Summary
في هذا الأسلوب، يتم الأنسجة الجنينية القلب جراحيا ميكروديسيكتيد، نات، والمسمى فلوريسسينتلي وزرعها في الأنسجة الجنينية المضيف. وهذا يوفر منبرا لدراسة منظمة إنمائية مستوى الفرد أو الأنسجة تحت الظروف الفسيولوجية حمل خارج الرحم، و/أو تغيير البيئات باراكريني/جوكستاكريني.
Abstract
تفسير الأثر النسبي للخلية الزخرفة المتمتعة بالحكم الذاتي مقابل الخارجية تأثير ميكرونفيرونمينتال على تحديد النسب خلية يمثل تحديا عامة في بحوث علم الأحياء التنموي. في قلب الجنين، وهذا يمكن أن تكون صعبة للغاية كالاختلافات الإقليمية في التعبير عن النسخي المنظمين والعظة مما يشير إلى باراكريني/جوكستاكريني، والقوة الفسيولوجية كلها معروفة للتأثير على نضوج كارديوميوسيتي. أسلوب مبسط لتغيير المكروية الجزيئي والنشاط الحيوي في كارديوميوسيتي النامية، لذلك، بمثابة تقنية قوية لدراسة كيفية المحلية مصير الخلية تأثير الظروف والدالة. لمعالجة هذه المشكلة، نحن قد أسلوب الأمثل لزرع cardiomyocytes الأحداث فعلياً إلى مواقع خارج الرحم في القلب أو الأنسجة الجنينية المحيطة. وهذا يسمح لنا دراسة تأثير الظروف كيف ميكرونفيرونمينتال كارديوميوسيتي مصير التحولات في قرار وحيد الخلية داخل الجنين سليمة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي myocytes الجنينية يمكن معزولة عن مجموعة متنوعة من المجالات الفرعية القلب، فصل، المسمى فلوريسسينتلي، وميكروينجيكتيد إلى الأجنة المضيفة بدقة عالية. الخلايا يمكن ثم مباشرة تحليلها في الموقع باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير وغذائها. هذا البروتوكول هو بديلاً قويا لتجارب التطعيم التقليدية التي يمكن أن تكون صعبة باهظة في نسيج تتحرك مثل القلب. المخطط العام لهذا الأسلوب أيضا يمكن تكييفها وفقا لمجموعة متنوعة من الأنسجة المانحة والمضيفة البيئات، وسهولة الاستخدام، وانخفاض التكلفة، وسرعة تجعل من تطبيق يمكن أن تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من الدراسات التنموية.
Introduction
وقد استفاد البحوث الإنمائية القلب هائلا من ظهور نظم نموذجية وراثيا germline التي حددت العديد من الشبكات التنظيمية الجينات أن نمط خلية مختلفة الأنساب والمجالات الوظيفية في القلب. ومع ذلك، تحديد كيفية التفاعل مع هذه الشبكات الجينات وتستجيب لشروط ميكرونفيرونمينتال، بما في ذلك إشارات باراكريني/جوكستاكريني والمدخلات البيولوجية الفيزيائية (الامتداد، سلالة، تدفق الفسيولوجية)، يمكن أن يكون تحديا. على هذا النحو، ليست دائماً سهلة لتحديد ما إذا كان النمط الظاهري خلوية ينشأ كنتيجة مباشرة لاضطراب وراثية أو نتيجة ثانوية للتكيف التغيرات في الميكانيكا الحيوية القلب أو أعلى ترتيب الأنسجة تكوين1،2 .
تطعيم التجارب، التي استخدمت تقليديا لمعالجة المفاهيم لتحديد مصير، الالتزام والاستقراء، واختصاص3،4، تمثل نهج مثالي للتحايل على بعض التحديات الكامنة في تحديد خلية مستقلة مقابل التأثير البيئي في القلب. ولسوء الحظ، تقلصات القلب تجعل من الصعب النهج تطعيم القياسية. التحرك السريع للأنسجة كثيرا ما يمنع الخلايا المطعمة من التمسك بالقلب والأنسجة كبير مدبب (مطلوب عادة لتطعيم) كثيرا ما يؤدي إلى فشل القلب والفتك الجنينية5،،من67. ولذلك، قمنا بتطوير القائم على الضغط، وصف نظام microinjection لغرس الخلوية الدقة إلى قلب الفرخ النامي، التحايل على العقبات التقنية لتطعيم الأنسجة سابقا8،9. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ميكروينجيكتيد المجموعات الفردية أو الصغيرة من خلايا القلب معزولة عن جنينا الجهات مانحة في مجموعة متنوعة من المناطق المضيفة الجنينية قلب القضاء على الحاجة إلى إعداد المضيف واسعة النطاق والشتائم الأنسجة الكبيرة التي تنشأ باستخدام تقنيات التطعيم القياسية. قد تستخدم هذه الدراسات غرس الإبر microinjection قطر خارجي ل ~ مكم 30−40، مما يعني أنه يمكن وضع الإبرة في النسيج المستهدف مباشرة (أي، يمكن اختراق الجدار الجنينية احتشاء عضلة القلب) ويمكن تسليمها خلايا فوكالي مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة. يمكن استخدام البروتوكول تنفيذ مجموعة متنوعة من النظائر المشعة، هيتيروتوبيك، إيسوتشوريك، والتلاعب هيتيروتشرونيك، توفير نهج سريعة ومرنة، والتكلفة المنخفضة لمباشرة دراسة نماذج الجنينية التجريبية التقليدية في البلدان النامية القلب أربع غرف.
في البروتوكول المبينة أدناه، يمكننا تسمية الجهات المانحة الخلايا مع صبغة فلورسنت بيرمينت خلية، التي تسمح بنجاح تجربة microinjection من أجل رصد في الوقت الحقيقي، وموقع انجرافتيد الخلايا تكون موثقة دون الحاجة إلى أي إضافية تلوين. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا النهج الأنسب لإجراء التجارب على المدى القصير (حوالي 48 ساعة) صبغة الفلورسنت يمكن أن تضيع من خلال انقسام الخلية. يمكن استخدام نهج بديلة لإجراء التجارب على الأجل الأطول.
بينما نحن تقديم هذه التقنية في سياق التنمية القلب، استخدمنا أنه تأثير كبير لتجارب زرع خلية إلى mesoderm، والرأس، وأطرافه، وسميتس. هذا النهج الأساسي المبين أدناه هو درجة عالية من المرونة ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من نظم الجهاز.
Protocol
جميع الأساليب المذكورة التقيد بالمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان من "جامعة شمال كارولاينا" في تشابل هيل.
1-إعداد الماصات الدقيقة-حقن
- سحب الشعيرات الزجاج باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي. تجليف إبرة يوصي لبعض الحقن، كما أنه يوفر سطح حاد جداً خالية من الشوائب الهيكلية. للقيام بذلك، البولندية نهاية إبرة سحبت على عجلة الشطف بزاوية مقدارها 45 درجة لمدة دقيقة 15−20.
ملاحظة: إعدادات الضبط لسحب تتنوع استناداً إلى ساحبة المستخدمة. يجب أن يكون القطر الداخلي النهائي المجسم مشطوف الحواف بين مكم 20−40. - معطف السطوح الداخلية والخارجية من الزجاج الشعرية مع سيليكون. أولاً تراجع الإبر في عامل سيليكونيزينج معطف السطح الخارجي لابره ومن ثم باكلواد الحل وكيل سيليكونيزينج في كل ميكروبيبيتي معطف السطح الداخلي.
ملاحظة: ينبغي طلاء من الشعيرات الدموية الزجاج 24 ساعة قبل التجربة غرس. طلاء الزجاج الشعيرات الدموية مع سيليكون يوفر سطح خاملة كيميائيا للزجاج. إذا تركت الشعيرات الدموية دون علاج، ستلتزم بالزجاج وتوصيل الإبرة تعليق الخلية التي تم إنشاؤها في الخطوات اللاحقة. ولذلك، طلاء ضروري وحيوي لنجاح هذه الطريقة.
تنبيه: عامل سيليكونيزينج خليط متوفر تجارياً جاهزة هيبتان و 1.7-ثنائي-1,1,3,3,5,5,7,7-أوكتاميثيلتيتراسيلوكساني (جدول المواد). وسريعة الاشتعال للغاية وشديدة السمية. دائماً التعامل مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة داخل غطاء دخان.- باكلواد الإبرة، تحميل ~ ميليلتر 5−10 وكيل سيليكونيزينج في تلميح ماصة الصغرى-حقن (جدول المواد). ضع نصيحة الحقن الدقيقة في نهاية نطاق واسع من الزجاج سحبت الشعرية وموقف التلميح حتى أسفل قدر الإمكان (بالقرب من الحافة إبرة الزجاج). إخراج عامل سيليكونيزينج أثناء إزالة ماصة تحميل ببطء للتقليل من فقاعات الهواء في الإبرة.
- ترك عامل سيليكونيزينج في الإبرة الزجاجية لمدة 10 دقائق وإزالة بواسطة يسفط مع ماصة تحميل جديدة والسماح بالإبر الجافة بين عشية وضحاها في غطاء دخان.
- شطف الزجاج الشعيرات الدموية بالمياه بعد الإجراء في الخطوة 1.2 صباح اليوم للتجربة، والسماح الجاف ح 3−4.
2-إعداد الحلول
- إعداد 5 مل من تحييد الحل بتكميل مل 4.2 المتوسطة تعديل النسر دولبيكو ومزيج في لحم الخنزير المغذيات F12 (DMEM/F12) مع 750 ميليلتر من مصل البقر الجنين (FBS) و 50 ميليلتر من البنسلين/ستربتوميسين التربسين. تخزين في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 5 ميكرومتر وسم صبغ الحل قبل بيبيتينج ميليلتر 5 المخزون 1 ملم وسم صبغ (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]]، الجدول للمواد) إلى 995 ميليلتر من هانك لموازنة الحل الملح (حبس). دوامة 1 دقيقة ومخزن في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد بارافورمالدهيد الطازجة (PFA) عن طريق الجمع بين 10 مل من 32% PFA حل الأسهم مع 62 مل من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية ومل 8 من 10 × الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). أن تركيز النهائي هو 4% الأرجنتينية في 1 x DPBS.
3-إعداد الأجنة المضيفة
- احتضان بيض الدجاج الخصبة في اتجاه أفقي في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية حتى همبرغر وهاملتون (ح ح) 19 المرحلة10.
ملاحظة: المرحلة التي اختيرت للتلاعب بالمرونة ويعتمد كلياً على أهداف كل تجربة فردية. - نقاط نهاية "مسطح" شل البيض على طول خط الاستواء البيض باستخدام الملقط الزاوية جعل ثقب صغير > 1 ملم في القطر. إدراج إبرة ز 18 مع حقنه 10 مل المرفقة من خلال ثقب وإزالة ~ 5 مل الزلال.
ملاحظة: هذا الموقع التشريحية الخارجية إلى "خلية الهواء" داخل البيضة ويحافظ الزلال من تسريب لمجرد الثقب. يوصي بهذه الخطوة كما أنها "قطرات" الجنين بعيداً عن شل البيض، الحيلولة دون احتمال حدوث تلف في الخطوات اللاحقة. - تطبيق الشريط الشفاف إلى الجزء العلوي من وعاء البيض. نقاط مع الملقط الزاوية وقطع نافذة سم ~2.5 باستخدام مقص تينوتومي منحنية.
- افحص ومرحلة الجنين استناداً إلى معايير وضعتها همبرغر وهاملتون10 وختم الثقب من الخطوة 3.2 بشريط شفاف.
ملاحظة: هنا، المرحلة 19 سمو أجنة تستخدم لها سميتس 37−40 تمتد إلى مهدها الذيل. لا تكون مختومة الثقب حتى بعد أن يتم فتح النافذة على طول الجزء العلوي من البيض (الخطوة 3، 3). - حقن ~ 200 ميليلتر من خليط الحبر الهند/هبس (1:5) تحت الجنين باستخدام إبرة ز 32 مع المحاقن المرفقة 1 مل.
ملاحظة: توفر الحبر الهند البصرية والتباين بين الجنين وصفار البيض تحت. الأصباغ البديلة مثل محايدة أحمر أو المتاحة تجارياً السماوي الفلورسنت البروتين (CFP) أو مجموعات التصفية fluorescence البروتينات الفلورية الزرقاء (حزب الحرية) يمكن استخدامها لتحسين التباين. - أضف 1 مل حبس dropwise على القرص الجنيني وختم قذائف إطارات مع الفيلم البارافين. وضع البيض مرة أخرى في حاضنة هوميديفيد حتى جاهزة للحقن.
4-عزل الأنسجة المانحين
- احتضان بيض الدجاج خصبة المانحين في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية حتى مرحلة سمو 19 (أو المرحلة المطلوب).
- إزالة الجنين من البيض ووضعه في طبق بتري 100 ملم × 15 ملم تحتوي على حبس العقيمة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- جراحيا ميكروديسيكت المانحة أذينية الأنسجة من كل جنين أولاً عزل قلب الجنين كامل من الجنين وثم عزل اتريا من القلب باستخدام الملقط، والمقص تينوتومي وميكروسباتولا تحت ستيريو تشريح مجهر. تجمع في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل يحتوي على 1 مل حبس على الجليد.
- بمجرد قد تم جمع جميع المانحين الأنسجة، بيليه الأنسجة بالطرد المركزي في 1000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في ميكروسينتريفوجي زاوية ثابتة.
5-التربسين هضم الأنسجة المانحين
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل بريوارميد 0.05% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة حرارة اهتزاز 300 لفة في الدقيقة. بدلاً من ذلك، استخدام حمام مائي مع الإثارة الدورية للعينة.
- "الماصة؛" الحل الهضم صعودا وهبوطاً لتفريق أي الأنسجة المتبقية، وبيليه كما في الخطوة 4، 4.
- ريسوسبيند بيليه في 1 مل التربسين تحييد الحل وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 4، 4.
- ريسوسبيند الخلايا في 400 ميليلتر من الأحمر نيون وسم الحل صبغ واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في كتلة حرارة. بدلاً من ذلك، استخدام حمام مائي.
- بمجرد الانتهاء من وضع العلامات رد فعل بيليه الخلايا كما في الخطوة 4، 4 وتغسل مع 1 مل حبس (عدد غسل خطوات يمكن أن تختلف بين 1 و 3).
- ريسوسبيند الخلايا المسمى، والأعلاف بتركيز ~ 50,000 الخلايا/ميليلتر، مما يؤدي عادة في مجلد 5−10 عامل ميليلتر تبعاً للخلية إجمالي العائد.
ملاحظة: يمكن أن يسفر عن تركيزات خلية أسفل ~ 50,000 الخلايا/ميليلتر حقن ضعف الكفاءة.
6-في فيفو حقن
- باكلواد تعليق خلية في سيليكون زجاج معالجة ماصة شعرية اتباع الإجراءات المذكورة في الخطوة 1.2. جبل الماصة في جهاز ميكروينجيكتور الضغط.
- إزالة الأجنة المضيفة من حاضنة هوميديفيد ووضعه في حائز بيض تحت الاستريو الفلورسنت تشريح مجهر.
- فتح الغشاء فيتيلين استخدام الملقط غرامة العقيمة وجعل شق صغير (~0.5−1.0 ملم في الطول) في تامور. قد تكون هناك حاجة إضافية التلاعب/تشريح تبعاً للمنطقة المستهدفة للحقن.
- ضع ميكروينجيكتور أن طرف الإبرة microinjection تخترق الأنسجة المستهدفة.
- ضغط حقن الخلايا، واستخدم التسمية الفلورسنت لتحديد أن مزروع خلايا موجودة في الأنسجة المرجوة. لحقن نموذجي، تطبيق نبضات واحد أقل من 0.5 s في مدة تتراوح ما بين 100-400 درجة في الضغط.
ملاحظة: طول النبض والضغط المطلق سوف تختلف تبعاً لعدد الخلايا بالحقن ويمكن تعديلها لتناسب الاحتياجات الفردية. - التراجع عن جهاز ميكروينجيكتور، وإزالة البيض من الحامل بعد ضغط الحقن.
- ضغط حقن الخلايا، واستخدم التسمية الفلورسنت لتحديد أن مزروع خلايا موجودة في الأنسجة المرجوة. لحقن نموذجي، تطبيق نبضات واحد أقل من 0.5 s في مدة تتراوح ما بين 100-400 درجة في الضغط.
- إضافة 1 مل حبس الحارة دروبويسي على الجنين وختم البيض باستخدام الشريط التعبئة شفافة واحتضان في الحاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية لغرس بعد 24 ساعة.
7-عزل وتحليل
- عزل الأجنة المضيفة في حبس RT باستخدام ملقط ومقص تينوتومي ميكروسباتولا مشابهة للخطوة 4.3، وإصلاح في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.
- تغسل الأجنة 3 x 5 دقيقة في حبس في الرايت مع هزاز لطيف، وتخزينها في حبس عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل المصب (الفحص المجهري، إيمونوهيستوتشيميستري، والتهجين في الموقع، إلخ.).
Representative Results
بعد ح 24 حضانة، والقلب، وتحيط أنسجة المضيف الأجنة كانت معزولة وصورت (الشكل 1أ)، والمجهزة لتحليل إيممونوفلوريسسينت. في هذا المثال، تم ميكروينجيكتيد المانحة أذينية ميوسيتيس إلى بروبيكارديوم من مجموعة نظم مماثلة الجنين. ثم كان الملون الجنين المضيف مع علامة العضلات (MF20 الأخضر) و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI؛ الأزرق). يتم حقن الخلايا (أحمر) مرئية بوضوح (الشكل 1ب). تشمل التعديلات المحتملة للنظر إذا كانت الخلايا غير مرئية: هضم الأنسجة المانحة كان أكثر (خلايا سيكون غير قادر على إرفاق)، وسم الحل صبغ كان مخفف جداً، خلايا تم غسلها المفرط، أو متعددة الخلايا الشعب أدى إلى فقدان للتسمية.
لتأكيد أنه تم حقن الخلايا في هذا المثال احتشاء عضلة القلب، ونحن بصريا مقطوع هذا الجنين باستخدام مجهر [كنفوكل] (الشكل 1ج-ه). MF20 فقط الخلايا إيجابية داخل بروبيكارديوم (PE) هي الخلايا إيجابية الأحمر نيون التي تم زرعها فوكالي.
الشكل 1 : صور الممثل الأجنة المعزولة 24 ساعة بعد الحقن. (أ) صورة برايتفيلد تضخم منخفضة لمنطقة جذع الجنين الفرخ E3.5 (سمو المرحلة 19). (ب) إظهار الصورة ممزوج حقن الخلايا (أحمر)، كارديوميوسيتيس (الأخضر)، و DAPI. كانت معزولة من الاذينين الخلايا وميكروينجيكتيد إلى بروبيكارديوم. (ج) عالية التكبير [كنفوكل] تصوير عرض المسماة الخلايا في جوهر بروبيكارديوم. (د) [كنفوكل] تضخم عالية التصوير يؤكد الأحمر CT المسماة الخلايا كارديوميوسيتيس. (ﻫ) إعادة الإعمار (3D) ثلاثي الأبعاد لحقن الخلايا من ألواح د وه. في الاذينين؛ مكتب التجارة المشروعة، المسالك إلى الخارج؛ PE، بروبيكارديوم؛ فاتو، وطين؛ MF20، الميوسين 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
القدرة على تحديد كيف ميكرونفيرونمينتال الظروف أثر خلية القلب مصير مواصفات ونسب تحقيق الاستقرار أمر أساسي لخلق فهم ضاغطة لأمراض القلب الخلقية، وكذلك فيما يتعلق بوضع بروتوكولات فعالة للسليم نضوج الخلايا الجذعية أو الخلايا الجسدية كارديوميوسيتيس على أساس ريبروجرامينج. البروتوكول المشار إليها أعلاه يعطي المحققين القدرة على مباشرة الاعتداء تطوير خلايا القلب تحت غيرت المجراة في الظروف، السماح لعمليات النضج الذاتي خلية فصله عن العظة باراكريني/جوكستاكريني و/أو الفسيولوجية. عندما جنبا إلى جنب مع تصوير عالية الدقة والتحليل الوراثي وفحوصات الفيزيولوجية، يمكن أن تكون هذه التقنية تكملة قوية للنماذج القائمة المعدلة وراثيا.
تشكل نقطة الوقوف تقنية، يعتمد البروتوكول المعروضة هنا على كفاءة العزلة ووضع العلامات، وغرس دقيقة لخلايا القلب المانحين في الأنسجة الجنينية المضيف. استخدام نظام microinjection الإيدز في استهداف الخلايا المانحة إلى حد كبير ويسمح بزرع ناجحة دون الحاجة إلى إنشاء موقع انجرافتمينت كبيرة في النسيج المضيف. بعض المهارات التشغيلية المطلوبة لتنفيذ هذا الأسلوب ومع ذلك، كما يمكن أن يؤدي انخفاض الجدوى إذا لم يتم وضع إبرة حقن بعناية في الأنسجة المستهدفة (تسبب تمزق القلب أو المفرج المحلية). كما ينبغي العناية والفكر إلى العزلة وخطوات وضع العلامات. خلال الهضم من الجهة المانحة الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى غرس ضعف الكفاءة، وعابرة وسم تقنيات يمكن أن تحد من الإطار الزمني الذي يمكن تعقب الخلايا المانحة (كما يمكن أن يضعف انقسام الخلية التسمية).
هذا الأسلوب هو الغاية قابلة للتعديل ويمكن تكييفها لأغراض متنوعة. على سبيل المثال، أن الجهات المانحة الخلايا من مجموعة كبيرة من الأنسجة ومراحل يمكن أن تكون معزولة (على الرغم من الاستفادة المثلى الهضم الأنزيمي مطلوب) ويمكن كذلك حقن مجموعة متنوعة من الأنسجة المضيف عبر مراحل مختلفة من التنمية. وبالمثل، يمكن تعديل نهج وضع العلامات لتعقب الخلايا عبر windows الزمنية المختلفة، بما في ذلك استخدام نانوكريستالس نيون أشباه الموصلات غير العضوية لوسم تعد عابرة وغرس السمان الخلايا أو الخلايا من الأخضر بروتين فلوري المحورة وراثيا (بروتينات فلورية خضراء +) المانحة الأجنة11 لوسم بيرمينت.
بينما نحن حاليا استخدام هذه التقنية للدراسات غرس إنفلونزا الطيور، ونرى أنه يمكن استخدامه لمجموعة كبيرة من الدراسات تشيميريك في المستقبل. على سبيل المثال، يمكن عزل خلايا القلب المعدلة وراثيا من الكائنات المحورة وراثيا وميكروينجيكتيد إلى قلب إنفلونزا الطيور باستخدام بروتوكول مماثل جداً. وعلاوة على ذلك، ينبع الخلايا خلايا متباينة في cardiomyocytes من أو عبر الخلية الجسمية ريبروجرامينج النهج يمكن أن يكون ميكروينجيكتيد إلى قلب الجنينية لتقييم اندماجها في النسيج و/أو النضج تحت المجراة في النشاط الحيوي شروط.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل منحة R00HL122360 من معاهد الصحة الوطنية، والوطنية القلب والرئة، والدم معهد (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
- Guo, Y. X., Pu, W. T. Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research. Circulation Research. 123, 27-29 (2018).
- Guo, Y. X., et al. Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo. Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).
- Rugh, R. Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , Burgess Pub. Co. (1962).
- Slack, J. M. W. Essential developmental biology. 3rd edition. , Wiley. (2013).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Rojas, S. V., et al. Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction. PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field. Science. 340 (6133), 744-748 (2013).
- Bressan, M., et al. Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction. Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
