التسجيلات المستمرة عن زيادة في فشل التوصيل في وجود ZD7288 بطريقة تعتمد على التركيز. إظهار Insets تتبعات موسعة للفواصل الزمنية المحددة. ولوحظ وجود ارتباط إيجابي بين فشل التوصيل وارتفاع منحدر AHP في الخلايا العصبية DRG الصغيرة للالحيوانات المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية (الشكل3E).
الشكل 1: في الجسم الحي تسجيلات من الألياف الواحدة للأعصاب الوركية الفئران. (أ) رسم تخطيطي لتسجيل الألياف الواحدة يشير إلى المناطق لتسجيل (R) (قبل تقسيم خيوط للتسجيل، تمت إزالة بيا ماتر العمود الفقري ودورا ماتر هنا)، وتطبيق المخدرات (D)، والتحفيز (S)، وموقع CFA حقن. (B) تسجيل تمثيلي من الألياف واحدة الوركية التي تظهر نمط اطلاق منشط. تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون9الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم تخفيف فشل التوصيل في الفئران المعالجة بالجماعة المالية الأفريقية مقارنة بفئران التحكم. (أ) التسجيلات المتتالية الأصلية لإطلاق واحد من الألياف C من الفئران التحكم ردا على التحفيز الكهربائي 10 هرتز. يتم عرض كل اكتساح 20 (الاجتياحات المتتالية كانت على فترات 2-s) وعرض من أعلى إلى أسفل. يظهر inset إمكانية إجراء تمثيلي. (ب) تسجيلات ألياف C واحدة من الفئران حقن CFA استجابة لنفس التحفيز كما هو الحال في لوحة A. تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس فشل التوصيل من الألياف C باستخدام الاستعدادات من DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة. (أ) رسم تخطيطي يوضح إعداد ووضع الاستعدادات DRG. SE: تحفيز القطب; SN: العصب الوركي. FM: مجهر الفلورة. RE: تسجيل القطب. (B) عينة DRG كاملة لوحظت تحت عرض 40X، تم استخدام microelectrode (الظل الأيمن) لتصحيح الخلايا العصبية DRG صغيرة. (C) التسجيلات المستمرة للاستجابات إطلاق سلسلة لتحفيز 5 هرتز تحت ظروف السيطرة أو إدارة تركيزات مختلفة من ZD7288 في الخلايا العصبية DRG قطرها صغير من الفئران المعالجة CFA. تظهر المجموعات insets تتبعات موسعة لفترات التسجيل المحددة. البقع الداكنة تمثل فشل ارتفاع. (د) آثار تمثيلية تستخدم لقياس المنحدر الصاعد من AHP. كان المنحدر الصاعد يساوي الفرق السعة بين الحد الأقصى والحد الأدنى من الفولتية AHP (mV) مقسوماً على المدة (الفاصل الزمني للمحفزات، بالثواني). توضح اللوحة اليسرى منحدرًا أكبر ارتفاعًا (من التتبع الأول في اللوحة C الذي تم تمييزه بـ "*")، وتظهر اللوحة اليمنى منحدرًا أصغر ارتفاعًا (من التتبع الرابع في اللوحة C الذي تم تمييزه بـ "#") بعد تطبيق ZD7288 (125 درجة مئوية). (هاء) العلاقة بين درجة فشل التوصيل والمنحدر الصاعد للرابطة استجابة لتركيزات مختلفة من ZD7288. * و # P < 0.05 مقابل السيطرة. تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن الدراسات الحديثة قد حققت تصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية DRG في الجسم الحي16، وأداء في الجسم الحي التصحيح المشبك التسجيل من nociceptors DRG الفردية لا يزال تحديا للغاية. ولذلك، فإن نهج في الجسم الحي من الألياف الواحدة لمجال الألم هو من الأهمية المستمرة. تسجيل الألياف الواحدة في هذا البروتوكول يسمح بالمراقبة الموضوعية لظواهر فشل التوصيل، والجمع بين هذه التقنية مع إعداد الجسم الحي السابق الذي تم تطويره في الدراسة الحالية يسمح بفحص الآليات الأساسية في التغيرات في إمكانية الإثارة nociceptor في النماذج ما قبل السريرية. ثلاث خطوات من بروتوكول تسجيل الألياف الواحدة حاسمة للتسجيلات الناجحة. أولا ، من الأهمية بمكان الانتباه إلى تخدير الحيوان. في وضع في تجارب تسجيل الجسم الحي، وطول الألياف رقيقة التي يتم التفاف حول القطب البلاتين 29 ميكرومتر هو فقط 2-3 ملم، والتي تتداخل بسهولة خلال عملية التسجيل. إذا كانت حالة التخدير ليست مستقرة بشكل خاص ، فإن الحركات الصغيرة للالحيوانات قد تؤدي إلى تسجيل فشل الأنشطة الكهرولوجية. ثانيا، يجب أن تكون مغطاة باستمرار إعداد مع البارافين. الغرض من هذا التلاعب هو الحفاظ على نشاط الألياف. تم بناء فتحة تسجيل مناسبة بشكل عام باستخدام جلد الحيوانات. لمنع تسرب زيت البارافين، يمكن تعزيز جدار الفتحة باستخدام الغراء السوبر، وينبغي إضافة زيت البارافين كلما لزم الأمر. لا يمكن أن تجف الألياف خلال الاختبار بأكمله. وأخيرا، يجب الحفاظ على البيئة المحيطة الجذع العصب صحيا. هناك دائما بعض السائل الانصباب موجودة حول منطقة التسجيل، وهذا الانصباب هو عقبة أمام تسجيلات ذات نوعية جيدة. سوف تستمر سعة نشاط الألياف في الانخفاض وتصبح في نهاية المطاف لا يمكن تمييزها عن الضوضاء خط الأساس المدقع، مما يسبب فشل التسجيل. مطلوب أنبوب حقنة محلية الصنع للوصول إلى عمق الجزء السفلي من فتحة لامتصاص السائل الانصباب. في بعض الأحيان، كرة القطن شبه الجافة غارقة في المالحة مفيد أيضا.
في هذه الدراسة، تم تطبيق نموذج CFA الذي ينتج التهاب القدم وفرط الجثيان بعد حقن CFA. من أجل التحقيق في خصائص التفريغ اللافي الطرفية، فضلا عن الآليات الأساسية، لم تستخدم المسكنات في التجربة، وهي ممارسة روتينية في بحوث الألم ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات IACUC/ Ethics. تقدم هذه الدراسة تقنية تسجيل أحادية الألياف في الجسم الحي لمراقبة التعديلات في عملية الإرسال التي تحدث في الألياف C nociceptive المقدمة مع المحفزات الكهربائية المتكررة. وقد ثبت أن درجة فشل التوصيل قد تم تخفيفها بشكل كبير في الظروف المفرطة، ولكن لم نتمكن من التحقيق في الآلية الأساسية باستخدام تسجيل الألياف الواحدة بسبب الصعوبات التقنية في التصحيح لقط سي-فيبر. لذلك ، تم الكشف عن التحقيق في العلاقة بين فشل التوصيل والتغيرات في إمكانات الغشاء من الخلايا العصبية DRG ذات القطر الصغير باستخدام إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة. بدلا من تسجيل من الألياف الواحدة، التصحيح المشبك باستخدام مثل هذه الاستعدادات يستكشف الآليات المعتمدة على AHP لإنتاج فشل التوصيل. باستخدام هذا البروتوكول، على الرغم من أنه لا يمكن اختيار سوى عدد قليل من الخلايا العصبية السطحية، كانت درجة فشل التوصيل على مستوى الخلايا العصبية DRG لا تزال قادرة على تسجيلها، حتى مع إدارة المخدرات.
DRG اثنين من الأغشية الخارجية: بيا ماتر العمود الفقري ودورا ماتر. يجب إزالة الأم دورا باستخدام ملاقط الربيع، ويجب هضم بيا الأم العمود الفقري (الهضم المعتدل، وليس كما سلسلة كما تستخدم في عزل خلايا DRG واحدة) لضمان أن الأقطاب الكهربائية التصحيح المشبك يمكن أن تصل إلى سطح خلايا DRG لتشكيل ختم ، وعندما كان هناك خلاف ذلك، فإنه من المستحيل الحصول على تسجيلات التصحيح المشبك. النهج الحالي يحافظ بشكل أكثر تماما على مدخلات الأعصاب الطرفية مقارنة مع شرائح من DRG بالإضافة إلى العصب ويضمن أن يتم تحقيق تسجيل التصحيح المشبك من الخلايا العصبية DRG بسهولة. هذا البروتوكول لديه آفاق تطبيق واسعة لتحسين فهم الجهاز العصبي المحيطي المتعلقة بالألم، مثل التحقيق في التغيرات الفسيولوجية الكهربائية في الخلايا العصبية DRG مختلفة في نماذج الألم المزمن المختلفة17 ،18 والآليات الجزيئية الكامنة وراء النشاط العفوي غير الطبيعي في DRG مع محاور مايليناتيد أو غير ممع19،20.
إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة المعروضة هنا لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع طريقة العقدة التفكك التقليدية، لأن هيكل DRG لا يزال في الأساس دون انقطاع في هذا الإعداد. ولذلك، فإنه يحاكي الظروف الحقيقية في الجسم الحي ويوفر بيئة صغيرة أفضل للنشاط الفسيولوجي. إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة تنتج أقل تلف الخلايا العصبية من إعداد DRG تفكك لأن العملية الأخيرة يستخدم المزيد من الإنزيمات الهضمية والإجراءات البدنية الخارجية (على سبيل المثال، القص وتهب من الخلايا)، والتي يسبب المزيد من الضرر للخلايا. معظم الدراسات الكهرولوجية لا تزال أجريت على الخلايا العصبية DRG منفصلة21،22، وعملية التفكك نفسها يضر الخلايا ، مما يؤدي إلى فرط غير طبيعي من الخلايا العصبية23. ميزة أخرى من هذا البروتوكول هو أن يتم الحصول على الأنشطة الكهربائية الفسيولوجية خارج الخلية أيضا لأن التوقعات العصبية لا تزال قائمة، مما يسمح التحقيقات في التفاعلات بين المسامير afferent وDRG الجسدية عفوية التصريف. وأخيرا، يحافظ هذا الإعداد على الخلايا العصبية DRG والخلايا الغليفية الأقمار الصناعية، وتبقى الخلايا العصبية DRG فقط في بروتوكولات التفكك. الخلايا الغليفية الأقمار الصناعية، والتي هي ضرورية للحفاظ على البيئة الدقيقة من DRG، هي الحاجز الذي يحمي الخلايا العصبية DRG الفردية24، وهذه الخلايا تستحق المزيد من الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671089 و81470060) ومشروع بحوث علوم وتكنولوجيا التنمية الاجتماعية في مقاطعة شنشي (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
