Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Summary

I denne metode er embryonale hjerte væv bortopereret microdissected, adskilles, fluorescently mærket og implanteret i vært embryonale væv. Dette giver en platform for at studere de enkelte eller væv niveau udviklingsmæssige organisation under ektopisk hæmodynamiske forhold, og/eller ændret paracrine/juxtacrine miljøer.

Abstract

Fortolkning af den relative virkning af celle autonome mønstre versus ydre microenvironmental indflydelse på celle lineage bestemmelse er en generel udfordring i udviklingsmæssige biologi forskning. I den embryonale hjerte, dette kan være særligt vanskeligt som regionale forskelle i udtryk for transcriptional regulatorer, paracrine/juxtacrine signaling cues, og hæmodynamiske kraft er alle kendt for at påvirke cardiomyocyte modning. En forenklet metode til at ændre en tredje cardiomyocyte molekylære og biomekaniske mikromiljø ville derfor tjene som en kraftfuld teknik til at undersøge, hvordan de lokale betingelser indflydelse celle skæbne og funktion. For at løse dette, har vi optimeret en metode for at fysisk transplant juvenile cardiomyocytes til ektopisk placeringer i hjertet eller den omkringliggende embryonale væv. Dette giver os mulighed at undersøge hvordan microenvironmental betingelser indflydelse cardiomyocyte skæbne overgange med enkelt celle opløsning inden for intakt embryonet. Her, beskriver vi en protokol, hvori embryonale myocytes kan være isoleret fra en bred vifte af cardiac sub-domæner, adskilles, fluorescently mærket og microinjected til værten embryoner med høj præcision. Cellerne kan derefter direkte analyseres på stedet ved hjælp af en række imaging og histologiske teknikker. Denne protokol er et stærkt alternativ til traditionelle podning eksperimenter, der kan være uoverkommeligt vanskeligt i en bevægende væv såsom hjertet. Generelle omridset af denne metode kan også tilpasses til en række donor væv og værtsmiljøer og sin brugervenlighed, lav pris, og hastighed gør det en potentielt nyttig anvendelse for en lang række udviklingsmæssige undersøgelser.

Introduction

Hjerte udviklingsmæssige forskning har gavnet enormt fra fremkomsten af kønscelleoverførsel transgene modelsystemer, som har påvist mange af genet regulerende net at mønster forskellige celle lineages og funktionelle domæner i hjertet. Identificere kan hvordan disse genet netværk interagere med og reagere på microenvironmental betingelser, herunder paracrine/juxtacrine signaler og Biofysisk indgange (stræk, stamme, hæmodynamiske flow), dog være udfordrende. Som sådan, er det ikke altid let at afgøre, om en cellulær fænotype opstår som en direkte konsekvens af en genetisk undertrykkelse af netbårne eller som et sekundært resultat af en tilpasning til ændringer i hjertets biomekanik eller højere orden væv sammensætning^1,2 .

Podning eksperimenter, som klassisk har været brugt til adresse begreber af skæbne specifikation, ville engagement, induktion og kompetence^3,4, repræsentere en ideel metode til at omgå nogle af de udfordringer, der er forbundet med definere celle autonome versus miljømæssige indflydelse i hjertet. Desværre, hjertet sammentrækninger gøre standard podning metoder vanskeligt. Hurtig bevægelse af væv, ofte forhindrer podede celler i hjertet at overholde og store væv punkterer (normalt kræves til podning) ofte fører til hjertesvigt og embryonale dødelighed^5,6,7. Derfor har vi udviklet et tryk-baseret, mikroinjektion system til præcision cellulære implantering i udviklingslandene chick hjertet, omgå de tekniske forhindringer af væv pode beskrevet tidligere^8,9. Brug af denne teknik, kan individuelle eller små grupper af cardiac celler isoleret fra en donor embryoner være microinjected til en lang række regioner af en vært embryonale hjerte eliminerer behovet for omfattende vært forberedelse og de store væv fornærmelser, der opstår ved hjælp af podning standardteknikker. Mikroinjektion nåle bruges til disse implantation undersøgelser har en ydre diameter på ~ 30−40 µm, hvilket betyder, at nålen kan placeres direkte i målvævet (dvs. kan trænge embryonale Myokardie væggen) og celler kan leveres focally med minimale skader på det omgivende væv. Protokollen kan bruges til at udføre en række isotopiske, heterotopisk, isochor og heterochronic manipulationer, giver en hurtig, fleksibel og billig tilgang til direkte undersøge klassisk eksperimentelle embryologiske paradigmer i udviklingslandene fire-chambered hjerte.

I protokollen skitseret nedenfor, vi mærker donor celler med en celle permeant fluorescerende farvestof, som giver mulighed for succes af en mikroinjektion eksperiment at overvåge i realtid og placeringen af aflægger celler dokumenteres uden behov for nogen yderligere farvning. Dog skal det bemærkes, at denne fremgangsmåde er bedst egnet til at kortsigtede eksperimenter (ca. 48 h) som den fluorescerende farvestof kan gå tabt gennem celledeling. Alternative metoder kan bruges til længere sigt eksperimenter.

Mens vi præsenterer denne teknik i forbindelse med hjertets udvikling, har vi brugt det med stor effekt for celle implantation eksperimenter i mesoderm, hoved, lemmer og somites. Som sådan den grundlæggende fremgangsmåde beskrevet nedenfor er stærkt tractable og kan bruges i en række forskellige organsystemer.

Protocol

Alle metoder beskrevet overholde dyrs pleje retningslinjer af The University of North Carolina i Chapel Hill.

1. forberedelse af mikroinjektion pipetter

1. Trække glas kapillærer ved hjælp af en mikropipette puller. For nogle injektioner anbefales nål beveling, da det giver en meget skarp overflade strukturelle urenheder. For at gøre dette, polsk i slutningen af en trak nål på en beveling hjul i en vinkel på 45° for 15−20 min.
   Bemærk: Nøjagtige indstillinger til at trække vil variere baseret på puller bliver brugt. Facet endelige indvendige diameter skal være mellem 20−40 µm.
2. Coat de indre og ydre overflader af glas kapillær med silikone. Første dukkert nåle i den siliconizing agent til pels den udvendige overflade af nål og derefter fyld siliconizing agent løsningen ind hver mikropipette til pels den indvendige overflade.
   Bemærk: Belægning af glas kapillærer bør gøres 24 timer før implantation eksperiment. Belægning glas kapillærer med silikone giver en kemisk inert overflade til glasset. Hvis kapillærer er venstre vil ubehandlet, cellesuspension genereret i senere trin overholde glasset og stik nålen. Belægningen er derfor nødvendig og afgørende for succes af metoden.
   Advarsel: Den siliconizing agent er en færdiglavet kommercielt tilgængelige blanding af heptan og 1,7-dichlor-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabel af materialer). Det er yderst brandfarlige og meget giftig. Altid håndtere med ordentlig PPE inde i et stinkskab.
   1. At udsætte nålen, indlæse ~ 5−10 µL af siliconizing agent i et mikroinjektion pipette tip (Tabel af materialer). Placer mikroinjektion spids i den brede ende af glasset, trak kapillær og Placer spidsen så langt ned som muligt (tæt på glas nål spidsen). Skubbe den siliconizing agent mens langsomt fjerner lastning pipette for at minimere luftbobler i nålen.
   2. Forlade den siliconizing agent i glas nålen i 10 min, fjerne ved sugning med en ny lastning pipette og tillade nåle tørre natten over i et stinkskab.
3. Om morgenen af eksperimentet, skylle glas kapillærer med deioniseret vand efter fremgangsmåden i trin 1.2 og lad tørre i 3−4 h.

2. udarbejdelsen af løsninger

1. Forberede 5 mL trypsin neutralisere løsning ved at supplere 4,2 mL Dulbeccos modificerede Eagle medium og Hams næringsstof blanding F12 (DMEM/F12) med 750 µL af føtal bovin Serum (FBS) og 50 µL af Penicillin/Streptomycin. Opbevar ved 37 ° C indtil brug.
2. Forberede 5 µM mærkning farvestof løsning af pipettering 5 µL af 1 mM stock mærkning farvestof (i dimethylsulfoxid [DMSO], Tabel af materialer) til 995 µL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS). Vortex for 1 min og opmagasinere henne ved 37 ° C indtil brug.
3. Forberede frisk PARAFORMALDEHYD (PFA) ved at kombinere 10 mL af 32% PFA stamopløsning med 62 mL vand af Molekylærbiologisk Institut og 8 mL af 10 x Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS). Den endelige koncentration er 4% PFA i 1 x DPBS.

3. forberedelse af vært embryoner

1. Inkuber frugtbare hønseæg i en horisontal orientering i en fugtig inkubator ved 38 ° C indtil Hamburger og Hamilton (HH) fase 19¹⁰.
   Bemærk: Scenen valgt for manipulation er fleksible og helt afhængig af mål for hver enkelt eksperiment.
2. Score "flad" slutningen af æggeskal langs æg ækvator bruger skrå pincet til at gøre en lille punktering > 1 mm i diameter. Indsæt en 18 G kanyle med vedlagte 10 mL sprøjte gennem punktering og fjerne ~ 5 mL af albumin.
   Bemærk: Denne anatomiske placering er uden for cellen"luft" inde i ægget og holder albumin fra utætte når punktering er foretaget. Dette skridt er anbefalet som det "falder" embryo fra æg shell, at forebygge potentielle skader i de efterfølgende trin.
3. Anvende gennemsigtige tape til toppen af æg shell. Score med skrå pincet og skære en ~2.5 cm vindue ved hjælp af buede tenotomy saks.
4. Inspicere og iscenesætte embryonet baseret på kriterier fastlagt af Hamburger og Hamilton¹⁰ og forsegle punktering fra trin 3.2 med gennemsigtige tape.
   Bemærk: Her, fase HH 19 embryoner bruges som har 37−40 somites strækker sig ind i halen bud. Punktering bør ikke være forseglet indtil efter vinduet åbnes langs toppen af ægget (trin 3.3).
5. Injicér ~ 200 µL af tusch/HBSS blanding (1:5) under embryoner ved hjælp af en 32 G kanyle med vedlagte 1 mL sprøjte.
   Bemærk: tusch giver visuel kontrast mellem embryonet og æggeblomme under. Alternativ farvestoffer som neutral rød eller kommercielt tilgængelige cyan fluorescerende proteiner (FFP) eller blå fluorescerende proteiner (BFP) Fluorescens filter sæt kan bruges til at forbedre kontrast.
6. Der tilsættes 1 mL af HBSS dråbevis på embryonale disken og forsegle windowed skaller med paraffin film. Placere æggene tilbage i befugtet rugemaskine indtil klar til injektion.

4. isolering af donorvæv

1. Inkuber donor frugtbare hønseæg i en fugtig inkubator ved 38 ° C indtil fase HH 19 (eller ønskede fase).
2. Fjern embryonet fra ægget og placere i en 100 mm x 15 mm petriskål der indeholder sterilt HBSS ved stuetemperatur (RT).
3. Kirurgisk microdissect atrieflimren donorvæv fra hvert foster ved først isolere hele embryonale hjertet fra embryonet og derefter ved at isolere forkamre fra hjertet bruge pincet, tenotomy sakse og microspatula under en stereo dissekere mikroskop. Pool i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør med 1 mL af HBSS på is.
4. Når alle donorvæv er blevet indsamlet, pellet væv ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min. ved 4 ° C i en fast vinkel microcentrifuge.

5. trypsin fordøjelsen af donorvæv

1. Resuspend celle pellets i 1 mL af forvarmet 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 15 min i en rystende varme blok på 300 rpm. Alternativt, brug et vandbad med periodiske agitation af prøven.
2. Der afpipetteres fordøjelsen løsning op og ned for at bryde op enhver resterende væv, og pellet som i trin 4.4.
3. Resuspenderes i 1 mL trypsin neutralisere løsning, og der centrifugeres som i trin 4.4.
4. Resuspend celler i 400 µL af rødt fluorescerende mærkning farvestof løsning og inkuberes ved 37 ° C i 20 min. i en varme blok. Alternativt kan du bruge et vandbad.
5. Når mærkning reaktionen er færdig, pellet celler som trin 4.4 og vask med 1 mL af HBSS (antallet af wash skridt kan varieres mellem 1 og 3).
6. Resuspend mærket, pelleted celler i en koncentration på ~ 50.000 celler/mikroliter, hvilket generelt resulterer i en 5−10 µL arbejder lydstyrken afhængigt af cellen total udbytte.
   Bemærk: Celle koncentrationer under ~ 50.000 celler/mikroliter kan resultere i dårlig indsprøjtning effektivitet.

6. in-vivo injektion

1. Fyld cellesuspension i silikone behandlet glas kapillær pipette efter procedurerne i trin 1.2. Montere pipetten pres microinjector apparatet.
2. Fjerne vært embryoner fra befugtet inkubator og sted i en ægget indehaveren nedenunder fluorescerende stereo dissekere mikroskop.
   1. Åbn vitelline membranen ved hjælp af steril fine pincet og gøre en lille snit (længde ~0.5−1.0 mm) i at hjertesækken. Ekstra manipulation/dissektion kan være nødvendige afhængigt af målområde til injektion.
3. Placer microinjector, således at spidsen af mikroinjektion nålen trænger målvæv.
   1. Pres injicere celler, og bruge den fluorescerende etiket for at afgøre at implanterede celler er til stede i ønskede væv. For typiske injektioner, anvende enkelt pulser er mindre end 0,5 s i varighed spænder fra 100-400 hektopascal pres.
      Bemærk: Pulse længde og absolut tryk varierer afhængigt af antallet celler skal injiceres og kan ændres så de passer til individuelle behov.
   2. Trække microinjector apparater og fjerne ægget fra indehaveren efter pres injektion.
4. Tilsættes 1 mL varm HBSS dråbevis på fosteret, forsegle æg ved hjælp af gennemsigtig emballage tape og inkuberes i fugtig inkubator ved 38 ° C til 24 h post implantation.

7. isolering og analyse

1. Isolere vært embryoner i RT HBSS bruge pincet, tenotomy sakse og microspatula svarer til trin 4.3, og fix i 4% PFA natten over ved 4 ° C med blid vuggende.
2. Vask embryoner 3 x 5 min. i HBSS på RT med blid vuggende, og opbevar HBSS ved 4 ° C for videre downstream analyse (Mikroskopi, immunhistokemi, in situ hybridisering, osv.).

Representative Results

Efter 24 timers inkubation, hjerte og surround væv af vært embryoner blev isoleret, fotograferet (fig. 1A), og forarbejdet til immunfluorescent analyse. I dette eksempel donor atrieflimren myocytes var microinjected i den proepicardium af en lignende iscenesatte vært embryo. Værten embryonet blev derefter farves med muskel markør (MF20 grøn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå). Injicerede celler (rød) er klart synlig (figur 1B). Mulige justeringer til at overveje, hvis celler ikke er synlige omfatter: donorvæv var over fordøjet (celler ville være ude af stand til at vedhæfte), mærkning farvestof løsning var også fortyndet, celler var over vasket eller flere celledelinger resulterede i tab af etiketten.

For at bekræfte, at de injicerede celler i dette eksempel blev Myokardie, sectioned vi optisk denne embryoner ved hjælp af en Konfokal mikroskop (figur 1C-E). De eneste MF20 positive celler inden for den proepicardium (PE) er de fluorescerende rød positive celler, der blev focally implanteret.

Figur 1 : Repræsentant billeder af embryoner isoleret 24 timer post injektion. (A) lav forstørrelse brightfield billede af regionen stammen af et E3.5 (HH fase 19) kylling embryo. (B) fusioneret billede viser injiceres celler (rød), cardiomyocytes (grøn) og DAPI. Celler blev isoleret fra hjertets forkamre og microinjected i den proepicardium. (C) høj forstørrelse Konfokal imaging viser mærket celler i kernen af den proepicardium. (D) høj forstørrelse Konfokal imaging bekræfter CT rød mærket celler er cardiomyocytes. (E) tre-dimensionelle (3D) genopbygning af injicerede celler fra paneler D og E. På atria; OFT, udstrømning tarmkanalen; PE, proepicardium; VT, ventrikel; MF20, Myosin 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Muligheden for at definere hvordan microenvironmental betingelser indvirkning hjerte celle skæbne specifikation og afstamning stabilisering er grundlæggende for at skabe en trykstyrke forståelse af medfødt hjertesygdom samt at udvikle effektive protokoller for korrekt modning af stamceller eller somatisk reprograming-baseret cardiomyocytes. Protokollen skitseret ovenfor giver efterforskerne evnen til at direkte assay hjerte celle udvikling under ændret in vivo betingelser, giver mulighed for celle autonome modning processer skal adskilles fra paracrine/juxtacrine og/eller hæmodynamiske stikord. Når det kombineres med høj opløsning imaging, genetisk analyse og fysiologiske assays, kan denne teknik tjene som et stærkt supplement til eksisterende transgene modeller.

Danne en teknisk stå punkt, protokollen præsenteres her er afhængig af effektiv isolation, mærkning og præcise implantering af donor hjertet celler i vært embryonale væv. Brugen af en mikroinjektion systemet høj grad hjælpemidler i målretning af donor celler og giver mulighed for vellykket implantation uden behov for at skabe en stor engraftment site i værten væv. Nogle operationelle færdigheder er nødvendig for at udføre denne teknik dog som reducerede rentabilitet kan resultere hvis injektion nålen ikke placeres omhyggeligt i målvævet (forårsager brud af hjertet eller lokale Vaskulaturen). Pleje og tanke bør også gives til isolation og mærkning trin. Over fordøjelsen af donor væv kan føre til dårlig implantation effektivitet, og forbigående mærkning teknikker kan begrænse tidsvinduet over som donor celler kan spores (som celledeling kan fortynde etiketten).

Denne teknik er meget modificerbare og kan tilpasses til mange forskellige formål. Eksempelvis blive donor celler fra et stort udvalg af væv og faser kan være isoleret (selvom optimering af enzymatisk fordøjelsen er påkrævet) og kan ligeledes injiceret i en bred vifte af værten væv på tværs af forskellige udviklingstrin. Ligeledes, den mærkning tilgang kan ændres til at spore celler på tværs af forskellige tidsmæssige vinduer, herunder brug af fluorescerende uorganiske halvleder-nanokrystaller for længere forbigående mærkning og implantation af vagtler celler eller af celler fra grøn fluorescerende proteiner transgene (normal god landbrugspraksis +) donor embryoner¹¹ for permeant mærkning.

Mens vi i øjeblikket bruger denne teknik for aviær implantation undersøgelser, mener vi, at det kunne bruges til en lang række kimære undersøgelser i fremtiden. For eksempel kunne genmodificerede hjerte celler fra transgene organismer isoleret og microinjected ind i aviær hjertet ved hjælp af en meget lignende protokol. Derudover cellerne differentieres i cardiomyocytes fra stilke celler eller via reprograming tilgange i somatiske celler kunne være microinjected i embryonale hjertet til at evaluere deres integration i væv og/eller modning under in vivo biomekaniske betingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	BD	329654
1.7 mL Microtubes, Clear	Genesee Scientific	24-282
10 ml Syringe	BD	305482
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-430
15 mL Centriguge Tubes, Racked	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Incubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Needle	BD	305196
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Needle	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Wipes 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Angled Forceps	Fine Scientific Tools	11260-20
Backloading Tips	Eppendorf	930001007
Black India Ink	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Commercial Grade Packing Tape	Staples	2619001
Curved Tenotomy Scissors	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Hatching Eggs	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Micromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade	VWR	100496-496
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petri Dish	Genesee Scientific	32-107
Pipette Grinder	Narishige	EG-44
Pipette Puller	HEKA	PIP 6
Scotch Transparent Tape	Staples	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereo Microscope	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Transfer Pipette	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054