Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以提取, 解决和识别线粒体超级复合物, 最大限度地减少接触洗涤剂和库马西蓝。该协议提供了分辨率和酶活性保存之间的最佳平衡, 同时最大限度地降低了失去不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的风险。
Abstract
氧化磷酸化机械的配合物形成了超分子蛋白排列名为超复合物 (Sc), 这被认为是赋予线粒体结构和功能优势。从酵母到哺乳动物, 许多物种都发现了 Sc, 越来越多的研究报告说, 它们的组织在遗传和后天人类疾病方面受到干扰。因此, 越来越多的实验室对分析 SCs 感兴趣, 这在方法上具有挑战性。本文提出了一个优化的协议, 该协议结合了蓝色和透明原生 PAGE 方法的优点, 以一种具有时间有效的方式解析和分析 SCs。利用这种混合的 CN/BN-PAGE 方法, 用最佳数量的温和洗涤剂数字素提取的线粒体 Scs 在电泳开始时被短暂地暴露在阴离子染料 Coomassie Blue (CB) 中, 而不会接触到其他洗涤剂。这种短暂的接触 CB 可以像传统的 BN-PAGE 方法一样有效地分离和解决 Sc, 同时避免高 CB 水平对凝胶活性检测的负面影响, 以及 SCs 内不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。因此, 通过该协议, 可以将凝胶活性测量中的精确和快速与涉及二维电泳、免疫检测和蛋白质组学的分析技术结合起来, 对 SCs 进行高级分析。
Introduction
线粒体通过氧化磷酸化产生能量, 其中呼吸复合物 I-III-III-IV 氧化基板并将电子转移到氧气中, 产生允许 ATP 合成酶 (CV) 磷酸化 ADP 的梯度。在过去几年中, 广泛的研究表明, 呼吸链复合物不仅以线性的方式纳入线粒体内膜, 而且还被组织成超复合物 (sc) 安排1,2。在哺乳动物线粒体中, Sc存在于不同的化学特征中: CI/III 2/siv 1-4 (称为呼吸器 , 能够在体外进行 nadh:o2 氧化还原)2、CI/CIII 2 和ciii2siv1 - 23,4。此外, 呼吸复合物在其自由形态和在册种姓安排之间以不同的比率分布。因此, 据估计, 85%-100% 的 CI, 55%-65% 的 CIII, 15%-25% 的 CIV 是在 SCs4。这些超分子结构被认为可以减少 ROS 的产生, 稳定或协助单个复合物的组装, 调节呼吸链活动, 并防止蛋白质聚集在蛋白质丰富的线粒体膜5 ,6,7,8。他们的重塑能力根据能源需求的变化和他们在疾病的发病机制的重要性正在调查几个实验室 3,7,9,10,11,12,13,14. 研究表明, sc 组装中的病理改变存在于各种疾病中, 包括但不限于心磷脂合成中的遗传缺陷15、心力衰竭16、缺血再灌注17例, 糖尿病12例, 老年18 例。
本地电泳和免疫检测在 sc 研究中被广泛应用于解决 oxphos 复合物的第四纪安排2,19,20,21。本地电泳可以进一步结合特定的凝胶活性检测或 2d-sds page 页, 以实现精确的分子测定的各种 sc 组件1,19。研究 SCs 的能力在很大程度上取决于提取条件, 包括所使用的洗涤剂的类型和浓度、离子强度和 pH 值, 以及电泳迁移条件, 其中包括缓冲液组成、CB、凝胶的存在大小和丙烯酰胺百分比2。
协议和 Sc 波段分辨率在论文之间差别很大, 因此难以比较研究和方法的调整挑战22。因此, 本文提出了一种用非离子洗涤剂数字素从不同来源的分离线粒体中提取 Sc 的可靠、最优的方法, 并解决了高分子量 SCs 带的问题。优化的洗涤剂浓度、提取缓冲液的组成以及样品制备中不存在库马西蓝, 最大限度地减少了蛋白质复合物的破坏。该协议 (参见图 1的概述) 结合了 CN-PAGE 和 bn-page, 以优化大凝胶上的 sc 组件分辨率, 并与凝胶内活性检测兼容, 以便更好地显示反应带, 以及使用免疫检测的详细分析 Sc 的安排和组成。
Protocol
1. SC 萃取
- 通过在水中溶解 EDTA 制备100毫升的萃取缓冲液 (见表 2)。用 KOH 增加 pH 值, 直到完全溶解, 然后用 HCl 将 pH 值调整到 7.5. 将剩余的成分添加到溶液中, 用水完成到最终体积, 并保持在冰上。在管中, 溶解提取缓冲液中的数字素, 使10% 的库存溶液, 涡旋彻底, 直到完全溶解, 并保持在冰上。
注: 提取缓冲液可以提前准备, 并保持在4°c 下最多2个月。如果波纹带开始出现在凝胶的底部, 这意味着提取缓冲液太旧。在准备10% 的钱素溶液时, 如果使用小鼠肝脏线粒体, 准备一个库存体积计数500Μl 每个样本。二米体苷的溶解度随产地和产品批次的不同而不同 (见材料表)。 - 从动物组织 (小鼠心脏、肌肉、肝脏、大鼠心脏) 或使用标准协议 23、24、25的细胞 (人成纤维细胞) 中分离出的线粒体可用于提取 sc。一旦获得线粒体, 根据制造商的建议, 使用双链酸检测试剂盒量化蛋白质含量。补充分离的线粒体与蛋白酶和磷酸酶抑制剂在这一步骤, 根据需要。
注: SCs 可以在新鲜或解冻的线粒体上提取。建议同时从所有样品中提取 Sc, 以确保在相同条件下使用相同批次的溶液处理。 - 根据所获得的线粒体蛋白浓度和所需的最终数字蛋白比, 计算出所需的库存数宁溶液和提取缓冲液的体积. 对于 SC 提取, 为每10微克的线粒体蛋白添加含有数字素的1微米提取缓冲液 (表 2)。数聚糖/蛋白质比可以从2到8克不等。对于所使用的每种新类型的样品, 应始终执行数字宁滴定法 (例如, 请参见图 2 )。
- 颗粒线粒体, 在 1.5 ml 管中通过离心在 16, 000 x g, 在4°c 下 10分钟.
- 在计算出的含有数字素的冰凉萃取缓冲液中, 丢弃上清液并重新悬浮线粒体颗粒。将管放在微型管旋转器上, 在4°c 下以中等旋转速度孵育30分钟。确保样品得到适当的混合。
- 离心样品在 20, 400 x g在4°c 下 45分钟, 以去除不溶解的碎片。
- 在冰上的新管中转移上清液并量化蛋白质。这一比例代表呼吸超级复合物提取物。如果当天未进行电泳, 请将样品存放在-80°c。
注: 1) 避免提取物的冻融循环, 因为这会在第一次冷冻解冻周期之前破坏 SCs. Alicot 样品的较高分子排列。2) 要执行标准的 BN-PAGE 实验, 应在此步骤中将 CB 添加到 Sc 提取器中。与洗涤剂用量相比, 应按 1 g g 的比例添加 cb。
2. 梯度凝胶铸造和电泳
- 准备3x 梯度缓冲液和丙烯酰胺库存, 以制作梯度凝胶, 并将其储存在-20°c (见表 3)。
- 准备阳极和阴极缓冲器, 并保持在 4°c (见表 5)。
- 打开铸造室, 并在室内放置一个外玻璃板 (20 厘米 x 22 厘米)。使用对齐卡放置一组间隔 (1.5 mm), 以确保它们牢固地固定在腔体的侧面和角落。将内部玻璃板 (20 厘米 x 20 厘米) 放置在垫片的顶部 (形成凝胶三明治), 并在玻璃板的顶部放置塑料分离片。
- 重复步骤 2.3, 直到达到所需数量的凝胶施放。对于此协议, 将铸造4凝胶。我们使用的铸造室系统 (见材料表) 允许一次最多铸造10凝胶。通过根据需要先添加尽可能多的丙烯酸块, 然后在需要时添加玻璃板, 将剩余的空间占用。
注: 蒙太奇必须是紧密密封的;在室内的凝胶三明治之间应该没有空间。 - 在将垫片牢固地固定在垫片凹槽中之前, 先将一条护栏放在凹槽中。将密封板放在腔内, 拧紧所有6个螺钉。站在铸造室。
- 将梯度前置放在搅拌板上, 并在 "光" 混合室中使用磁力搅拌器。将浇注室的油管连接到梯度泵的前, 将管固定在蠕动泵的盒式磁带上, 并确保梯度泵的塞子是闭合的。
- 要铸造4凝胶, 请在 Erlenmeyer 烧瓶中准备 60 mL 的4% 和 60 mL 的12% 凝胶溶液 (见表 4), 并彻底旋转混合。在 "轻" 混合室中倒出 6 0 毫升的 4% 凝胶溶液, 在梯度前的 "重" 储集室中倒出 6 0 毫升的 1 2%。将搅拌板的搅拌速度设置为350转/分。打开旋塞, 在35转/分打开泵。
- 一旦轻的分数低于重分数, 暂停泵, 打开 "轻" 和 "重" 储罐之间的阀杆, 让分数体积平衡, 然后重新启动泵。
注: 重要的是, 没有气泡进入系统, 并被困在玻璃板之间。如果发生这种情况, 请撤消蒙太奇、清洗和重做。 - 一旦梯度凝胶完全倒, 停止泵, 并覆盖水 (约1毫升) 在每个凝胶三明治, 以防止干燥的凝胶。聚合2小时。
- 在 Erlenmeyer 准备25毫升堆叠凝胶, 并进行旋流彻底混合。去除水, 并在每个凝胶三明治中插入15声梳子。倒堆叠凝胶, 让聚合2小时。
注: 凝胶可以铸造并保持在4°c 下1周。 - 将凝胶插入三明治夹中, 取下梳子。在短玻璃板朝下的情况下, 将凝胶三明治插入冷却芯中。在另一侧重复, 并将核心放置在电泳槽中。
- 将300毫升的蓝色阴极缓冲器倒在电泳槽的内腔中。在电泳槽的外腔中倒出2升阳极缓冲器。
注: 电极必须浸入阴极缓冲器中, 这需要大约300毫升。 - 每口负载在75微克至175微克之间。在冷藏室 (4°C) 中以 150 V 运行凝胶1.5 小时 (或直到样品全部进入梯度凝胶)。
注 1:1) 每口至少需要 75μg, 以良好地解决凝胶内的活动带。超过175微克的蛋白质负载将导致由于酶活性过高而导致透明带的损失。2) 样品的副本应装载在单独的井中, 以便能够同时测定凝胶内的活性和对 OXPHOS 复合物进行免疫印迹分析。对 CI、CII、CIV 和 CV 的 iga 的平行测定要求至少为 300μg. ci、CII、CII、CIV 和 CV 的平行免疫印迹分析要求至少为375微克。 - 用移液器或真空去除蓝色阴极缓冲器, 更换300毫升 Coomassie 无蓝色阴极缓冲器, 并在冷藏室 (4°c) 以 200 V 过夜 (16–20小时) 运行凝胶。继续执行步骤3或4进行凝胶内活性测量或免疫印迹。
3. 配合物 I、II、IV 和 CV 的凝胶活性
- 在电泳结束前, 根据表 6制备凝胶内活性缓冲液, 并在 rt 保持在黑暗中. 凝胶活性缓冲液的 20 ml 足够3个样品通道。
注: 本 CV 凝胶活性检测基于 ATPsynthase (即 ATP 水解) 的反向活性, 并使用钙作为共同因子, 在凝胶中沉淀。钙的危害比其他协议中使用的铅要小。此外, 使用本协议不需要对凝胶23进行激活前调理。 - 停止电泳并找回凝胶。如有必要, 切割车道, 并在塑料袋中转移凝胶车道 (3 面切割, 塑料袋像书一样打开)。用热封口机密封3面中的2面。
注: 为了比较实验组之间的 SC 波段组成, 建议在同一凝胶上以复制的形式运行相同的样本。在不同的凝胶活性缓冲液 (CI、II、IV、V) 中切割车道以孵化每个复制。为了确认检测的特异性, 可以准备在存在特定呼吸链抑制剂的情况下, 在凝胶活性中运行更多的复制物。 - 对于3个实验样品 (即3口井), 加入20毫升凝胶活性缓冲液, 去除气泡, 并密封塑料袋的4 侧。
注: 如果进行负控制实验, 则添加抑制剂: CI: Rosenone 1Μm;CII: 马洛酸钠 10 mM;CIII: 抗霉素-a 8Μm;CIV: KCN 0.6 mM;CV:OIGOMYCIN 0.5Μm。 - 在黑暗中在37°c 时培育凝胶通道, 每15分钟检查一次, 孵化时间因蛋白质和复合物的含量而异。CI 的反应速度会比 CIV 或 CV 快. CII 和 CV 的最佳染色通常发生在 ci 的2小时、civ 的4小时和6小时之后。
- 冲洗水中的凝胶通道以停止反应, 并在白色背景上为 CI、CII、CIV 或 CV 的黑色背景图像。
注: 凝胶可在 RT 或4°c 的塑料袋中保存数月。
4. 免疫印迹
- 根据表 7准备转移缓冲, 并保持在 rt. 准备 TBST 和保持在 rt。
- 将整个凝胶或选定的通道放入容器中, 并添加带有 SDS 的转移缓冲区 (在转移缓冲区中为0.25% 为最终容器)。将容器放在摇杆上, 孵育1小时。
- 切割 PVDF 膜 (与凝胶大小相对应的大小), 在搅拌下在20毫升甲醇中激活 2分钟, 更换20毫升转移缓冲液, 放置在搅拌下2分钟。
- 准备转移三明治, 从下到上, 以确保没有凝胶和激活 PVDF 膜之间的气泡: 清晰的一面盒式磁带/黑色海绵/印迹纸/膜/印迹纸/吸墨纸/黑色海绵/黑色一面盒式磁带。关闭并锁定盒式磁带。
- 将转移三明治放置在转移槽中, 将三明治的清晰一侧面朝电极的红色一侧, 并倒出转移缓冲液, 将凝胶浸入水凝胶。将冷却系统连接到传输槽, 并设置为4°c。连接到电源, 设置为 40 mA, 并运行24小时。
- 在 TBST 中检索 5% BSA 中1小时的膜, 并在4°c 夜间在 5% BSA 中培养出的原代抗体溶液中。
注: 使用的抗体请参见表 8 。 - 在 TBST 3x 中冲洗膜, 每次10分钟。
- 在 TBST 中用 5% BSA 在室温下培养2小时的二级抗体溶液中的膜。
- 在 TBST 3x 中冲洗膜, 每次10分钟。
- 在膜和图像中添加化学发光溶液。
5. 分析
- 凝胶内活性检测图像或免疫细胞可用于分析 SCs。为了分析波段的组成, 对齐复制并验证对每个给定波段的复合反应呈正反应。
- 要分析各种超分子组件中的复合物的分布, 在 ImageJ 中打开图像, 并使用凝胶分析工具 (例如, 请参见图 5 )。
- 使用矩形工具选择车道, 并绘制车道。
- 绘制线以关闭每个感兴趣波段曲线下的区域, 然后使用魔杖工具单击每个区域, 以生成包含曲线值下的区域的表。
- 若要计算复杂的分布, 请报告每个波段相对于单体的值。
Representative Results
图 2显示了一个数字滴定实验的结果, 该实验旨在确定提取 sc 所需的适当数量的数字素。此数量将根据组织细胞类型以及样品是否被冻结而有所不同。在这个实验中, 进行了 CIV 在凝胶中的活性, 以可视化从新鲜的小鼠肝脏线粒体中分离出的 SCs。对蛋白质的比例从 2 ~ 1 到 ~ 1 g 的蛋白质进行了测试。该样品的最佳数字素量为 4 gg, 因为它提供了一个良好的单分子 CIV 和高分子量 SCs 的分辨率。在较低的比例下, 在电泳过程中, 带不清晰并分解成涂片, 而使用较高的数字素比导致高分子量 SC 的中断。
图 3和 图 4显示了用4克) 蛋白提取小鼠肝脏线粒体的完整实验结果。蛋白质使用混合型 BN/CN-PAGE、标准 BN-PAGE 或 CN-PAGE 分离。这三种凝胶都是同时铸造的, 车道上装满了同一样本的副本。电泳后, 在凝胶活性测量 (图 3上的 CI、cii、CIV 和 cv) 和免疫印迹 (图4上的 CI、cii、ciii、CIV、cv) 中, 对单个通道进行了切割和处理。
在阴极缓冲液 (即混合 cn/bn-page) 或在整个电泳过程中的样品和阴极缓冲液 (即 BN-PAGE) 中临时添加 CB, 大大提高了 SC 波段和单个呼吸复合物的流动性和分辨率, 并显著提高了单个呼吸复合体的流动性和分辨率。(图 3)。在 CIV 凝胶活性后, 带很容易与混合技术或 BN-PAGE 区分开来, 而在由 CN-PAGE 解析的同一样本中, 无法识别 sc 和单分子 CIV 反应带。
图 3和图 4显示, oxphos 单体和超分子组件的分辨率和条带模式在质量上可与混合 CN/BN-PAGE 和 bn-page 进行比较。然而, 存在着明显的差异。首先, 由于 CB 用量的减少, 使用混合 CN/BN-PAGE 条件与标准 BN-PAGE 分离蛋白质时, OXPHOS 复合物的电泳流动性略有降低。对于 CIV 单体, 这种移动性的转移更大, 其次是 CV 单体和 CI (图 3和图 4)。其次, 与 BN-PAGE 相比, 混合动力 CN/BN-PAGE 的蓝色背景较低 (图 3, 左车道)。因此, BN-PAGE 之后的高背景水平完全掩盖了 CII 的凝胶内活性染色, 并增强了与 CIV 二聚体活动相关的背景噪声 (图 3)。第三, 与 BN-PAGE (图 3) 相比, 在混合 CN/BN-PAGE 条件下运行样本时, CV 的活性较高 (图 3), 因为 cb 的用量减少, 这被认为会干扰 cv 的催化活性。26 cn/bn-page 还可以更好地保存 cv 超分子组件, 这表现在与 cv 二聚体相关的 cv 活性占总活性的更大比例 (图 3)。此外, CV 低聚物在 CN/BN-PAGE 下可见, 而在 BN-PAGE 条件下完全分离。有趣的是, 当样品在 CN/BN-PAGE 下运行时, CV 单体和二聚体之间也观察到不同的显示 cv 活性的带 (图 2)。
图 5显示了对超分子组件中 oxphos 复合分布的代表性分析。图为4种不同健康的小鼠肝脏线粒体制剂的样品凝胶活性中的 ci。密度测量分析可以测量 ci 反应带曲线下的面积, 并显示 C1 活性在单体 (I 1) 和超分子形式 (I1iii 2, i 1 iii2iv) 中的相对分布1、一、一、1iii 2iv n).类似的分析可以在免疫印迹之后进行。
图 1: 检测工作流.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: digitonin 滴定法从新鲜小鼠肝脏线粒体中提取超配合物.这个例子显示了小鼠肝脏线粒体的等价物, 从一种动物身上分离出来, 这种动物被用越来越多的钱素处理, 以提取呼吸超级复合物。然后用混合 CN/BN PAGE 对样品进行解析, 测定 CIV 的凝胶活性。CIV1: 复杂的 iv 单体;CIV2: 复杂的 iv 二聚体;SC: 超强复合物。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: oxphos 配合物在混合 CN/BN-PAGE、BN-PAGE 或 CN-PAGE 之后的凝胶活性.用多宁 (4 gp 比 digotoninn 蛋白) 对一只小鼠的肝脏线粒体进行治疗, 提取呼吸超复合物。然后将这一样品的液体装上三口不同的凝胶, 装入 CN/BN-PAGE、BN-PAGE 或 CN-PAGE。然后, 每个凝胶内的每个复制车道被切割, 并立即用于凝胶活性检测 (标记为 CI、CII、CIV 和 CV)。用一条车道作为控制, 用库马西蓝显示背景 (标记为 BG) 染色。OXPHOS 复合物和超分子组件是使用标准命名法确定的, 指数中的数字表明每个 OXPHOS 复合物的分子化学计量。应当指出的是, 含有 cii 的超分子组件的位置是基于免疫检测, 因为在这一特定实验中没有进行 CIII 的凝胶活性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 在混合 CN/BN-PAGE 或 BN-PAGE 之后对 oxphos 复合物进行免疫印迹分析.图 3图例中描述的实验中的副本在单个膜上进行了电传输。在转移后, 用识别 ci、CII、CIII、CIV 和 CV 的特定抗体对单个车道进行切割和孵育. 使用标准命名法确定 OXPHOS 复合物和超分子组件, 指数中的数字表明每个 OXPHOS 复合物的分子化学计量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 单体和超分子组件中 ci 分布的定量.(A) 在4个小鼠的肝脏线粒体 sc 提取物中, 在杂交的 cn/bn-page 中测定了 ci 在凝胶中的活性。(B) 使用 ImageJ 凝胶分析工具获得的密度图显示了与 ci 单体 (i 1) 和各种含有 ci 的超分子复合物 (i1iii, i 1 iii2iv1) 相对应的不同峰, 以及一.1iii 2iv n)。(C) 量化 c1 活动的相对分布。数据代表了4只小鼠的均值和 SEM。请点击这里查看此图的较大版本.
| Digitoninn/蛋白比 (g/g) | 2克 | 4克 | 6克 | 8克 |
| 萃取缓冲量 (μL) | 400人 | 300元 | 200人 | 100元 |
| 体积10% 股票数码 (μL) | 100元 | 200人 | 300元 | 400人 |
| 萃取缓冲液总量 (μL) | 500元 | 500元 | 500元 | 500元 |
表 1: 使用各种数字蛋白比从5毫克线粒体蛋白中提取 SCs 所需的数量。
| 复合 | 最终浓度 |
| EDTA, pH 值7。5 | 1米 |
| HEPES | 30米 |
| 醋酸钾 | 150米 |
| 甘油 | 12% |
| 6-氨基己酸 | 2米 |
表 2: SC 萃取缓冲液 (最终浓度).在4°c 下保存, 最长3个月。
| 复合 | 最终浓度 |
| 3X 凝胶缓冲器:液体并保持在-20°c, pH 值 7.5 | |
| 咪唑/hcl ph-7。0 | 75 mM |
| 6-氨基己酸 | 150万 |
| 丙烯酰胺缓冲器:液体并保持在-20°c | |
| 丙烯 酰 胺 | 99.5% |
| 双丙烯酰胺 | 3% |
表 3: 凝胶库存缓冲。
| 对于2凝胶: | 4% (60 毫升) | 12% (60 毫升) | 堆叠 (4%)(25 毫升) |
| 3X 凝胶缓冲器 | 19.8 毫升 | 19.8 毫升 | 8.25 毫升 |
| 丙烯酰胺缓冲器 | 4.8 毫升 | 14.4 毫升 | 2毫升 |
| H2o | 35毫升 | 13.1 毫升 | 14.6 毫升 |
| 甘油 | - | 12毫升 | - |
| APS 10% | 360μl | 60μl | 150μl |
| TEMED | 24μl | 12μl | 10μl |
表4:4–12% 梯度凝胶。
| 复合 | 最终浓度 |
| 阳极缓冲: 保持在 4°c, pH 值7。5 | |
| 咪唑 | 25米 |
| 阴极缓冲: 保持在 4°c, pH 7。5 | |
| 特里辛 | 50 mM |
| 咪唑 | 7.5 米 |
| 有或没有库马西蓝 (G250) | 0.022 |
表 5: 电泳缓冲器。
| 复合 | 最终浓度 |
| 复杂 I 活动缓冲器: 准备新鲜 5 mM TRIS-HCl pH 7。4 | |
| 硝基四唑蓝 | 3米 |
| Nadh | 14米 |
| 复杂 II 活性缓冲液: 在 5 mM TRIS-HCl pH 7.4 中制备新鲜 | |
| 琥珀酸 | 20米 |
| 私营军事和安保部 | 0.2 mM |
| 硝基四唑蓝 | 3米 |
| 复合体 IV 活性缓冲: 在 50 mM 钠磷酸盐7.2 中制备新鲜 | |
| 细胞色素 C | 0.05 mM |
| 二氨基苯并嗪 | 2.3 mM |
| Atpsy酶活性缓冲液: 在水中制备新鲜, 用 KOH 将 pH 值调整到8 | |
| 甘 氨 酸 | 50 mM |
| MgCl2 | 5米 |
| HEPES | 50 mM |
| Ccl2 | 30米 |
| Atp | 5米 |
表 6: 凝胶内活性检测缓冲液。
| 复合 | 最终浓度 |
| 传输缓冲区 | |
| Tris Base | 25米 |
| 甘 氨 酸 | 192 mM |
| Sds | 4% |
| 甲醇 | 20% |
| TBST | |
| Tris Base | 20米 |
| Nacl | 137 mM |
| Tween 20 | 0.1% |
表 7: 免疫印迹缓冲。
| 复杂 | 亚基 | 克隆 |
| 我 | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| 第二 | SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| 第三 | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| 四 | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | ATPB | 3D5 |
表 8: 用于免疫印迹检测呼吸链 SC 的抗体.请参阅公司材料表和批号。
Discussion
正在积极研究线粒体超级复合物, 以阐明它们的生理作用及其在许多人类疾病发病机制中的重要性, 无论是后天或遗传线粒体疾病3,7,9,10,11,12,13,14. 为了取得可靠的结果, 需要考虑几个方面。该协议已在小鼠肝脏线粒体、小鼠骨骼肌线粒体 (未显示结果)、大鼠心脏线粒体和人成纤维细胞线粒体 (未显示结果) 中进行了测试, 但肯定可以适应其他孤立来源线粒体。该方法最佳地结合了 bn 和 cn-page 协议的各个方面, 与已发布的协议20、27、28相比, 可将接触洗涤剂和阴离子化合物的风险降至最低。
样品制备
样品制备是成功分离 Sc 的关键一步. 应仔细选择缓冲液组合, 以实现蛋白质和蛋白质组件的适当增溶, 同时尽可能保持其功能和结构的完整性。提取缓冲液的离子强度和 pH 值是需要考虑的两个重要因素。盐浓度过低 (< 50 mM K-etate 或 NaCl) 会导致蛋白质在非离子洗涤剂存在下的增溶性较差, 而超过 500 mM 的盐浓度将促进蛋白质堆叠聚集, 并沉淀 cb 和蛋白质29。因此, 应使用近生理离子强度的缓冲液提取 Sc。关于 pH 值, 建议使用接近生理 pH 值。
洗涤剂类型和洗涤剂蛋白质比对于最佳的 SC 提取也是至关重要的。为了最大限度地保存原生的 SCs, 数字素是首选26。如本议定书和其他已公布的方法23、30、31、32所示, 这种温和的洗涤剂保留了多个 sc 组件的超分子组成, 以及二聚体和ATPsynthase 的寡聚结构 (图 3和图 4)。滴定不同数量的数字素的样品是至关重要的, 以确定条件, 允许最佳的增溶, 同时保持酶活性和生理蛋白质相互作用。滴定应在2至 8 g/26 之间进行滴定.分别用4、5和6克数清蛋白获得肝脏、骨骼肌和心脏线粒体的最佳结果。需要注意的是, 数字素可以被 Triton X-100 所取代, 在最佳条件下, 它会产生与数字素2观察到的类似的迁移和 sc 成分。但是, 应谨慎使用这种洗涤剂, 因为洗涤剂/蛋白质比率的相对较小的增加 (例如, 从1到 1.5 g/g) 可能导致 SCs 组件2的完全离解, 这可能导致实验不一致。提取后, 传统上补充样品与库马西蓝, 以给予蛋白质时, 应用于凝胶, 除了传统的 cn-page20,26。为了最大限度地减少蛋白质暴露于库马西蓝和不稳定的蛋白质潜在离解, 样品没有补充库马西蓝在这个协议。
电泳
CN-PAGE 和 BN-PAGE 都被用来研究线粒体 OXPHOS 复合物, 它们都有明显的优点和局限性。在 CN-PAGE 下使用的较温和条件 (主要是缺乏 CB, 具有洗涤剂样效应), 可以更好地保存 ATP 合酶在凝胶活性, 并限制高分子量 sc 和 ATP 合酶中不稳定蛋白的分离程序集26。然而, 蛋白质提取物和电泳缓冲液中缺乏阴离子染料 CB 会导致蛋白质根据其固有电荷和等电点迁移, 从而降低凝胶26内蛋白质的电泳流动性。此外, 在没有 cb 的情况下, 负电荷不足的蛋白质往往聚集在一起, 从而降低凝胶 20,26中蛋白质复合物的分辨率。为了规避这些限制, Wittig 和 Schragger20开发了所谓的高分辨率 cn-page。在该协议中, 脱氧胆酸钠 (DOC) 和各种轻度非离子洗涤剂 (DDM, Triton X100) 被添加到阴极缓冲液中, 以保持膜蛋白的溶解性, 并对蛋白质施加负电荷转移, 从而有了相当大的改进。第20号决议的执行情况。
目前的混合 CN/BN 协议的一个显著特点是, 如果没有这些洗涤剂, 可以达到类似的分辨率。在电泳开始时将 CB 瞬间加入阴极缓冲液, 足以限制蛋白质聚集, 增强凝胶中的流动性 (图 3和图 4)。因此, 这种混合技术能够出色地分辨率的不同 SC 组件和非常低或没有接触洗涤剂。CB 含量较低还可以更好地保持 CV 活性, 更好地保存二聚体和寡聚 cv 组件 (图 3和 Wittig 和 Schägger 200526), 并减少蓝色背景噪音, 从而降低蓝色背景噪音。阻碍凝胶活性的定量, 特别是 CII 和 CIV (图 2)。此外, 蛋白质提取物中缺乏 CB 限制了 Sc 内不稳定蛋白质相互作用的破坏。例如, ATP 合酶与 ANT 形成合成物33或使用环磷素-d 调节 ptp 开口34的物理关联, 在没有 cb 的情况下表现得更好。因此, 仅在电泳过程中瞬间接触 CB 可能有助于揭示 Sc 内部新的蛋白质相互作用. 总体而言, 这种混合的 cn/bn-page 协议允许将凝胶活性测量中的精确和快速与分析结合起来用于 Scs 高级分析的二维电泳、免疫检测和蛋白质组学技术。应当指出的是, 随着人们对 Sc 的兴趣越来越大, 越来越多的研究将 10 x 10 厘米的小凝胶用于原生 PAGE。虽然这种方法可能足以确定丰度 SC 组件的总体变化, 但小凝胶的较低分离能力可能仅限于解决细微的重新排列或切断不同的带进行蛋白质组学分析。此外, 一些使用较小凝胶的研究报告说, 呼吸酶的迁移大小与 ATPsynthase 二聚体相同, 因此很难将其分离 22.因此, 应赞成使用大型凝胶。
Disclosures
没有
Acknowledgments
作者感谢 Jenna Rossi 的技术援助, 感谢 Mireille Khacho 博士、David Patten 博士和 Ujval Anil Kumar 博士在开发这种方法时进行的有益讨论。这项工作由加拿大卫生研究所和加拿大国家科学和工程理事会资助。AC 是博士奖的获得者-弗雷德里克·班廷和查尔斯最佳加拿大研究生奖学金 (CIHR)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
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