Summary
इस विधि में, भ्रूण कार्डिएक ऊतकों शल्य चिकित्सा microdissected, असंबद्ध, फ्लोरोसेंट लेबल, और मेजबान भ्रूण के ऊतकों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । यह अस्थानिक hemodynamic शर्तों के तहत व्यक्तिगत या ऊतक स्तर के विकासात्मक संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है, और/या बदल paracrine/juxtacrine वातावरण ।
Abstract
सेल वंश निर्धारण पर बाह्य microenvironmental प्रभाव बनाम कोशिका स्वायत्त पैटर्न के सापेक्ष प्रभाव की व्याख्या विकास जीव विज्ञान अनुसंधान में एक सामांय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । भ्रूण दिल में, यह transcriptional नियामकों की अभिव्यक्ति में क्षेत्रीय मतभेदों के रूप में विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है, paracrine/juxtacrine संकेतन cues, और hemodynamic बल सभी cardiomyocyte परिपक्वता को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । एक सरल तरीका है एक विकासशील है cardiomyocyte आणविक और यांत्रिक microenvironment को बदलने के लिए, इसलिए, एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में सेवा के लिए जांच कैसे स्थानीय शर्तों सेल भाग्य और समारोह को प्रभावित करते हैं । इस पते के लिए, हम शारीरिक रूप से हृदय या आसपास के भ्रूण ऊतक में अस्थानिक स्थानों में किशोर cardiomyocytes प्रत्यारोपण करने के लिए एक विधि को अनुकूलित किया है । यह हमें की जांच करने के लिए कैसे microenvironmental शर्तों बरकरार भ्रूण के भीतर एक सेल प्रस्ताव पर cardiomyocyte भाग्य संक्रमण को प्रभावित करने की अनुमति देता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें भ्रूण myocytes हृदय उप की एक किस्म से अलग किया जा सकता का वर्णन डोमेन, असंबद्ध, फ्लोरोसेंट लेबल, और उच्च परिशुद्धता के साथ मेजबान भ्रूण में microinjected । कोशिकाओं को तो सीधे सीटू में इमेजिंग और ऊतकवैज्ञानिक तकनीक की एक किस्म का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल पारंपरिक भ्रष्टाचार करने वाले प्रयोगों कि दिल के रूप में एक चलती ऊतक में मुश्किल नकारात्मक स्तर तक जा सकता है के लिए एक शक्तिशाली विकल्प है । इस विधि की सामांय रूपरेखा भी दाता ऊतकों और मेजबान वातावरण की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और उसके उपयोग की आसानी, कम लागत, और गति यह विकास के अध्ययन की एक किस्म के लिए एक संभावित उपयोगी अनुप्रयोग बनाते हैं ।
Introduction
कार्डिएक विकास अनुसंधान germline ट्रांसजेनिक मॉडल प्रणाली है जो जीन विनियामक नेटवर्क है कि पैटर्न विभिंन कोशिका वंश और दिल में कार्यात्मक डोमेन के कई की पहचान की है के आगमन से काफी लाभांवित किया है । हालांकि, पहचान कैसे इन जीन नेटवर्क के साथ बातचीत और paracrine/juxtacrine संकेतों और भौतिक आदानों (खिंचाव, तनाव, hemodynamic प्रवाह) सहित microenvironmental शर्तों का जवाब, चुनौतीपूर्ण हो सकता है । जैसे, यह हमेशा आसान नहीं है कि क्या एक सेलुलर phenotype एक आनुवंशिक गड़बड़ी के एक प्रत्यक्ष परिणाम के रूप में या कार्डियक मैकेनिक या उच्चतर आदेश ऊतक संरचना1,2 में परिवर्तन करने के लिए एक अनुकूलन के एक माध्यमिक परिणाम के रूप में उठता है कि निर्धारित करने के लिए .
भ्रष्टाचारी प्रयोगों, जो क्लासिक भाग्य विनिर्देश, प्रतिबद्धता, प्रेरण, और क्षमता3,4की अवधारणाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है में निहित चुनौतियों में से कुछ को दरकिनार करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करेंगे परिभाषित सेल स्वायत्त बनाम पर्यावरण के प्रभाव में दिल । दुर्भाग्य से, हृदय संकुचन मानक कठिन दृष्टिकोण भ्रष्टाचार कर रहे हैं । ऊतक के तेजी से आंदोलन अक्सर दिल और बड़े ऊतक पंचर का पालन करने से भ्रष्टाचार कोशिकाओं को रोकता है (आम तौर पर भ्रष्टाचार के लिए आवश्यक) अक्सर दिल की विफलता और भ्रूण मृत्यु दर5,6,7के लिए नेतृत्व । इसलिए, हम विकसित किया है एक दबाव आधारित, microinjection प्रणाली के लिए परिशुद्धता सेलुलर आरोपण विकासशील चिकी दिल में, पहले8,9वर्णित भ्रष्टाचार ऊतक के तकनीकी बाधाओं को दरकिनार. इस तकनीक का प्रयोग, व्यक्तिगत या कार्डियक एक दाता भ्रूण से पृथक कोशिकाओं के छोटे समूहों के एक मेजबान भ्रूण व्यापक मेजबान की तैयारी और बड़े ऊतक अपमान है कि का उपयोग कर उठता के लिए की जरूरत को नष्ट करने के दिल के क्षेत्रों की एक किस्म में microinjected जा सकता है मानक कलम बांधने की तकनीक । इन आरोपण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया सुई microinjection के एक बाहरी व्यास है ~ 30 − 40 µm, जिसका मतलब है कि सुई सीधे लक्ष्य ऊतक में रखा जा सकता है (यानी, भ्रूण रोधगलन दीवार घुसना कर सकते हैं) और कोशिकाओं को फोकल के साथ दिया जा सकता है आसपास के ऊतकों को न्यूनतम क्षति. प्रोटोकॉल के लिए isotopic, heterotopic, isochoric, और heterochronic जोड़तोड़ की एक किस्म का प्रदर्शन किया जा सकता है, एक तेजी से, लचीला, और कम लागत दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए सीधे विकासशील में शास्त्रीय प्रयोगात्मक embryological मानदंड की जांच चार चैंबर दिल ।
प्रोटोकॉल में नीचे उल्लिखित, हम एक सेल permeant फ्लोरोसेंट डाई, जो एक microinjection प्रयोग की सफलता के लिए अनुमति देता है के साथ दाता कोशिकाओं लेबल में वास्तविक समय और engrafted कोशिकाओं के स्थान पर नजर रखने के लिए किसी भी अतिरिक्त के लिए की आवश्यकता के बिना प्रलेखित होना धुंधला. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस दृष्टिकोण सबसे अच्छा अल्पकालिक प्रयोगों के लिए अनुकूल है (लगभग ४८ ज) फ्लोरोसेंट डाई के रूप में सेल विभाजन के माध्यम से खो दिया जा सकता है । वैकल्पिक दृष्टिकोण अब अवधि के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जब तक हम हृदय विकास के संदर्भ में इस तकनीक को पेश कर रहे हैं, हम इसे मध्य त्वक स्तर, सिर, अंगों में सेल आरोपण प्रयोगों के लिए महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया है, और somites । के रूप में इस तरह के बुनियादी दृष्टिकोण नीचे वर्णित अत्यधिक है और योग्य अंग प्रणालियों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
सभी तरीके चैपल हिल पर उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देश के लिए पालन वर्णित ।
1. माइक्रो इंजेक्शन पिपेट की तैयारी
- एक micropipette खींचने का उपयोग कर कांच केशिकाओं खींचो । कुछ इंजेक्शन के लिए, सुई बेवलिंग के रूप में यह संरचनात्मक दोष से रहित एक अत्यंत तेज सतह प्रदान करता है की सिफारिश की है । ऐसा करने के लिए, 15 − 20 मिनट के लिए ४५ ° के कोण पर एक बेवलिंग व्हील पर एक खींची हुई सुई के अंत को पॉलिश करें ।
नोट: पुलिंग के लिए सटीक सेटिंग्स इस्तेमाल किया जा रहा खींचने के आधार पर भिन्न होगा । बेवल का अंतिम भीतरी व्यास 20 − 40 µm के बीच होना चाहिए । - कोट सिलिकॉन के साथ कांच केशिका के भीतरी और बाहरी सतहों । पहले सुई की बाहरी सतह कोट और फिर भीतरी सतह कोट करने के लिए प्रत्येक micropipette में siliconizing एजेंट समाधान backload के लिए siliconizing एजेंट में सुई डुबकी ।
नोट:-आरोपण प्रयोग से पहले कांच केशिकाओं की कोटिंग 24 एच किया जाना चाहिए । कोटिंग सिलिकॉन के साथ कांच केशिकाओं कांच के लिए एक रासायनिक निष्क्रिय सतह प्रदान करता है । केशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया जाता है, तो बाद में चरणों में उत्पन्न सेल निलंबन कांच का पालन करेंगे और सुई प्लग । इसलिए, कोटिंग आवश्यक है और विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है ।
चेतावनी: siliconizing एजेंट हेप् और 1, 7-dichloro-1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7-octamethyltetrasiloxane (सामग्री की तालिका) का एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण तैयार किया है । यह अत्यंत ज्वलनशील और तीव्रता से विषाक्त है । हमेशा एक धुएं हुड के अंदर उचित पीपीई के साथ संभाल ।- सुई backload करने के लिए, लोड ~ 5 − 10 µ एल siliconizing एजेंट के एक माइक्रो-इंजेक्शन पिपेट टिप (सामग्री तालिका) में । खींचा कांच केशिका के व्यापक अंत में माइक्रो इंजेक्शन टिप प्लेस और टिप की स्थिति के रूप में दूर के रूप में संभव के रूप में (कांच सुई टिप के करीब) । सुई में हवा के बुलबुले को कम करने के क्रम में धीरे लोडिंग पिपेट को दूर करते हुए siliconizing एजेंट बेदखल ।
- 10 मिनट के लिए गिलास सुई में siliconizing एजेंट छोड़ दो, एक नया लोडिंग पिपेट के साथ aspirating द्वारा हटाने और सुई एक धुएं हुड में रातोंरात सूखी अनुमति देते हैं ।
- प्रयोग की सुबह, चरण १.२ में प्रक्रिया के बाद पानी के साथ कांच केशिकाओं कुल्ला और 3 − 4 एच के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
2. समाधान की तैयारी
- Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम और हैम के पोषक तत्व मिश्रण f12 के ४.२ मिलीलीटर के पूरक द्वारा समाधान बेअसर trypsin के 5 मिलीलीटर तैयार (DMEM/f12) ७५० µ एल के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और ५० µ के एल पेनिसिलिन/Streptomycin के । उपयोग जब तक ३७ ° c पर स्टोर ।
- 1 मिमी स्टॉक लेबलिंग डाई के 5 µ एल pipetting द्वारा 5 µ मीटर लेबलिंग डाई समाधान तैयार (dimethyl sulfoxide [DMSO], सामग्री की मेज) में ९९५ µ है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के एल । 1 मिनट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर दुकान के लिए भंवर उपयोग तक ।
- ६२ मिलीलीटर आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी और 10x Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) के 8 मिलीलीटर के साथ ३२% पीएफए शेयर समाधान के 10 मिलीलीटर के संयोजन से ताजा paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें । अंतिम एकाग्रता 1x DPBS में 4% पीएफए है ।
3. मेजबान भ्रूण की तैयारी
- ३८ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में एक क्षैतिज अभिविंयास में उपजाऊ चिकन अंडे की मशीन जब तक हैमबर्गर और हैमिल्टन (एचएच) स्टेज 1910।
नोट: हेरफेर के लिए चुना मंच लचीला और पूरी तरह से प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर है । - एक छोटे से पंचर > व्यास में 1 मिमी बनाने के लिए angled संदंश का उपयोग अंडे भूमध्य रेखा के साथ अंडा खोल के "फ्लैट" अंत स्कोर । पंचर के माध्यम से संलग्न 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक 18 जी सुई डालें और एल्ब्युमिन के ~ 5 मिलीलीटर निकालें ।
नोट: इस संरचनात्मक स्थान अंडे के अंदर "एयर सेल" के लिए बाहरी है और पंचर बना दिया है एक बार लीक से एल्ब्युमिन रहता है । इस कदम के रूप में सिफारिश की है "बूंदें" भ्रूण अंडे खोल से दूर, बाद के चरणों में संभावित नुकसान को रोकने । - अंडा शेल के शीर्ष पर पारदर्शी टेप लागू करें । angled संदंश के साथ स्कोर और घुमावदार tenotomy कैंची का उपयोग कर एक ~ २.५ cm विंडो में कटौती ।
- निरीक्षण और चरण हैमबर्गर और हैमिल्टन10 द्वारा स्थापित मापदंड के आधार पर भ्रूण और पारदर्शी टेप के साथ ३.२ कदम से पंचर सील ।
नोट: यहाँ स्टेज एचएच १९ भ्रूणों का उपयोग किया जाता है जिनमें ३७ − ४० somites का विस्तार पूंछ की कली में होता है. पंचर खिड़की अंडे के शीर्ष (चरण ३.३) के साथ खोला जाता है जब तक सील नहीं किया जाना चाहिए । - इंजेक्शन ~ २०० µ एल ऑफ इंडिया इंक/HBSS मिश्रण (1:5) संलग्न 1 एमएल सिरिंज के साथ एक ३२ जी सुई का उपयोग कर भ्रूण के नीचे ।
नोट: भारत स्याही भ्रूण और नीचे की जर्दी के बीच दृश्य विपरीत प्रदान करता है । ऐसे तटस्थ लाल या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन () या ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन (बीएफपी) प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट के रूप में वैकल्पिक रंगों के विपरीत सुधार किया जा सकता है । - भ्रूण डिस्क और तेल फिल्म के साथ सील खिड़की के गोले पर HBSS dropwise के 1 मिलीलीटर जोड़ें । humidified मशीन में अंडे वापस प्लेस इंजेक्शन के लिए तैयार है जब तक ।
4. दाता ऊतक का अलगाव
- ३८ ° c चरण एचएच 19 (या इच्छित चरण) तक एक humidified मशीन में दाता उपजाऊ चिकन अंडे की मशीन ।
- अंडे और जगह से एक १०० मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में कमरे के तापमान (आरटी) पर बाँझ HBSS युक्त में से भ्रूण निकालें ।
- शल्य चिकित्सा पहले भ्रूण से पूरे भ्रूण दिल अलग और फिर संदंश, tenotomy कैंची का उपयोग कर दिल से atria को अलग करके, और एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप के तहत microspatula द्वारा प्रत्येक भ्रूण से दाता ऊतक अलिंद microdissect । एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब बर्फ पर HBSS की 1 मिलीलीटर युक्त में पूल ।
- एक बार सभी दाता ऊतक एकत्र किया गया है, 5 मिनट के लिए १००० x g पर 4 ° c में एक निश्चित कोण microcentrifuge में केंद्रापसारक द्वारा ऊतक गोली ।
5. दाता ऊतक के Trypsin पाचन
- गरम ०.०५% trypsin के 1 मिलीलीटर में सेल छर्रों resuspend-EDTA और 15 मिनट के लिए ३७ ° c में एक मिलाते हुए हीट ब्लॉक में ३०० rpm पर गर्मी । वैकल्पिक रूप से, नमूना के आवधिक आंदोलन के साथ एक पानी स्नान का उपयोग करें ।
- पिपेट पाचन समाधान ऊपर और नीचे किसी भी शेष ऊतक को तोड़ने के लिए, और गोली के रूप में ४.४ कदम में ।
- समाधान बेअसर trypsin के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend और ४.४ कदम के रूप में केंद्रापसारक ।
- लाल फ्लोरोसेंट लेबलिंग डाई समाधान और एक गर्मी ब्लॉक में 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के ४०० µ एल में कोशिकाओं resuspend । वैकल्पिक रूप से, एक पानी स्नान का उपयोग करें ।
- एक बार लेबलिंग प्रतिक्रिया समाप्त हो गया है, चरण ४.४ में के रूप में कोशिकाओं गोली और HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ धो (धो चरणों की संख्या 1 और 3 के बीच अलग किया जा सकता है) ।
- µ एल, जो आम तौर पर कुल सेल यील्ड के आधार पर एक 5 − 10 µ l कार्य मात्रा में परिणाम की एकाग्रता पर लेबल, छर्रों कोशिकाओं resuspend ।
नोट: नीचे सेल सांद्रता ~ ५०,००० कोशिकाओं/µ एल गरीब इंजेक्शन दक्षता में परिणाम कर सकते हैं ।
6. इन-वीवो इंजेक्शन
- Backload एक सिलिकॉन में सेल निलंबन का इलाज किया ग्लास केशिका पिपेट कदम १.२ में प्रक्रियाओं का पालन । दबाव microinjector तंत्र में पिपेट माउंट ।
- humidified मशीन और फ्लोरोसेंट स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे एक अंडा धारक में जगह से मेजबान भ्रूण निकालें ।
- बाँझ ठीक संदंश का उपयोग कर vitelline झिल्ली खोलें और एक छोटा सा चीरा (~ 0.5 − 1.0 mm लंबाई में) पेरीकार्डियम में बना । इंजेक्शन के लिए लक्ष्य क्षेत्र के आधार पर अतिरिक्त हेरफेर/विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती है ।
- microinjector स्थिति ऐसी है कि microinjection सुई की नोक लक्ष्य ऊतक प्रवेश ।
- दबाव कोशिकाओं इंजेक्षन, और फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करने के लिए निर्धारित है कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं वांछित ऊतक में मौजूद हैं । ठेठ इंजेक्शन के लिए, दबाव में 100-400 hectopascals से लेकर अवधि में एकल दालों से कम ०.५ एस लागू करें ।
नोट: नाड़ी की लंबाई और पूर्ण दबाव कोशिकाओं की संख्या के आधार पर अलग-अलग होगा और इंजेक्शन के लिए व्यक्तिगत आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । - microinjector तंत्र को वापस लेने और दबाव इंजेक्शन के बाद धारक से अंडा हटा दें ।
- दबाव कोशिकाओं इंजेक्षन, और फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करने के लिए निर्धारित है कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं वांछित ऊतक में मौजूद हैं । ठेठ इंजेक्शन के लिए, दबाव में 100-400 hectopascals से लेकर अवधि में एकल दालों से कम ०.५ एस लागू करें ।
- भ्रूण पर गर्म HBSS dropwise के 1 मिलीलीटर जोड़ें, सील पारदर्शी पैकिंग टेप का उपयोग कर अंडे, और humidified मशीन में ३८ ° c पर 24 घंटे के आरोपण के लिए मशीन ।
7. अलगाव और विश्लेषण
- आर टी HBSS में मेजबान भ्रूण संदंश, tenotomy कैंची, और microspatula ४.३ कदम के समान का उपयोग कर अलग है, और 4% पीएफए में 4 ° c पर रात भर कोमल कमाल के साथ ।
- धो भ्रूण 3 x 5 HBSS में कम से आरटी पर कोमल कमाल है, और आगे बहाव विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर HBSS में स्टोर (माइक्रोस्कोपी, immunohistochemistry, में-सीटू संकरण, आदि) ।
Representative Results
24 घंटे की मशीन के बाद, दिल और मेजबान भ्रूण के चारों ओर ऊतक अलग थे, फोटो खिंचवाने (1 चित्रा), और immunofluorescent विश्लेषण के लिए कार्रवाई की । इस उदाहरण में, दाता अलिंद myocytes एक समान मंचन मेजबान भ्रूण के proepicardium में microinjected थे । मेजबान भ्रूण तो मांसपेशी मार्कर (MF20 ग्रीन) और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; ब्लू) के साथ दाग था । इंजेक्शन कोशिकाओं (लाल) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 1बी). संभव समायोजन पर विचार करने के लिए अगर कोशिकाओं को दिखाई नहीं दे रहे हैं शामिल हैं: दाता ऊतक पचा गया था (कोशिकाओं को संलग्न करने में असमर्थ होगा), लेबलिंग डाई समाधान भी पतला था, कोशिकाओं को धोया गया था, या एकाधिक सेल डिवीजनों लेबल के नुकसान में हुई ।
पुष्टि करने के लिए कि इस उदाहरण में इंजेक्शन कोशिकाओं रोधगलन थे, हम ऑप्टिकली एक फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 1सी-ई) का उपयोग कर इस भ्रूण खोदी । proepicardium (पीई) के भीतर केवल MF20 सकारात्मक कोशिकाओं फ्लोरोसेंट लाल सकारात्मक कोशिकाओं है कि फोकल प्रत्यारोपित किए गए हैं ।
चित्रा 1 : भ्रूण के प्रतिनिधि छवियों अलग 24 घंटे पोस्ट इंजेक्शन । (ए) एक ई 3.5 (एचएच स्टेज 19) चिकी भ्रूण के ट्रंक क्षेत्र के कम आवर्धन brightfield छवि । (ख) इंजेक्टेड कोशिकाओं (लाल), cardiomyocytes (हरा), और DAPI दिखाने छवि विलय कर रहे हैं । कोशिकाओं को atria से अलग किया गया और proepicardium में microinjected । (ग) उच्च आवर्धन फोकल इमेजिंग proepicardium के कोर में लेबल कोशिकाओं दिखा । (घ) उच्च आवर्धन फोकल इमेजिंग confirming सीटी लाल लेबल कोशिकाओं cardiomyocytes हैं । (ङ) पैनलों से इंजेक्ट की गई कोशिकाओं के तीन आयामी (3d) पुनर्निर्माण डी और ई. पर, atria; बहुधा, बहिर्वाह पथ; पे, proepicardium; वीटी, निलय; MF20, मायोसिन 4. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
को परिभाषित करने की क्षमता कैसे microenvironmental स्थितियों प्रभाव कार्डियक सेल भाग्य विनिर्देश और वंश स्थिरीकरण जन्मजात हृदय रोग का एक संपीड़न समझ बनाने के साथ ही उचित के लिए कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए मौलिक है स्टेम सेल या दैहिक कोशिका reprograming आधारित cardiomyocytes की परिपक्वता । ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को सीधे vivo परिस्थितियों में परिवर्तित के तहत हृदय कोशिका विकास परख करने की क्षमता देता है, सेल स्वायत्त परिपक्वता प्रक्रियाओं के लिए अनुमति paracrine/juxtacrine और/या hemodynamic cues से अलग हो । जब उच्च संकल्प इमेजिंग, आनुवंशिक विश्लेषण, और शारीरिक परख के साथ संयुक्त, इस तकनीक को मौजूदा ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए एक शक्तिशाली पूरक के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
एक तकनीकी स्टैंड बिंदु फार्म, प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कुशल अलगाव, लेबल, और मेजबान भ्रूण के ऊतकों में दाता दिल की कोशिकाओं के सटीक आरोपण पर निर्भर करता है । एक microinjection प्रणाली का उपयोग बहुत दाता कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण में एड्स और मेजबान ऊतक में एक बड़ी engraftment साइट बनाने के लिए की आवश्यकता के बिना सफल आरोपण के लिए अनुमति देता है । कुछ संचालन कौशल इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है, लेकिन, के रूप में कम व्यवहार्यता परिणाम कर सकते है अगर इंजेक्शन सुई ध्यान लक्ष्य ऊतक में रखा नहीं है (दिल या स्थानीय vasculature के टूटना के कारण) । ध्यान और विचार भी अलगाव और लेबलिंग कदम के लिए दिया जाना चाहिए । दाता ऊतक के पाचन पर गरीब आरोपण दक्षता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और क्षणिक लेबलिंग तकनीक समय खिड़की जो दाता कोशिकाओं पर नज़र रखी जा सकता है सीमा (के रूप में सेल विभाजन लेबल को कमजोर कर सकते हैं) ।
इस तकनीक उच्च परिवर्तनीय है और प्रयोजनों के एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, ऊतकों और चरणों की एक बड़ी रेंज से दाता कोशिकाओं अलग किया जा सकता है (हालांकि एंजाइमी पाचन के अनुकूलन की आवश्यकता है) और इसी तरह विकास के विभिंन चरणों में मेजबान ऊतकों की एक किस्म में इंजेक्ट किया जा सकता है । इसी तरह, लेबलिंग दृष्टिकोण को विभिंन लौकिक खिड़कियों भर में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट अकार्बनिक अर्धचालक nanocrystals के उपयोग के लिए अब क्षणिक लेबलिंग और बटेर कोशिकाओं या हरे रंग से कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए सहित फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसजेनिक (GFP +) permeant लेबलिंग के लिए दाता भ्रूण11 ।
जब तक हम वर्तमान में एवियन आरोपण के अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग करें, हमें लगता है कि यह भविष्य में chimeric अध्ययन की एक बड़ी रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से बदल ट्रांसजेनिक जीवों से कार्डियक कोशिकाओं अलग किया जा सकता है और एवियन दिल में microinjected एक बहुत ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इसके अलावा, कोशिकाओं उपजी कोशिकाओं से cardiomyocytes में विभेदित या दैहिक कोशिका reprograming दृष्टिकोण के माध्यम से भ्रूण दिल में microinjected जा सकता है ऊतक में उनके एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए और/ शर्तों.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान R00HL122360 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
- Guo, Y. X., Pu, W. T. Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research. Circulation Research. 123, 27-29 (2018).
- Guo, Y. X., et al. Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo. Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).
- Rugh, R. Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , Burgess Pub. Co. (1962).
- Slack, J. M. W. Essential developmental biology. 3rd edition. , Wiley. (2013).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Rojas, S. V., et al. Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction. PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field. Science. 340 (6133), 744-748 (2013).
- Bressan, M., et al. Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction. Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
