Summary
एकल फाइबर रिकॉर्डिंग एक प्रभावी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक है जो केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र पर लागू होती है। संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी के साथ, चालन विफलता के तंत्र की जांच की है. दोनों प्रोटोकॉल दर्द के साथ परिधीय तंत्रिका तंत्र के रिश्ते की समझ में सुधार.
Abstract
एकल फाइबर रिकॉर्डिंग केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में तंत्रिका फाइबर के लिए अपने विशिष्ट आवेदन की वजह से पिछले कुछ दशकों में एक शास्त्रीय और प्रभावी electrophysiological तकनीक किया गया है. इस विधि पृष्ठीय जड़ Ganglia (डीआरजी) के लिए विशेष रूप से लागू है, जो प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स कि तंत्रिका प्रक्रियाओं के एक छद्म-एकध्रुवीय संरचना प्रदर्शन कर रहे हैं. पैटर्न और axons के साथ पारित कार्रवाई क्षमता की सुविधाओं इन न्यूरॉन्स में रिकॉर्ड कर रहे हैं. वर्तमान अध्ययन में विवो एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में उपयोग करता है पूरा फ्रेंड के सहायक (CFA) इलाज चूहों में sciatic नसों के चालन विफलता का निरीक्षण करने के लिए. अंतर्निहित तंत्र vivo एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता है के रूप में, DRG न्यूरॉन्स के पैच-क्लैम्प-रिकॉर्डिंग संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी पर प्रदर्शन कर रहे हैं. इन रिकॉर्डिंग चालकीय विफलता और सीएफए इलाज जानवरों में DRG न्यूरॉन्स के बाद hyperpolarization क्षमता (AHP) की बढ़ती ढलान के बीच एक सकारात्मक संबंध प्रकट करते हैं. विवो एकल फाइबर-रिकॉर्डिंग के लिए प्रोटोकॉल चालन वेग की माप और कुछ रोगों में तंत्रिका फाइबर में असामान्य स्थितियों की निगरानी के माध्यम से तंत्रिका फाइबर के वर्गीकरण की अनुमति देता है। संलग्न परिधीय तंत्रिका के साथ बरकरार DRG सबसे शारीरिक स्थितियों में डीआरजी न्यूरॉन्स की गतिविधि के अवलोकन की अनुमति देता है. निर्णायक रूप से, बरकरार DRGs के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त एकल फाइबर रिकॉर्डिंग एनाल्जेसिक प्रक्रिया के दौरान चालन विफलता की भूमिका की जांच करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।
Introduction
तंत्रिका फाइबर के साथ जानकारी के सामान्य संचरण तंत्रिका तंत्र के सामान्य समारोह की गारंटी देता है. तंत्रिका तंत्र की असामान्य कार्यप्रणाली तंत्रिका फाइबर के विद्युत संकेत संचरण में भी परिलक्षित होती है। उदाहरण के लिए, केंद्रीय demyelination घावों में demyelination की डिग्री से पहले और हस्तक्षेप आवेदन1के बाद तंत्रिका चालन वेग में परिवर्तन की तुलना के माध्यम से वर्गीकृत किया जा सकता है. यह इस तरह के स्क्विड विशाल एक्सॉन2के रूप में विशेष तैयारी में छोड़कर, तंत्रिका फाइबर रिकॉर्ड करने के लिए intracellularly मुश्किल है। इसलिए, electrophysiological गतिविधि केवल एकल फाइबर के extracellular रिकॉर्डिंग के माध्यम से रिकॉर्ड करने योग्य है. शास्त्रीय electrophysiological तरीकों में से एक के रूप में, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग अन्य तकनीकों की तुलना में एक लंबा इतिहास है. हालांकि, कम electrophysiologists अपने व्यापक आवेदन के बावजूद इस विधि को समझ. इसलिए, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए मानक प्रोटोकॉल की एक विस्तृत परिचय अपने उपयुक्त आवेदन के लिए आवश्यक है.
हालांकि विभिन्न पैच-क्लैम्प तकनीक आधुनिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन का प्रभुत्व है, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग अभी भी तंत्रिका फाइबर की गतिविधियों की रिकॉर्डिंग में एक अपूरणीय भूमिका निभाता है, विशेष रूप से फाइबर उनके साथ परिधीय सनसनी संचारण पृष्ठीय मूल गुच्छिका (डीआरजी) में स्थित संवेदी कोशिका शरीर। यहाँ एकल फाइबर रिकॉर्डिंग का उपयोग करने का लाभ यह है कि विवो फाइबर रिकॉर्डिंग में क्षमता के साथ एक लंबे अवलोकन समय प्रदान करता है intracellular पर्यावरण की अशांति के बिना पूर्व नैदानिक मॉडल में प्राकृतिक उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए3 , 4.
पिछले दो दशकों में अध्ययन की बढ़ती संख्या तंत्रिका फाइबर के साथ जटिल कार्यों की जांच की है5, और चालन विफलता, जो एक्सॉन के साथ असफल तंत्रिका आवेग संचरण के एक राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है, कई अलग अलग में मौजूद था परिधीय तंत्रिकाएं6,7. हमारी जांच में चालन विफलता की उपस्थिति सी फाइबर8के साथ लगातार nociceptive इनपुट के मॉडुलन के लिए एक आंतरिक आत्म निरोधी तंत्र के रूप में कार्य किया। इस चालन विफलता को हाइपरएल्गेसिया4,9की परिस्थितियों में काफी कम किया गया था . इसलिए, चालन विफलता में शामिल कारकों को लक्षित neuropathic दर्द के लिए एक नया इलाज का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. चालन विफलता का निरीक्षण करने के लिए, फायरिंग पैटर्न दर्ज किया जाना चाहिए और क्रमिक रूप से छुट्टी spikes एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के आधार पर के आधार पर विश्लेषण किया जाना चाहिए।
चालकीय ताने-पालन विफलता के तंत्र को अच्छी तरह से समझने के लिए, एक्सॉन के संचरण गुणों की पहचान करना आवश्यक है, या अधिक ठीक, डीआरजी न्यूरॉन्स की झिल्ली गुण, उनके छद्म-एकध्रुवीय शारीरिक गुणों के आधार पर। इस क्षेत्र में कई पिछले अध्ययन अलग DRG न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गया है10,11, जो दो बाधाओं के कारण चालन विफलता की जांच के लिए संभव नहीं हो सकता है. सबसे पहले, विभिन्न यांत्रिक और रासायनिक तरीकों वितरण प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है DRG न्यूरॉन्स मुक्त करने के लिए, जो अस्वास्थ्यकर कोशिकाओं में परिणाम या न्यूरॉन्स के phenotype / गुण में परिवर्तन और निष्कर्षों को भ्रमित कर सकते हैं. दूसरा, संलग्न परिधीय नसों मूल रूप से हटा रहे हैं, और चालन विफलता घटना इन तैयारियों में प्रेक्षणीय नहीं हैं. इसलिए, एक संलग्न तंत्रिका के साथ बरकरार DRG न्यूरॉन्स की तैयारी के लिए उपर्युक्त बाधाओं से बचने में सुधार किया गया है.
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Protocol
वर्तमान प्रोटोकॉल मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशुके उपयोग पर संयुक्त राज्य अमेरिका सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा की नीति के लिए गाइड के बाद, और चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी.
1. पशु
- 24 Sprague-Dawley चूहों (4-8 सप्ताह पुराने) दो समूहों में विभाजित करें. 14 चूहों के एक समूह में सीएफए के 100 डिग्री सेल्सियस के इंट्राप्लांटर इंजेक्शन द्वारा पूरा फ्रायंड का सहायक (सीएफए) मॉडल का उत्पादन और नमकीन के साथ उपचार द्वारा 10 चूहों के एक अन्य समूह।
नोट: जानवरों के सभी चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु केंद्र से प्राप्त किए गए थे. वयस्क पुरुष और महिला Sprague-Dawley चूहों (150-200 जी) सभी प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया गया, और चूहों बेतरतीब ढंग से पिंजरों को सौंपा गया. दो चूहों को 12-/12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के नीचे एक निरंतर तापमान (25 डिग्री 1 डिग्री सेल्सियस) के तहत पिंजरे में रखा गया था, जिसमें भोजन और पानी तक निशुल्क पहुंच होती थी।
2. विवो सिंगल-फाइबर रिकॉर्डिंग में
- सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों (स्केलपेल, चिमटी, नेत्र कैंची, कतरनी कैंची, कांच को अलग करने की सुई, सीवन सुई, हड्डी रोंगूर) को तैयार और कीटाणुरहित करें। सामान्य रिंगर के extracellular समाधान के 1 एल या 2 एल तैयार (एम में: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, ग्लूकोज 15; पीएच 7.4 और 305 mOsm). उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें। सीएफए इंजेक्शन के बाद 3 से 7 दिनों में, प्रयोग के दौरान जानवरों को स्थिर सौंदर्य की स्थिति में रखने के लिए मिश्रित समाधान (1% क्लोरलोज और 17% यूरेथेन, 5 एमएल/किलोग्राम शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन का उपयोग करें। विद्यार्थियों और दर्द उत्तेजना की प्रतिक्रिया की जाँच के बाद, यदि आवश्यक हो, एनेस्थेटिक्स के पूरक इंजेक्शन लागू करें। मॉनिटर और 37 डिग्री सेल्सियस के पास एक शरीर के तापमान को बनाए रखने।
-
रिकॉर्डिंग के लिए sciatic तंत्रिका ट्रंक के एक्सपोजर
- जांघ के पृष्ठीय भाग पर त्वचा और मांसपेशियों को काटें। ऊरु biceps के साथ एक कुंद विच्छेदन प्रदर्शन. ध्यान से नेत्र कैंची और एक गिलास जुदाई सुई का उपयोग कर sciatic तंत्रिका ट्रंक को अलग। रिंगर के घोल का उपयोग करके ऊतक को गीला रखें।
- यह चारों ओर स्लॉट में सिलाई के माध्यम से एक घर का बना धातु घेरा (3 सेमी लंबी, 2 मिमी चौड़ा धातु घेरा एक लोहे के तार के साथ 1 मिमी व्यास) पर जानवर को ठीक करें। त्वचा को थोड़ा ऊपर खींचो ताकि एक तरल पदार्थ स्नान स्थापित करने के लिए.
- समीपस्थ पक्ष में 1 सेमी sciatic तंत्रिका ट्रंक का पर्दाफाश. इसके विपरीत बढ़ाने के लिए और स्पष्ट रूप से ठीक तंत्रिका ट्रंक का निरीक्षण करने के लिए तंत्रिका ट्रंक के नीचे एक छोटे से भूरे रंग के मंच रखें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान में तरल पैराफिन गर्मी और फाइबर की सतह के सुखाने को रोकने के लिए तंत्रिका ट्रंक के शीर्ष पर ड्रॉप। sciatic तंत्रिका के आसपास पिया मैटर रीढ़ की हड्डी और ड्यूरा मैटर निकालें.
-
रिकॉर्डिंग सत्र
- रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के रूप में एक प्लैटिनम फिलामेंट (व्यास में 29 डिग्री मी) का चयन करें। आसान मोल्डिंग के लिए पर गर्मी, और बहुत अंत में एक छोटा सा हुक बनाएँ. इलेक्ट्रोड आवश्यक के रूप में स्थानांतरित करने के लिए एक micromanipulator करने के लिए इलेक्ट्रोड संलग्न करें।
- स्नान में, आसन्न subcutaneous ऊतक में एक संदर्भ इलेक्ट्रोड जगह है. रीढ़ की हड्डी ड्यूरा और पिया मैटर को विभाजित करें। रिकॉर्डिंग पूल में एक एकल फाइबर (15-20 मीटर व्यास में) में sciatic तंत्रिका अलग. फिर, एक्सॉन का एक अच्छा फसले उठाओ और 25x आवर्धन पर एक स्टीरियोस्कोप के तहत रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के हुक पर एक्सॉन के निकट अंत को निलंबित कर दिया।
नोट: बस-विच्छेदित फिलामेंट मोटा हो जाते हैं और एक इकाई को रिकॉर्ड किए जाने तक आगे पृथक्करण की आवश्यकता होती है। - एक यांत्रिक उत्तेजना का उपयोग कर एक nociceptive सी फाइबर के ग्रहणशील क्षेत्र की पहचान (वॉन फ्राय बाल) और थर्मल उत्तेजना (50-55 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ छोटे कपास की गेंद). संक्षेप में, यदि तंत्रिका फाइबर की फायरिंग यांत्रिक उत्तेजनाओं और गर्म पानी का जवाब है, तो यह एक polymodal nociceptive सी फाइबर4के रूप में विचार करें. इसके बाद, विद्युत उद्दीपकों की सुपुर्दगी के लिए अभिज्ञात क्षेत्र की त्वचा में दो सुई उद्दीपक इलेक्ट्रोड (2 मिमी अंतराल) सम्मिलित कीं।
- आस्टसीलस्कप पर क्रिया क्षमता की तरंग को प्रदर्शित करें तथा स्पाइक्स को बढ़ाना और रिकॉर्ड करने के लिए 20 kHz की संकेत प्रतिचयन दर के साथ एक कंप्यूटर A/D बोर्ड को नियोजित करें.
- डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा एकत्र करें (सामग्री की तालिका) . एक कंप्यूटर पर डेटा सहेजें और पेशेवर सॉफ्टवेयर के साथ बाद में विश्लेषण (सामग्री कीतालिका).
3. आचार विफलता का मापन
- विभिन्न आवृत्तियों में दोहराव विद्युत उत्तेजनाओं (0.8 एमएस अवधि, 1.5x दहलीज तीव्रता) उद्धार (2 हर्ट्ज, 5 हर्ट्ज, 10 हर्ट्ज) के लिए एक सी फाइबर के लिए 60 s4,8,9. फाइबर उत्तेजनाओं के बीच आराम करने के लिए एक 10 मिनट अंतराल की अनुमति दें. वितरित दोहराव उत्तेजना दालों की संख्या के लिए विफलताओं की संख्या के अनुपात की गणना और चालन विफलता की डिग्री प्राप्त करने के लिए 100% से गुणा.
4. Sciatic तंत्रिका के साथ संलग्न Iintact डीआरजी की तैयारी
- शल्य चिकित्सा उपकरण और रिंगर के extracellular समाधान तैयार के रूप में चरण 2.1 में वर्णित है.
- संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ डीआरजी अलग करें.
- कदम 2.2 में वर्णित के रूप में चूहों Anesthetize (दिन 3 से 7 CFA इंजेक्शन के बाद). पीठ और पैर पर बाल काट कैंची के साथ, और आयोडीन की मिलावट के साथ त्वचा बाँझ.
- DRG जोखिम के लिए, पहले कटौती L4 में वापस के midline से L5 खंड स्तर पर त्वचा खुला. मांसपेशियों को निकालें, रीढ़ की हड्डी की प्रक्रिया, कशेरुक बोर्ड, और अनुप्रस्थ प्रक्रिया रीढ़ की हड्डी और DRG शरीर का पर्दाफाश करने के लिए एक हड्डी rongeur का उपयोग कर. तंत्रिका गतिविधि को बनाए रखने के लिए सामान्य रिंगर के extracellular समाधान द्वारा घुसपैठ कपास के साथ उजागर रीढ़ की हड्डी और DRG कवर. रक्तस्राव बंद करो और समय पर रक्त साफ.
- दो दिशाओं से sciatic तंत्रिका का पर्दाफाश: नेत्र कैंची का उपयोग कर कशेरुक फोरमेन के ऊपर S4 S1 हड्डी संरचना को हटाने के लिए DRG जो sciatic तंत्रिका के निकट अंत में है से जुड़े रीढ़ की हड्डी तंत्रिका का पर्दाफाश. मध्य जांघ पर sciatic तंत्रिका का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को खोलने के कट. अलग और तंत्रिका जहां यह मांसपेशियों के अंदर चला जाता है के दूर अंत से sciatic तंत्रिका डिस्कनेक्ट, और काटने से पहले तंत्रिका के अंत में शल्य चिकित्सा लाइन के साथ तंत्रिका ट्रंक ligate.
- तंत्रिका लिगेशन बिंदु के उठाने के माध्यम से नेत्र कैंची का उपयोग कर अंतर्निहित संयोजी ऊतक से sciatic तंत्रिका अलग. रीढ़ की हड्डी से ड्यूरा निकालें और पृष्ठीय जड़ उठाने के माध्यम से अंतर्निहित संयोजी ऊतक से डीआरजी को अलग करें जब तक कि यह शटाक तंत्रिका के आसन्न भाग तक नहीं पहुंच जाता। इस प्रकार, एक संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ DRG की पूरी तैयारी को अलग.
- डीआरजी की सतह को साफ़ करें।
- ध्यान से 4x आवर्धन पर एक स्टीरियोस्कोप के तहत tweezers का उपयोग कर L4-L6 DRG की सतहों पर रीढ़ की हड्डी ड्यूरा हटा दें।
- एक ग्लास ट्यूब में संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ DRG प्लेस मिश्रित एंजाइमों के 1 एमएल युक्त (0.2% प्रोटीनेज और 0.32% collagenase) और 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पचा (5 मिनट के अंतराल पर एक प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ थोड़ा कम).
- लिगिंग लाइन के अंत को उठाएं और एंजाइम को धोने के लिए एक सामान्य रिंगर के extracellular समाधान से भरा पकवान के लिए तैयारी को स्थानांतरित करें। फिर पजे हुए DRG को एक कंटेनर में स्थानांतरित करें (चित्र 1क) रिकॉर्डिंग के लिए ऑक्सीजनयुक्त रिंगर के अतिरिक्त कोशिकीय विलयन से भरा हुआ है।
- रिकॉर्डिंग सत्र
- इंट्रासेल्यूलर घोल तैयार करें (एम.एम.: पोटेशियम ग्लूकोनेट 120, केसीएल 18, एमजीसीएल2 2, एथिलीन ग्लाइकोल-बिस(जेड-एमिनोएथिल ईथर)-एन,एन,एन',एन'-टेट्रासेटिक एसिड [ईजीटीए] 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1H; p.20m और m.30m)। उपयोग होने तक 0 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एक टुकड़ा लंगर का उपयोग कर गैंगलिया स्थिर और एक चूषण उत्तेजक इलेक्ट्रोड के लिए तंत्रिका अंत कनेक्ट (चित्र 1ए)। कल्पना और 40x आवर्धन पर एक पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ एक DRG न्यूरॉन का चयन करें.
- एक इलेक्ट्रोड खींचो (सामग्री की तालिका) और यह intracellular समाधान के साथ भरें. धारक पर इलेक्ट्रोड डालें और पिपेट में 4-7 एमजेड के अंतिम प्रतिरोध के साथ सकारात्मक दबाव लागू करें।
- सेल के पास इलेक्ट्रोड लाओ और इसे स्पर्श करें। पिपेट में एक नकारात्मक दबाव दें, एक बार जी जेड सील तक पहुंच जाने पर, झिल्ली की क्षमता को लगभग -60 एमवी पर सेट करें और फिर पूरे सेल रिकॉर्डिंग मोड स्थापित करें।
- चालन विफलता के लिए स्क्रीन करने के लिए चूषण इलेक्ट्रोड के माध्यम से sciatic तंत्रिका को 5-50 हर्ट्ज के दोहराव उत्तेजनाओं उद्धार. afterhyperpolarization क्षमता के आयाम को मापने (AHP) आधार रेखा से चोटी के लिए, और 80% AHP अवधि.
नोट: प्रसरण का एक-तरफा विश्लेषण (ANOVA; दो से अधिक समूहों के लिए) या छात्र के t-परीक्षण (केवल दो समूहों के लिए) डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया था। डेटा का अर्थ है - मतलब (SEM) के मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण स्तर पर पी एंड एलटी; 0.05 पर स्थापित किया गया था।
- प्रयोग समाप्त करना
- जब प्रयोगात्मक कार्य समाप्त हो गया है, जबकि चूहों संवेदनाहारी स्थिति के तहत अब भी कर रहे हैं, चूहों मानवीय रूप से अधिक मात्रा में pentobarbital सोडियम के एक intracardiac इंजेक्शन के साथ ethanized हैं.
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Representative Results
एकल फाइबर रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल के परिणाम फाइबर विच्छेदन की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. विवो प्रयोगों में पशु के लिए एक अच्छी स्थिति में होना चाहिए आसान विच्छेदन के लिए तंत्रिका ट्रंक स्वस्थ रखने के लिए (चर्चा अनुभाग में सलाह देखें). एक दवा आवेदन स्नान फाइबर पर दवा वितरण के लिए कई मामलों में की जरूरत है. चित्र 1 यह दर्शाता है कि किस प्रकार इन विवो एकल-फाइबर अभिलेखन का प्रचालन किया गया (चित्र 1क) तथा सीएफए-उपचारित जंतुओं की शकिती तंत्रिका से एक शास्त्रीय अभिलेखन प्रस्तुत करता है (चित्र 1ख)
निम्नलिखित प्रयोगों ने सीएफए-उपचारित पशुओं में चालन विफलता के अस्तित्व की जांच की। इस जांच धारणा है कि nociceptive सी फाइबर के साथ चालन विफलता एक आम घटना थी पर आधारित था, और चालन विफलता की डिग्री काफी hyperalgesia की शर्तों के तहत क्षीण किया गया था, जो हमारे द्वारा समर्थित हैं पिछले अध्ययन4,8,9,12. चित्र 2क दर्शाता है कि सामान्य जंतुओं में सी-फाइबर चालन विफलता देखी गई थी। तथापि, नियंत्रण की तुलना में पैर में सीएफए इंजेक्शन के बाद सीएफए-प्रेरित हाइपरएल्जिया की स्थापना के बाद चालन विफलता की डिग्री काफी कम हो गई थी (चित्र 2ख)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि दर्द से संबंधित polymodal nociceptive सी फाइबर के चालन विफलता भड़काऊ दर्द के सीएफए मॉडल में क्षीण है.
चालन विफलता के दौरान इंट्रासेल्यूलर तंत्र की जांच करने के लिए, संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी का उपयोग किया गया था (चित्र 3क,बी) चित्र 3C से पता चलता है कि उत्तेजना श्रृंखला के भीतर, दोहराए उत्तेजनाओं के जवाब में spikes पिछले के बाद hyperpolarization क्षमता (AHP) पर ढेर और निम्नलिखित AHP की बढ़ती ढलान में कमी के परिणामस्वरूप (चित्र 3C,डी ). छोटे DRG न्यूरॉन्स में AHP की उपस्थिति संभावित hyperpolarization सक्रिय सक्रिय, चक्रीय न्यूक्लिओटाइड-मॉडुलित (HCN) चैनल13,14,15. AHP का संचयी प्रभाव चालन विफलता की घटना में एक भूमिका निभाता है. इसलिए, हम hypothesized है कि HCN चैनलों अवरुद्ध काफी चालन विफलता प्रभाव में वृद्धि होगी. निम्नलिखित प्रयोग HCN चैनलों के एक अवरोधक का इस्तेमाल किया, $D7288. सतत रिकॉर्डिंग एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से $D7288 की उपस्थिति में चालन विफलता में वृद्धि का पता चला. इनसेट निर्दिष्ट अंतरालों के लिए विस्तृत अंश दिखाते हैं. सीएफए उपचारित पशुओं के छोटे डीआरजी न्यूरॉन्स में चालन विफलता और एएचपी की बढ़ती ढलान के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध देखा गया (चित्र 3E)।
चित्रा 1: चूहे sciatic नसों के vivo एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में. (A) एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए क्षेत्रों का संकेत एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के Schematic आरेख (आर) (रिकॉर्डिंग के लिए एक फिलामेंट बंटवारे से पहले, पिया मेटर रीढ़ की हड्डी और ड्यूरा मेटर यहाँ हटा दिया गया), दवा आवेदन (डी), उत्तेजना (एस), और सीएफए की साइट इंजेक्शन. (बी) एक sciatic एकल फाइबर एक टॉनिक फायरिंग पैटर्न का प्रदर्शन के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग. यह आंकड़ा वांग एट अल से संशोधित किया गया है9कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: सीएफए इलाज चूहों में आचरण विफलता नियंत्रित चूहों की तुलना में क्षीण किया गया था. (क) 10-Hz विद्युत उत्तेजना के जवाब में नियंत्रण चूहों से एकल सी फाइबर फायरिंग की मूल लगातार रिकॉर्डिंग. हर 20 वीं स्वीप दिखाया गया है (लगातार स्वीप 2-s अंतराल पर थे) और ऊपर से नीचे प्रदर्शित किया. इनसेट एक प्रतिनिधि कार्रवाई क्षमता दिखाता है. (बी) पैनल ए के रूप में एक ही उत्तेजना के जवाब में सीएफए इंजेक्शन चूहों से एकल सी फाइबर की रिकॉर्डिंग. यह आंकड़ा वांग एट अल9से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी का उपयोग कर सी फाइबर चालन विफलता के मापन. ((ए) डी आर जी की तैयारियों की स्थापना और नियुक्ति का चित्रण करते हुए योजनाबद्ध आरेख। एसई: उत्तेजना इलेक्ट्रोड; एस.एन.: sciatic तंत्रिका; एफएम: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप; RE: रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड. (बी) पूरे DRG नमूना एक 40x दृश्य के तहत मनाया, एक microelectrode (सही छाया) एक छोटे DRG न्यूरॉन पैचिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. (ग) सीएफए-उपचारित चूहों से एक छोटे-व्यास डीआरजी न्यूरॉन में नियंत्रण स्थितियों या विभिन्न सांद्रता के प्रशासन के तहत 5-Hz उत्तेजना के लिए श्रृंखला फायरिंग प्रतिक्रियाओं की सतत रिकॉर्डिंग। इनसेट निर्दिष्ट रिकॉर्डिंग अवधियों के लिए विस्तृत अंश दिखाते हैं. काले धब्बे स्पाइक विफलताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (घ) एएचपी की बढ़ती ढलान को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि निशान। बढ़ती ढलान अधिकतम और न्यूनतम AHP voltages (mV) अवधि के आधार पर विभाजित के बीच आयाम अंतर के बराबर था (उत्तेजनाओं के अंतराल, सेकंड में). बाएँ पैनल एक बड़ा बढ़ती ढलान दिखाता है (पैनल सी में पहली ट्रेस से "*") के साथ चिह्नित, और सही पैनल एक छोटे बढ़ती ढलान से पता चलता है (पैनल सी में चौथे ट्रेस से "$") के बाद $D7288 आवेदन (125 $M). (ई) चालकीय विफलता की डिग्री और $D7288 की विभिन्न सांद्रता के जवाब में AHP की बढ़ती ढलान के बीच संबंध. * और $ पी एंड एलटी; 0.05 बनाम नियंत्रण। यह आंकड़ा वांग एट अल9से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हालांकि हाल के अध्ययनों से विवो16में DRG न्यूरॉन्स के कैल्शियम इमेजिंग हासिल की है, व्यक्तिगत DRG nociceptors से vivo पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन बेहद चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. इसलिए, दर्द के क्षेत्र के लिए एक में विवो एकल फाइबर दृष्टिकोण निरंतर महत्व का है. वर्तमान प्रोटोकॉल में एकल फाइबर रिकॉर्डिंग चालन विफलता घटना के उद्देश्य अवलोकन की अनुमति है, और वर्तमान अध्ययन में विकसित पूर्व vivo तैयारी के साथ इस तकनीक के संयोजन में अंतर्निहित तंत्र की परीक्षा की अनुमति देता है पूर्व नैदानिक मॉडल में nociceptor उत्तेजना परिवर्तन. एकल फाइबर रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल के तीन कदम सफल रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं. सबसे पहले, यह जानवर की संज्ञाहरण पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है. विवो रिकॉर्डिंग प्रयोगों में विस्तृत में, पतली फाइबर है कि चारों ओर लपेटा जाता है की लंबाई 29 डिग्री प्लैटिनम इलेक्ट्रोड केवल 2-3 मिमी है, जो आसानी से रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान हस्तक्षेप किया है. यदि संवेदनाहारी स्थिति विशेष रूप से स्थिर नहीं है, जानवरों के छोटे आंदोलनों electrophysiological गतिविधियों की रिकॉर्डिंग विफलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दूसरा, तैयारी लगातार पैराफिन के साथ कवर किया जाना चाहिए. इस हेरफेर का उद्देश्य फाइबर की गतिविधि को बनाए रखने के लिए है. एक उपयुक्त रिकॉर्डिंग स्लॉट आम तौर पर जानवरों की त्वचा का उपयोग कर निर्माण किया गया था. पैराफिन तेल रिसाव को रोकने के लिए, स्लॉट की दीवार सुपर गोंद का उपयोग कर मजबूत किया जा सकता है, और पैराफिन तेल जब भी आवश्यक जोड़ा जाना चाहिए। फाइबर पूरे परीक्षण के दौरान शुष्क नहीं कर सकते. अंत में, तंत्रिका ट्रंक के आसपास के वातावरण को स्वस्थ बनाए रखा जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग क्षेत्र के आसपास हमेशा कुछ बहाव तरल मौजूद है, और इस बहाव अच्छी गुणवत्ता रिकॉर्डिंग के लिए एक बाधा है। फाइबर गतिविधि के आयाम गिरावट जारी रहेगा और अंततः चरम आधारभूत शोर से अविवेच्य हो जाते हैं, जो एक रिकॉर्डिंग विफलता का कारण बनता है. एक घर का सिरिंज ट्यूब बाहर बहाव तरल चूसना करने के लिए स्लॉट के नीचे गहरी तक पहुँचने के लिए आवश्यक है। कभी-कभी, नमकीन में भिगोई हुई अर्धशुष्क कपास की गेंद भी उपयोगी होती है।
वर्तमान अध्ययन में, सीएफए मॉडल लागू किया गया था जो सीएफए इंजेक्शन के बाद पैर सूजन और hyperalgesia पैदा करता है। परिधीय afferent निर्वहन के गुणों के साथ ही अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए, प्रयोग में कोई एनाल्जेसिक का उपयोग नहीं किया गया, जो दर्द अनुसंधान में एक नियमित अभ्यास है और आईएसयूसी/एथेसिस समिति द्वारा अनुमोदित किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में एक विवो एकल फाइबर रिकॉर्डिंग तकनीक का परिचय संचरण प्रक्रिया में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए जो दोहराए जाने वाले विद्युत उत्तेजनाओं के साथ प्रदान की nociceptive सी फाइबर में पाए जाते हैं। यह दिखा दिया गया था कि चालन विफलता की डिग्री काफी hyperalgesic स्थितियों में क्षीण किया गया था, लेकिन हम पैच-क्लैम्पिंग में तकनीकी कठिनाइयों की वजह से एकल फाइबर रिकॉर्डिंग का उपयोग कर अंतर्निहित तंत्र की जांच नहीं कर सका सी-फाइबर। इसलिए, चालन विफलता और छोटे व्यास DRG न्यूरॉन्स की झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के बीच संबंधों की जांच संलग्न ciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी का उपयोग कर पाया गया. एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के बजाय, ऐसी तैयारियों का उपयोग कर पैच-क्लैम्प चालन विफलता के उत्पादन के लिए एएचपी-निर्भर तंत्र की पड़ताल करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हालांकि केवल कुछ सतह न्यूरॉन्स का चयन किया जा सकता है, DRG न्यूरॉन्स के स्तर पर चालन विफलता की डिग्री अभी भी दर्ज किया जा करने में सक्षम था, यहां तक कि दवा प्रशासन के साथ.
डीआरजी में दो बाहरी झिल्ली होती हैं: पिया मैटर मेरुदण्डऔर ड्यूरा मैटर। ड्यूरा मेटर को हेयरस्प्रिंग टमगरज का उपयोग करके हटाया जाना चाहिए, और पिया मैटर मेरुलिस को पचाया जाना चाहिए (मॉडरेट पाचन, एकल डीआरजी कोशिकाओं के अलगाव में उपयोग की गई श्रृंखला के रूप में नहीं) यह सुनिश्चित करने के लिए कि पैच-क्लैम्प इलेक्ट्रोड डीआरजी कोशिकाओं की सतह तक पहुंच सकते हैं। एक मुहर; अन्यथा, यह पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए असंभव है। वर्तमान दृष्टिकोण और अधिक पूरी तरह से DRG प्लस तंत्रिका के स्लाइस की तुलना में परिधीय तंत्रिका इनपुट को बरकरार रखता है और यह सुनिश्चित करता है कि DRG न्यूरॉन्स के पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग आसानी से हासिल की है. इस प्रोटोकॉल में दर्द से संबंधित परिधीय तंत्रिका तंत्र की समझ में सुधार करने के लिए व्यापक आवेदन की संभावनाएं हैं, जैसे विभिन्न पुराने दर्द मॉडल में विभिन्न डीआरजी न्यूरॉन्स में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन की जांच17 ,18 और आण्विक तंत्र डीआरजी में असामान्य सहज गतिविधि के अंतर्निहित होते हैं , जिसमें मायलिनित या अमाइलिनित एक्सॉन19,20.
संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी यहाँ प्रस्तुत पारंपरिक dissociated गुच्छिका विधि की तुलना में कई फायदे हैं, क्योंकि DRG की संरचना मूल रूप से इस तैयारी में अटूट बनी हुई है. इसलिए, यह विवो में वास्तविक स्थितियों simulates और शारीरिक गतिविधि के लिए एक बेहतर microenvironment प्रदान करता है. संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी अलग DRG तैयारी की तुलना में कम न्यूरॉन क्षति पैदा करता है क्योंकि बाद की प्रक्रिया अधिक पाचन एंजाइमों और बाहरी शारीरिक कार्यों का उपयोग करता है (उदा., कतरनी और कोशिकाओं के उड़ाने), जो कोशिकाओं को और अधिक नुकसान का कारण बनता है. अधिकांश इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन अभी भी अलग डी आर जी न्यूरॉन्स21,22पर प्रदर्शन कर रहे हैं , और वियोजन प्रक्रिया ही कोशिकाओं को नुकसान, जो न्यूरॉन्स के असामान्य hyperexcitations में परिणाम23. इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि extracellular afferent electrophysiological गतिविधियों भी प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि तंत्रिका अनुमानों रहते हैं, जो afferent spikes और दैहिक DRG सहज के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है निर्वहन. अंत में, इस तैयारी DRG न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं को बरकरार रखता है, और केवल DRG न्यूरॉन्स वियोजन प्रोटोकॉल में रहते हैं. उपग्रह ग्लिल कोशिकाओं, जो DRG के microenvironment बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं, एक बाधा है कि व्यक्तिगत DRG न्यूरॉन्स24की रक्षा कर रहे हैं, और इन कोशिकाओं को आगे के अध्ययन वारंट.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671089 और 81470060) और Shaanxi प्रांतीय सामाजिक विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना (2016SF-250) से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
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