Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Summary

Den här metoden är embryonala hjärt vävnader kirurgiskt microdissected, skiljas, fluorescently märkt och implanteras i värd embryonala vävnader. Detta ger en plattform för att studera enskilda eller vävnad nivå utvecklande organisationen under ektopisk hemodynamik och/eller förändrad parakrin/juxtacrine miljöer.

Abstract

Tolka den relativa effekten av cell autonoma mallning kontra yttre microenvironmental inflytande på cell härstamning bestämning utgör en allmän utmaning i utvecklingsbiologi forskning. I embryonala hjärtat, detta kan vara särskilt svåra som regionala skillnader i uttrycket av transkriptionell tillsynsmyndigheter, parakrin/juxtacrine signalering ledtrådar, och hemodynamiska kraft är alla kända för att påverka hjärtmuskelcellen mognad. En förenklad metod att förändra en utveckla hjärtmuskelcellen molekylär och biomekaniska närmiljön skulle därför fungera som en kraftfull teknik för att undersöka hur lokala villkor inflytande cell öde och funktion. För att lösa detta, har vi optimerat en metod för att fysiskt transplantera juvenil hjärtmuskelceller till ektopisk platser i hjärtat eller omgivande embryonal vävnad. Detta tillåter oss att undersöka hur microenvironmental villkor inflytande hjärtmuskelcellen öde övergångar på enstaka cell upplösning inom intakt embryot. Här beskriver vi ett protokoll där embryonala myocyter kan vara isolerade från en mängd hjärt sub-domäner, skiljas, fluorescently märkt och microinjected in i värd embryon med hög precision. Cellerna kan sedan direkt analyseras på plats med hjälp av olika tekniker för avbildning och histologiska. Detta protokoll är ett kraftfullt alternativ till traditionella ympning experiment som kan vara oöverkomligt svårt i en glidande vävnad såsom hjärtat. Disponeras av denna metod kan också anpassas till en mängd olika givare vävnader och värdmiljöer och dess användarvänlighet, låga kostnader, och hastighet gör det en potentiellt användbar applikation för en mängd olika utvecklande studier.

Introduction

Hjärt utvecklings forskning har gynnat enormt från tillkomsten av könsceller transgena modellsystem som kartlagt många av de gen regleringsnät att mönster annan cell härstamningar och funktionella domäner i hjärtat. Att identifiera kan hur dessa gen nätverk interagerar med och svara på microenvironmental villkor, inklusive parakrin/juxtacrine signaler och biofysiska ingångar (stretch, stam, hemodynamiska flöde), dock vara utmanande. Som sådan, är det inte alltid lätt att avgöra huruvida en cellulär fenotyp uppstår som en direkt följd av en genetisk störning eller som ett sekundärt resultat av en anpassning till förändringar i hjärtats biomekanik eller högre ordning vävnad sammansättning^1,2 .

Ympning experiment, som klassiskt använts till adress begrepp av öde specifikation, skulle engagemang, induktion och kompetens^3,4, utgöra en perfekt metod att kringgå några av utmaningarna som definiera cell autonoma kontra miljöpåverkan i hjärtat. Tyvärr, hjärtat sammandragningar försvårar ympning standardmetoder. Snabb förflyttning av vävnad hindrar ofta ympade celler från ansluter sig till hjärtat och stora vävnad punkteringar (normalt krävs för ympning) ofta leda till hjärtsvikt och embryonal dödlighet^5,6,7. Därför har vi utvecklat en tryck-baserade, Mikroskop system för precision cellulära implantering i utvecklingsländer chick hjärtat, kringgå de tekniska hindren för vävnad ympning beskrivs tidigare^8,9. Med denna teknik, kan enskilda eller små grupper av hjärtats celler isolerade från en donator embryot vara microinjected till olika regioner i ett värd embryonala hjärta vilket eliminerar behovet av omfattande värd förberedelse och stor vävnad förolämpningar som uppstår med ympning standardtekniker. Mikroskop nålar används för dessa implantation studier har en yttre diameter på ~ 30−40 µm, vilket innebär att nålen kan placeras direkt i målvävnaden (dvs kan penetrera embryonala hjärtinfarkt väggen) och celler kan levereras focally med minimal skada på omgivande vävnad. Protokollet kan användas för att utföra en mängd isotopiska, heterotop, isochoric och heterochronic manipulationer, som ger en snabb, flexibel och billig metod för att direkt undersöka klassisk experimentell embryologiska paradigm i utvecklingsländerna fyrkamrat hjärta.

I protokollet som beskrivs nedan, vi märka givare celler med en cell diffusionskoefficient fluorescerande färgämne, som gör för att lyckas med ett Mikroskop experiment som ska övervakas i realtid och placeringen av rekonstituerades celler dokumenteras utan behov av någon ytterligare färgning. Det bör dock noteras att detta tillvägagångssätt är bäst lämpad för kort sikt experiment (ca 48 h) som den fluorescerande färgämnen kan förloras genom celldelning. Alternativa metoder kan användas för längre sikt experiment.

Medan vi presenterar denna teknik i samband med hjärt utveckling, har vi använt det till stor effekt för cell implantation experiment i mesoderm, huvud, armar och ben och thoraxsegmenten. Som sådan den grundläggande strategi som beskrivs nedan är mycket lätthanterlig och kan användas i en mängd olika organsystem.

Protocol

Alla metoderna följer djurvård riktlinjer av The University of North Carolina at Chapel Hill.

1. beredning av mikroinjektion pipetter

1. Dra glas kapillärer med hjälp av en mikropipett avdragare. För vissa injektioner rekommenderas nål avfasning eftersom det ger en extremt vass yta saknar strukturella orenheter. Polska i slutet av en drog nål på en avfasning hjul i 45° vinkel för 15−20 min gör.
   Obs: Exakta inställningar för att dra varierar beroende på den avdragare som används. Den slutliga innerdiametern avfasningens bör vara mellan 20−40 µm.
2. Coat de inre och yttre ytorna av glas kapillär med silikon. Först doppa nålar i siliconizing agent att bestryka den yttre ytan av nål och sedan biståndsanslagen siliconizing agent lösningen i varje mikropipett att bestryka den inre ytan.
   Obs: Beläggning av glas kapillärerna bör ske 24 h innan implantation experimentet. Beläggning på glas kapillärer med silikon ger en kemiskt inert yta av glas. Om kapillärerna är kvar kommer obehandlad, cellsuspensionen genereras i senare steg följa glaset och Anslut nålen. Beläggningen är därför nödvändigt och avgörande för framgången av metoden.
   Varning: Siliconizing agenten är en färdiga kommersiellt tillgängliga blandning av heptan och 1,7-diklor-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabell för material). Det är extremt brandfarlig och akut giftiga. Hantera alltid med korrekt PPE inuti ett dragskåp.
   1. Att biståndsanslagen nålen, Ladda ~ 5−10 µL av siliconizing agent i en mikro-injektion pipettspetsen (Tabell för material). Placera mikroinjektion spetsen i den breda änden av dragna glaset kapillär och Placera spetsen så långt ner som möjligt (nära glas kanylspetsen). Mata ut siliconizing agenten och långsamt ta lastning pipetten för att minimera luftbubblor i nålen.
   2. Lämna siliconizing agenten i glas nålen i 10 min, ta bort genom att aspirera med nya lastning pipett och låta nålar torka över natten i dragskåp.
3. På morgonen av experimentet, skölj glas kapillärer med avjoniserat vatten efter proceduren i steg 1.2 och låt torka för 3,4 h.

2. beredning av lösningar

1. Förbereda 5 mL av trypsin neutraliserande lösning genom att komplettera 4,2 mL Dulbeccos modifierade örnens medium och Hams näringsämne blandning F12 (DMEM/F12) med 750 µL av fetalt bovint Serum (FBS) och 50 µL av Penicillin/Streptomycin. Lagra vid 37 ° C fram till användning.
2. Förbereda 5 µM märkning dye lösning av pipettering 5 µL av 1 mM lager märkning färgämne (i dimetyl sulfoxid [DMSO], Tabell för material) till 995 µL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS). Virvel för 1 min och store vid 37 ° C fram till användning.
3. Förbereda färska PARAFORMALDEHYD (PFA) genom att kombinera 10 mL av stamlösningen 32% PFA med 62 mL vatten för molekylärbiologi kvalitet och 8 mL 10 x Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS). Den slutliga koncentrationen är 4% PFA i 1 x DPBS.

3. beredning av värd embryon

1. Inkubera bördiga hönsägg i en horisontell orientering i en fuktad inkubator vid 38 ° C tills hamburgare och Hamilton (HH) etapp 19¹⁰.
   Obs: Scenen valt för manipulation är flexibel och helt beroende av målen för varje enskilt experiment.
2. Poäng i ”platt” slutet av ägg skalet längs ägg ekvatorn med vinklad pincett för att göra en liten punktering > 1 mm i diameter. Infoga en 18 G nål med bifogade 10 mL sprutan genom att punktera och ta bort ~ 5 mL albumin.
   Obs: Denna anatomiska lokalisationerna är extern för ”air cell” inuti ägget och håller albumin läcker när punkteringen är gjord. Detta steg rekommenderas eftersom det ”droppar” embryot från äggskal, förebygga potentiella skador i de efterföljande stegen.
3. Tillämpa genomskinliga tejpen till toppen av äggskal. Poäng med vinklad pincett och skär ett ~2.5 cm fönster med böjda tenotomy sax.
4. Inspektera och stage embryot baserat på kriterier som fastställts av hamburgare och Hamilton¹⁰ och försegla punkteringen från steg 3,2 med transparent tejp.
   Obs: Här, scenen HH 19 embryon används som har 37−40 thoraxsegmenten utvidga till svans knoppen. Punkteringen bör inte vara förseglade tills efter fönstret öppnas längs toppen av ägget (steg 3.3).
5. Injicera ~ 200 µL India färgpulver/HBSS blandning (1:5) under embryot använder en 32 G nål med bifogade 1 mL spruta.
   Obs: India färgpulver ger visuell kontrast mellan embryot och äggulan under. Alternativa färgämnen såsom neutral röd eller kommersiellt tillgängliga cyan fluorescerande protein (GFP) eller blå fluorescerande protein (BFP) fluorescens filteruppsättningar kan användas för att förbättra kontrast.
6. Tillsätt 1 mL HBSS droppvis på embryonala skiva och försegla windowed skal med paraffin film. Placera äggen tillbaka i befuktade inkubatorn tills redo för injektion.

4. isolering av givarens vävnad

1. Inkubera givare bördiga hönsägg i en fuktad inkubator vid 38 ° C tills etapp HH 19 (eller önskad scen).
2. Ta bort embryot från ägg och placera i en 100 x 15 mm petriskål som innehåller steril HBSS i rumstemperatur (RT).
3. Kirurgiskt microdissect förmaksflimmer givarens vävnad från varje embryo genom först isolera hela embryonala hjärtat från embryot och sedan genom att isolera atria från hjärtat använda pincett, tenotomy sax och microspatula under en stereo dissekera mikroskopet. Pool i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 1 mL HBSS på is.
4. När alla givare vävnad har samlats, pellet vävnaden genom centrifugering vid 1000 x g i 5 minuter vid 4 ° C i en fast vinkel mikrocentrifug.

5. trypsin rötning av givarens vävnad

1. Återsuspendera cell pellets i 1 mL av förvärmd 0,05% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C i 15 min i en skakande värme block vid 300 rpm. Alternativt använda vattenbad med periodiska agitation av provet.
2. Pipettera matsmältningen lösningen upp och ned för att bryta upp eventuella kvarvarande vävnad, och pellet som i steg 4,4.
3. Återsuspendera pelleten i 1 mL av den trypsin neutraliserande lösning och centrifugera som i steg 4,4.
4. Att resuspendera cellerna i 400 µL av röd fluorescerande märkning dye lösning och inkubera vid 37 ° C i 20 min i ett värme-block. Alternativt använda vattenbad.
5. När märkning reaktionen är klar, pellet cellerna som i steg 4,4 och tvätta med 1 mL HBSS (antal tvätta stegen kan varieras mellan 1 och 3).
6. Att resuspendera märkt, pelleterat cellerna vid en koncentration på ~ 50 000 celler/µL, vilket vanligtvis resulterar i en 5−10 µL arbetar volym beroende på den totala cell avkastningen.
   Obs: Cell koncentrationer under ~ 50 000 celler/µL kan resultera i dålig injektion effektivitet.

6. in vivo-injektion

1. Biståndsanslagen cellsuspensionen i silikon behandlat glas kapillär pipett följa instruktionerna i steg 1.2. Montera pipetten i tryck microinjector apparaten.
2. Ta bort värd embryon från befuktade inkubator och placera i en Ägghållaren under fluorescerande stereo dissekera mikroskopet.
   1. Öppna det vitelline membranet med steril fin pincett och göra ett litet snitt (~0.5−1.0 mm i längd) i hjärtsäck. Ytterligare manipulation/dissektion kan behövas beroende på målregion för injektion.
3. Placera microinjector så att spetsen på Mikroskop nålen penetrerar målvävnaden.
   1. Tryck injicera celler, och använda den fluorescerande etiketten för att bestämma att implanterade cellerna finns i önskad vävnad. För typiska injektioner, gäller enstaka pulser som är mindre än 0,5 s i en behandlingsduration från 100-400 hektopascal i trycket.
      Obs: Puls längd och absoluta trycket varierar beroende på antalet celler injiceras och kan modifieras för att passa individuella behov.
   2. Tillbaka microinjector apparaten och ta bort ägget från innehavaren efter tryck injektion.
4. Tillsätt 1 mL varm HBSS droppvis på embryot, försegla ägg använder transparenta packtejp och inkubera i befuktade inkubator vid 38 ° C för 24 h efter implantation.

7. isolering och analys

1. Isolera värd embryon i RT HBSS med pincett, tenotomy sax och microspatula liknar steg 4,3 och fixa i 4% PFA övernattning på 4 ° C med mild gunga.
2. Tvätta embryon 3 x 5 min i HBSS på RT med mild gunga och lagra i HBSS vid 4 ° C för vidare nedströms analys (mikroskopi, immunohistokemi, in situ-hybridisering, etc.).

Representative Results

Efter 24 h inkubation, hjärta och surround vävnad av värd embryon isolerades, fotograferade (figur 1A) och bearbetas för Immunofluorescerande analys. I det här exemplet givare förmaksflimmer myocyter var microinjected in den proepicardium av en liknande stegvis värd embryo. Värd embryot var sedan färgas med muskel markören (MF20 grön) och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå). Injicerade cellerna (röd) är klart synliga (figur 1B). Eventuella justeringar att överväga om det inte syns några celler inkluderar: givarens vävnad har över smält (celler skulle kunna bifoga), märkning dye lösning var alltför utspädd, celler var alltför tvättade eller flera celldelningar resulterade i förlusten av etiketten.

För att bekräfta att de injicerade cellerna i det här exemplet var hjärtinfarkt, sektioneras vi optiskt detta embryo med confocal Mikroskop (figur 1C-E). De enda MF20 positiva cellerna inom proepicardium (PE) är fluorescerande rött positiva celler som var focally implanteras.

Figur 1 : Representativa bilder av embryon isolerade 24 timmar efter injektionen. (A) låg förstoring brightfield bilden av regionen stammen av ett E3.5 (HH etapp 19) chick embryo. (B) sammanfogad bild visar injiceras celler (röd), hjärtmuskelceller (grön) och DAPI. Cellerna var isolerade från förmaken och microinjected in den proepicardium. (C) hög förstoring confocal imaging visar märkt celler i kärnan av den proepicardium. (D) hög förstoring confocal imaging bekräftar CT röd märkt celler är hjärtmuskelcellerna. (E) tredimensionella (3D) rekonstruktion av injicerade cellerna från paneler D och E. At, atria; OFT, utflöde tarmkanalen; PE, proepicardium; VT, ventrikeln; MF20, Myosin 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Möjligheten att definiera hur microenvironmental villkor påverkar hjärt cell öde specifikation och härstamning stabilisering är grundläggande för att skapa en tryckkraft förståelse av kongenital hjärtsjukdom samt att utveckla effektiva protokoll för korrekt mognaden av stamceller eller somatisk reprograming-baserade hjärtmuskelcellerna. Protokollet beskrivs ovan ger utredarna möjligheten till direkt assay hjärt cell utveckling under ändras förhållandena in vivo, möjliggör autonoma mognad cellprocesser separeras från parakrin/juxtacrine och/eller hemodynamiska cues. Kombination med hög upplösning imaging, genetisk analys och fysiologiska analyser, kan denna teknik fungera som ett kraftfullt komplement till befintliga transgena modeller.

Bilda en teknisk stå punkt, det protokoll som presenteras här bygger på effektiv isolering, märkning och precisa implantering av givare hjärtceller i värd embryonala vävnader. Användning av ett Mikroskop system kraftigt stöd i inriktningen av donatorcellerna och möjliggör lyckad implantation utan behovet av att skapa en stor engraftment webbplats i värd vävnaden. Vissa operativa skicklighet krävs för att utföra denna teknik dock eftersom minskad lönsamhet kan leda om injektionsnålen inte placeras noggrant i målvävnaden (orsakar bristning i hjärtat eller lokala vaskulatur). Omsorg och eftertanke bör också ges till isolering och märkning trappan. Med matsmältningen givarens vävnad kan leda till dålig implantation effektivitet och övergående märkning tekniker kan begränsa tidsramen som donatorcellerna kan spåras (som celldelning kan späda ut etiketten).

Denna teknik mycket kan ändras och kan anpassas för olika ändamål. Exempelvis injiceras givare celler från ett stort utbud av vävnader och stadier kan vara isolerade (även om det krävs optimering av enzymatisk nedbrytning) och kan likaså i en mängd värden vävnader över olika stadier av utveckling. Likaså kan den märkning metoden ändras för att spåra celler mellan olika windows-temporal, inklusive användning av fluorescerande oorganiska halvledare nanokristaller för längre övergående märkning och implantation av vaktel celler eller celler från green fluorescerande protein transgena (GFP +) givare embryon¹¹ för diffusionskoefficient märkning.

Medan vi för närvarande använder denna teknik för aviär implantation studier, anser vi att det skulle kunna användas för ett stort antal chimära studier i framtiden. Till exempel kunde genetiskt förändrade hjärtats celler från transgena organismer vara isolerade och microinjected in aviär hjärta med ett mycket liknande protokoll. Dessutom celler differentieras efter hjärtmuskelcellerna från stjälkar celler eller via somatiska celler reprograming metoder kunde vara microinjected i den embryonala hjärtan att utvärdera deras integrering i den vävnad eller mognad under invivo biomekaniska villkor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	BD	329654
1.7 mL Microtubes, Clear	Genesee Scientific	24-282
10 ml Syringe	BD	305482
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-430
15 mL Centriguge Tubes, Racked	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Incubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Needle	BD	305196
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Needle	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Wipes 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Angled Forceps	Fine Scientific Tools	11260-20
Backloading Tips	Eppendorf	930001007
Black India Ink	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Commercial Grade Packing Tape	Staples	2619001
Curved Tenotomy Scissors	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Hatching Eggs	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Micromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade	VWR	100496-496
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petri Dish	Genesee Scientific	32-107
Pipette Grinder	Narishige	EG-44
Pipette Puller	HEKA	PIP 6
Scotch Transparent Tape	Staples	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereo Microscope	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Transfer Pipette	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054