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Biochemistry

हाइब्रिड स्पष्ट/माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला Supercomplexes के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए प्राकृतिक इलेक्ट्रोफोरेसिस

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/59294
Automatic Translation
1, 1
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Ottawa

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल को निकालने, संकल्प और माइटोकॉन्ड्रियल supercomplexes जो डिटर्जेंट और coomassie नीला करने के लिए जोखिम कम पहचान करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल संकल्प के बीच एक इष्टतम संतुलन, और एंजाइम गतिविधियों के संरक्षण प्रदान करता है, जबकि अस्थिर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत खोने के जोखिम को कम करने ।

Abstract

ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीलेशन मशीनरी के परिसरों सुपरकॉम्प्लेक्स (एससीएस) नाम से अधिमोलाकुलर प्रोटीन व्यवस्था बनाते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रिया को संरचनात्मक और कार्यात्मक लाभ प्रदान करने के लिए माना जाता है । कई प्रजातियों में अनुसूचित जातियों की पहचान की गई है, खमीर से स्तनपायी, और अध्ययन की एक बढ़ती हुई संख्या रिपोर्ट में उनके संगठन के आनुवंशिक और अधिग्रहीत मानव रोगों में व्यवधान । नतीजतन, प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या अनुसूचित जातियों का विश्लेषण करने में रुचि रखती है, जो कि methodologically चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यह आलेख एक ऑप्टिमाइज़ किया गया प्रोटोकॉल जो नीले और स्पष्ट-मूल पृष्ठ विधियों के लाभों को हल करने और एक समय प्रभावी तरीके से SCs का विश्लेषण करने के लिए जोड़ती है प्रस्तुत करता है । इस हाइब्रिड CN/बीएन-पृष्ठ विधि के साथ, माइटोकॉन्ड्रियल अनुसूचित जाति हल्के डिटर्जेंट डिजिटोनिन की इष्टतम मात्रा के साथ निकाला संक्षेप ऋणायनी डाई coomassie नीले (सीबी) के लिए संक्षिप्त उजागर कर रहे हैं electrophoresis की शुरुआत में, अन्य डिटर्जेंट के लिए जोखिम के बिना. सीबी के लिए यह कम जोखिम अलग और अनुसूचित जातियों के रूप में प्रभावी रूप से पारंपरिक बीएन पृष्ठ के तरीकों के साथ के रूप में हल करने के लिए अनुमति देता है, जबकि में जेल गतिविधि assays हैं, और अस्थिर प्रोटीन प्रोटीन-अनुसूचित जातियों के भीतर बातचीत पर उच्च सीबी स्तर के नकारात्मक प्रभाव से परहेज । इस प्रोटोकॉल के साथ यह संभव है कि जेल गतिविधि मापन में सटीक और तेजी से गठबंधन करने के लिए 2 डी electrophoresis, immuno पता लगाने, और/

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीलेशन के माध्यम से ऊर्जा का उत्पादन करता है, जहां श्वसन परिसरों i-ii-iii-IV ऑक्सीकरण substrates और ऑक्सीजन के लिए स्थानांतरित इलेक्ट्रॉनों, एक ढाल है कि एटीपी सिंथेस (CV) द्वारा adp के फ़ॉस्फोरीलेशन की अनुमति देता है पैदा । पिछले वर्षों में, व्यापक अध्ययनों से पता चला है कि श्वसन श्रृंखला परिसरों को केवल भीतरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में रेखीय तरीके से शामिल नहीं किया जाता है, बल्कि इसे सुपरकॉम्प्लेक्स (एससीएस) व्यवस्था1,2में भी व्यवस्थित कर दिया जाता है । स्तनधारी mitochondria में, एससी अलग stoichiometries में मौजूद हैं: CI/CIII2/ciii1-4 (जो respirasome नाम है, और जो nadh में सक्षम है: ओ2 oxidoreduction में विट्रो)2, सीआई/ /Civ1-23,4। इसके अलावा, श्वसन परिसरों को उनके मुक्त रूप और अनुसूचित जातियों की व्यवस्थाओं के बीच विभिन्न अनुपात में वितरित किया जाता है । इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि अनुसूचित जातियों में 85 प्रतिशत-100 प्रतिशत सीआई, 55 प्रतिशत-सीआईटीआई का 65 प्रतिशत और सीआईवी का 15 प्रतिशत-25 प्रतिशतएससी में पाया जाता है । इन supramolecular संरचनाओं ROS उत्पादन में कमी करने के लिए सोचा रहे हैं, स्थिर या व्यक्तिगत परिसरों की विधानसभा में सहायता, श्वसन श्रृंखला गतिविधि को विनियमित, और प्रोटीन अमीर भीतरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने5 ,6,7,8. ऊर्जा की मांग में भिन्नता और रोगों के रोगजनन में उनके महत्व पर उनके रीमॉडलिंग क्षमता कई प्रयोगशालाओं में जांच की जा रही है3,7,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. अध्ययनों से साबित कर दिया है कि अनुसूचित जाति विधानसभा में रोग परिवर्तन सहित विकारों की एक किस्म में मौजूद हैं, लेकिन तक ही सीमित नहीं है, cardiolipin संश्लेषण15में आनुवंशिक दोष, दिल की विफलता16, ischemia-17reperfusion,12मधुमेह, और उंर बढ़ने18।

स्थानीय इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोडिटेक्शन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है SCs में oxphos परिसरों चतुर्थ व्यवस्था2,19,20,21को हल करने के लिए अध्ययन । देशी वैद्युतकणसंचलन आगे जेल गतिविधि में विशिष्ट के साथ संयुक्त किया जा सकता है assays है या 2d-sds पृष्ठ विभिंन अनुसूचित जातियों विधानसभाओं1,19के सटीक आणविक निर्धारण को सक्षम करने के लिए । अनुसूचित जातियों के अध्ययन करने की क्षमता गंभीर रूप से निष्कर्षण शर्तों पर निर्भर है, प्रकार और डिटर्जेंट का इस्तेमाल किया, ईओण ताकत और पीएच, साथ ही साथ electrophoretic प्रवास शर्तों, जो बफर संरचना शामिल पर, सीबी की उपस्थिति, जेल आकार, और एक्रिलामाइड प्रतिशत2।

प्रोटोकॉल और सीएस बैंड संकल्प कागज के बीच काफी भिंनता है, अध्ययन मुश्किल और22चुनौतीपूर्ण तरीकों के अनुकूलन के बीच तुलना कर रही है । इसलिए, इस पत्र में गैर-आयनिक डिटर्जेंट डिजिटोइन के साथ विभिन्न स्रोतों के अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया से अनुसूचित जातियों को निकालने और उच्च आण्विक वजन वाले एससीएस बैंड को हल करने के लिए एक मजबूत और इष्टतम प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है । अनुकूलित डिटर्जेंट एकाग्रता, निष्कर्षण बफर की संरचना, और नमूना तैयार करने में Coomassie नीले रंग की अनुपस्थिति प्रोटीन परिसरों के विघटन को कम । इस प्रोटोकॉल (एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें) को जोड़ती है CN-पृष्ठ और बीएन-पृष्ठ के लिए इष्टतम SCs विधानसभाओं संकल्प बड़े जेल पर, और के साथ संगत है जेल में गतिविधि assays हैं, प्रतिक्रियाशील बैंड के बेहतर दृश्य की अनुमति के उपयोग के साथ एक विस्तृत विश्लेषण के लिए immunodetection SCs व्यवस्था और संरचना.

Protocol

1. अनुसूचित जाति निष्कर्षण

  1. निष्कर्षण बफर के १०० मिलीलीटर तैयार ( तालिका 2देखें) edta पानी में भंग करके । KOH के साथ पीएच को पूरी तरह से भंग जब तक वृद्धि, तो एचसीएल के साथ ७.५ के लिए पीएच समायोजित करें । शेष घटकों को समाधान में जोड़ें, पानी के साथ अंतिम मात्रा को पूरा करें, और बर्फ पर रखें । एक ट्यूब में, एक 10% स्टॉक समाधान बनाने के लिए निष्कर्षण बफर में डिजिटोनिन भंग, भंवर पूरी तरह से जब तक भंग, और बर्फ पर रखने के लिए ।
    नोट: निष्कर्षण बफर अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 2 महीने के लिए अधिकतम 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा । अगर लहराती बैंड जेल के नीचे प्रकट करने के लिए शुरू, इसका मतलब है निष्कर्षण बफर बहुत पुराना है । जब 10% डिजिटोनिन समाधान तैयार करने, एक शेयर की मात्रा की गणना ५०० μl प्रति नमूना अगर माउस जिगर mitochondria का उपयोग कर । डिजिटोनइन घुलनशीलता में भिन्नता और उत्पाद लॉट ( सामग्री तालिकादेखें) पर निर्भर करता है ।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया जानवरों के ऊतकों से अलग (माउस दिल, मांसपेशी, जिगर; चूहा दिल) या कोशिकाओं (मानव फाइकोब्लास्ट) मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर23,24,25 अनुसूचित जातियों के निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त कर रहे हैं, प्रोटीन सामग्री मात्रा का उपयोग कर bicinchoninic एसिड परख किट निर्माता की सिफारिशों के अनुसार । जरूरत के रूप में इस कदम पर proteases और फ़ॉसटैसिस अवरोधकों के साथ अलग माइटोकॉन्ड्रिया अनुपूरक ।
    नोट: अनुसूचित जातियों या तो ताजा या thawed mitochondria पर निकाला जा सकता है । यह एक ही समय में सभी नमूनों से अनुसूचित जाति निकालने के लिए सिफारिश की है, बीमा के लिए वे समाधान के एक ही बैचों के साथ और एक ही शर्तों के तहत इलाज किया जाता है ।
  3. माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सांद्रता प्राप्त करने के आधार पर, और अंतिम डिजिटोनिन/प्रोटीन अनुपात वांछित, स्टॉक की मात्रा की गणना डिजिटोनइन समाधान और निष्कर्षण बफर आवश्यक तालिका 1के अनुसार । SC निष्कर्षण के लिए, प्रत्येक 10 माइक्रोग्राम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के लिए डिजिटोनयुक्त निष्कर्षण बफर (तालिका 2) का 1 μl जोड़ें । डिजिटोनइन/प्रोटीन अनुपात 2 से 8 ग्राम/ग्राम तक भिन्न हो सकता है । एक डिजिटोनिन अनुमापन हमेशा इस्तेमाल किया नमूना के प्रत्येक नए प्रकार के लिए किया जाना चाहिए (एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें) ।
  4. गोली माइटोकॉन्ड्रिया, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में १६,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रण द्वारा ।
  5. Supernatant छोड़ें और बर्फ की गणना की मात्रा में माइटोकॉन्ड्रियल गोली फिर से निलंबित-ठंडा निकालने digitonin युक्त बफर । एक मिनी ट्यूब अंग को घुमानेवाला पर प्लेस ट्यूबों और 30 मिनट के लिए एक मध्यम रोटेशन की गति से 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते । सुनिश्चित करें कि नमूने ठीक से मिलाया जा रहा है ।
  6. २०,४०० x g में 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूने insolubilized टुकड़े को दूर करने के लिए ।
  7. बर्फ पर एक नई ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और प्रोटीन की मात्रा । इस अंश श्वसन supercomplexes निकालने का प्रतिनिधित्व करता है । यदि एक ही दिन पर इलेक्ट्रोफोरेसिस नहीं किया जाता है, तो नमूने को-८० ° c पर संग्रहित करें ।
    नोट: 1) निकालने की फ्रीज/गल चक्र से बचें, क्योंकि इससे अनुसूचित जातियों की उच्च आण्विक व्यवस्थाएं बाधित होती हैं । पहले फ्रीज करने से पहले Aliquot नमूना/ 2) एक मानक BN-पृष्ठ प्रयोग करने के लिए, सीबी इस कदम पर SCs निकालने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । सीबी का उपयोग डिटर्जेंट की मात्रा के सापेक्ष 1g/8g अनुपात में जोड़ा जाना चाहिए ।

2. ग्रैडिएंट जेल कास्टिंग और Electrophoresis

  1. ढाल जेल, aliquot बनाने के लिए 3x ढाल बफर और एक्रिलामाइड शेयरों तैयार है, और दुकान में-20 डिग्री सेल्सियस ( तालिका 3देखें) ।
  2. एनोड और कैथोड बफ़र्स तैयार करें और 4 ° c पर रखें ( तालिका 5देखें) ।
  3. कास्टिंग चैंबर खोलें और एक बाहरी ग्लास प्लेट (20 सेमी x 22 सेमी) को चैंबर में रखें । स्थान एक सेट spacers के (१.५ मिमी) संरेखण कार्ड का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए वे पक्ष और चैंबर के कोनों के खिलाफ मजबूती से बैठे हैं. एक इनर ग्लास प्लेट (20 सेमी x 20 सेमी) spacers के शीर्ष पर रखें (यह जेल सैंडविच रूपों), और कांच की थाली के शीर्ष पर एक प्लास्टिक जुदाई चादर डाल दिया ।
  4. दोहराएँ चरण २.३ तक डाली करने के लिए जैल की वांछित संख्या तक पहुँच गया है. इस प्रोटोकॉल के लिए, 4 जैल casted हैं । कास्टिंग चैंबर प्रणाली हम ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग एक समय में 10 जैल की एक अधिकतम की ढलाई की अनुमति देता है । पहले की जरूरत के रूप में कई एक्रिलिक ब्लॉकों के रूप में जोड़ने के द्वारा चैंबर में शेष जगह ले लो, और फिर कांच प्लेटें अगर जरूरत है ।
    नोट: असेंबल कसकर बंद हो गया है; चैंबर में जेल सैंडविच के बीच में जगह नहीं होनी चाहिए ।
  5. गैस्केट पायदान में गैसकेट मजबूती से बैठने से पहले नाली में parafilm की एक पट्टी रखें । चैंबर पर सील थाली प्लेस और सभी 6 शिकंजा कस । कास्टिंग चैंबर खड़े हो जाओ ।
  6. प्लेस "लाइट" मिश्रण चैंबर में एक चुंबकीय विलोडक के साथ एक हलचल थाली पर पूर्व ढाल । ढाल पूर्व के कास्टिंग चैंबर के टयूबिंग कनेक्ट, सिकुड़नेवाला पंप के कैसेट में टयूबिंग सुरक्षित है, और सुनिश्चित करें कि ढाल पूर्व के रोधनी बंद कर दिया है ।
  7. 4 जैल कास्ट करने के लिए, 4% की ६० मिलीलीटर और 12% जेल समाधान के ६० मिलीलीटर तैयार ( तालिका 4देखें) एक Erlenmeyer फ्लास्क और भंवर में अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । "लाइट" मिश्रण कक्ष में 4% जेल समाधान के ६० मिलीलीटर डालो, और 12% के ६० मिलीलीटर "भारी" ढाल पूर्व के जलाशय चैंबर में । ३५० rpm पर हलचल थाली की हलचल गति सेट करें । स्टॉपकॉक खोलें और ३५ rpm पर पंप चालू करें ।
  8. एक बार प्रकाश अंश भारी अंश से कम है, पंप को थामने और "प्रकाश" और "भारी" जलाशयों के बीच वाल्व स्टेम खुला, भिन्न मात्रा equilibrate चलो, और पंप को पुनः आरंभ.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कोई बुलबुले प्रणाली में प्रवेश और कांच प्लेटों के बीच फंस जाते हैं । यदि ऐसा होता है, तो असेंबल, वॉश, और फिर से करना पूर्ववत करें ।
  9. एक बार ग्रेडिएंट जेल पूरी तरह से डाल दिया है, पंप बंद करो, और ओवरले पानी (के बारे में 1 मिलीलीटर) प्रत्येक जेल सैंडविच पर जेल के सूखने को रोकने के लिए । दो घंटे के लिए polymerize करते हैं ।
  10. Erlenmeyer और भंवर में 25 मिलीलीटर stacking जेल तैयार करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण । पानी निकालें और प्रत्येक जेल सैंडविच में 15 अच्छी तरह से कंघी डालें । डालो stacking जेल और दो ज के लिए polymerize ।
    नोट: जैल casted और 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  11. सैंडविच clamps में डालें जेल और कंघी निकालें । कम ग्लास प्लेट नीचे का सामना करना पड़ के साथ, ठंडा कोर में जेल सैंडविच डालें । दूसरी तरफ दोहराने, और जगह वैद्युतकणसंचलन टैंक में कोर ।
  12. वैद्युतकणसंचलन टैंक के इनर चैंबर में नीले कैथोड बफर के ३०० मिलीलीटर डालो । इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक के बाहरी कक्ष में Anode बफर के 2 एल डालो ।
    नोट: इलेक्ट्रोड कैथोड बफर में डूबे हुए है, जो लगभग ३०० मिलीलीटर की आवश्यकता है ।
  13. प्रति अच्छी तरह से ७५ माइक्रोग्राम और १७५ माइक्रोग्राम प्रोटीन के बीच लोड । १.५ एच के लिए १५० वी पर जेल भागो (या नमूने सभी ग्रेडिएंट जेल में प्रवेश किया है जब तक) ठंडे कमरे में (4 ° c) ।
    नोट 1:1) एक ंयूनतम ७५ माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से में जेल गतिविधि बैंड के अच्छे समाधान के लिए आवश्यक है । १७५ माइक्रोग्राम से अधिक प्रोटीन लोड हो रहा है अत्यधिक एंजाइम गतिविधि के कारण स्पष्ट बैंड की हानि के लिए नेतृत्व करेंगे । 2) नमूने की replicates अलग कुओं में लोड किया जाना चाहिए में जेल गतिविधियों और OXPHOS परिसरों की immunoblot विश्लेषण के समानांतर निर्धारण सक्षम । सीआई, सीआईआई, सीआईवी और सीवी के लिए आईजीए के समानांतर निर्धारण के लिए न्यूनतम ३०० μg की आवश्यकता होती है । भारतीय उद्योग परिसंघ, सीआईआई, सीआईवी और सीवी के समानांतर इम्यूनोलॉट विश्लेषण के लिए न्यूनतम ३७५ μg की आवश्यकता होती है ।
  14. पिपेट या वैक्यूम के साथ नीले कैथोड बफर निकालें, ३०० मिलीलीटर coomassie ब्लू-फ्री कैथोड बफर, से बदलें और २०० वी पर जेल चलाने के ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में रात (16-20 ज) । चरण 3 या 4 में जेल गतिविधि माप या immunoblotting के लिए आगे बढ़ें ।

3. में जेल गतिविधि परिसरों मैं, द्वितीय, चतुर्थ और सीवी के लिए

  1. Electrophoresis के अंत से पहले, तालिका 6के अनुसार में जेल गतिविधि बफ़र्स तैयार है, और आरटी में अंधेरे में रखने के लिए । 20 मिलीलीटर में जेल गतिविधि बफर 3 नमूना गलियों के लिए पर्याप्त है ।
    नोट: यह CV में जेल गतिविधि परख ATPsynthase की रिवर्स गतिविधि पर आधारित है (यानी, एटीपी hydrolysis), और एक सह कारक है, जो जेल में precipitates के रूप में कैल्शियम का उपयोग करता है । कैल्शियम अन्य प्रोटोकॉल्स में इस्तेमाल होने वाले लेड से कम नुकसानदेह होता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक पूर्व सक्रियण की आवश्यकता नहीं है/
  2. वैद्युतकणसंचलन बंद करो और जेल निकालते हैं । कट लेन, यदि आवश्यक हो, और प्लास्टिक की थैलियों में जेल लेन हस्तांतरण (3 पक्षों में कटौती, और प्लास्टिक की थैली एक पुस्तक की तरह खोला) । एक हीट मुहर के साथ 3 पक्षों के सील 2 ।
    नोट: प्रयोगात्मक समूहों के बीच अनुसूचित जाति बैंड की संरचना की तुलना करने के लिए, यह एक ही जेल पर प्रतिकृति में एक ही नमूने चलाने के लिए सिफारिश की है. गलियों कट करने के लिए अलग में जेल गतिविधि बफ़र्स (सीआई, द्वितीय, चतुर्थ, वी) में प्रत्येक प्रतिकृति सेते करने के लिए । Assays हैं की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, अतिरिक्त प्रतिकृति विशिष्ट श्वसन श्रृंखला अवरोधकों की उपस्थिति में जेल की गतिविधियों में चलाने के लिए तैयार किया जा सकता है ।
  3. 3 प्रयोगात्मक नमूनों (यानी 3 कुओं) के लिए, में जेल गतिविधि बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ने, बुलबुले हटाने, और प्लास्टिक की थैली के 4वें पक्ष सील ।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों में inhibitors जोड़ें यदि प्रदर्शन किया: CI: Rotenone 1 μM; सीआईआई: सोडियम मैलोनेट 10 मिमी; CIII: Antimycin-एक 8 μM; CIV: KCN ०.६ मिमी; हालांकि, मशीन ०.५-अनुवादित आलेख हमेशा सटीक नहीं होते हैं.
  4. अंधेरे में ३७ डिग्री सेल्सियस पर जेल लेन और हर 15 मिनट की जांच । ऊष्मायन समय प्रोटीन और परिसरों की मात्रा के आधार पर बदलता रहता है । CI CIV या CV से भी अधिक तेजी से प्रतिक्रिया होगी । अधिकतम धुंधला आमतौर पर 2 के बाद होता है, CI के लिए एच, CIV के लिए 4 ज और सीआईआई और सीवी के लिए 6 एच ।
  5. पानी में जेल गलियों कुल्ला करने के लिए प्रतिक्रिया बंद करो, और CI, सीआईआई, CIV, या काले रंग की पृष्ठभूमि के लिए एक सफेद पृष्ठभूमि पर छवि CV के लिए ।
    नोट: जैल कई महीनों के लिए आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक की थैलियों में रखा जा सकता है ।

4. इम्यूनोलोटिंग

  1. तालिका 7के अनुसार हस्तांतरण बफ़र तैयार करें, और RT. TBST तैयार रखें और rt पर रखें ।
  2. पूरे जेल, या चयनित गलियों प्लेस, एक कंटेनर में और हस्तांतरण बफर जोड़ने SDS के साथ पूरक (०.२५% स्थानांतरण बफर में अंतिम). रॉकर पर प्लेस कंटेनर और 1 ज के लिए सेबेट
  3. पीवीडीएफ झिल्ली कट (जेल के आकार के अनुरूप आकार) और 2 मिनट के लिए आंदोलन के तहत 20 मिलीलीटर मेथनॉल की जगह में सक्रिय । 2 मिनट के लिए आंदोलन के तहत 20 मिलीलीटर हस्तांतरण बफर और स्थान से बदलें ।
  4. , नीचे से शीर्ष करने के लिए स्थानांतरण सैंडविच तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ जेल और सक्रिय PVDF झिल्ली के बीच कोई बुलबुला है: कैसेट के स्पष्ट पक्ष/ बंद करो और कैसेट ताला ।
  5. स्थानांतरण टैंक में स्थानांतरण सैंडविच, इलेक्ट्रोड के लाल पक्ष का सामना करना पड़ सैंडविच के स्पष्ट पक्ष के साथ प्लेस, और जेल immerge करने के लिए स्थानांतरण बफर डालना. स्थानांतरण टैंक के लिए शीतलन प्रणाली कनेक्ट और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट । बिजली की आपूर्ति करने के लिए कनेक्ट, ४० mA पर सेट, और 24 घंटे के लिए चला रहे हैं ।
  6. झिल्ली निकालते हैं, ब्लॉक में 1 एच के लिए 5% TBST में बीएसए, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट 5% में बीएसए तैयार TBST में रात भर में 4 ° c ।
    नोट: इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए तालिका 8 देखें ।
  7. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3x TBST में कुल्ला झिल्ली ।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली से सेने में तैयार 5% में बीएसए TBST में 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।
  9. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3x TBST में कुल्ला झिल्ली ।
  10. झिल्ली और छवि के लिए chemiluminescent समाधान जोड़ें ।

5. विश्लेषण

  1. में जेल गतिविधि परख छवियों या immunoblots अनुसूचित जातियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बैंड की संरचना का विश्लेषण करने के लिए, प्रतिकृति संरेखित करें और जो जटिल प्रत्येक दिए गए बैंड के लिए सकारात्मक प्रतिक्रिया व्यक्त की है ।
  2. परिसरों के वितरण का विश्लेषण करने के लिए, विभिन्न supramolecular विधानसभाओं में, ImageJ में छवियों को खोलने और जेल विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें (एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें).
    1. आयत उपकरण, और प्लॉट लेन के साथ गलियों का चयन करें ।
    2. लाइनों ड्रा के लिए ब्याज की प्रत्येक बैंड के वक्र के तहत क्षेत्र को बंद करने और छड़ी उपकरण के साथ प्रत्येक क्षेत्र पर क्लिक करें वक्र मूल्यों के तहत क्षेत्र युक्त एक मेज उत्पंन करने के लिए ।
    3. कॉंप्लेक्स के वितरण की गणना करने के लिए, monomer के सापेक्ष प्रत्येक बैंड के लिए मानों की रिपोर्ट करें ।

Representative Results

चित्रा 2 एक डिजिटोनिइन टाइट्रेट करने के प्रयोग से परिणाम दिखाता है जिसका उद्देश्य अनुसूचित जातियों के निष्कर्षण के लिए अपेक्षित डिजिटोइन की उचित मात्रा की पहचान करना है । यह राशि ऊतक/सेल के प्रकार के आधार पर अलग होगी और यह कि नमूना जम गया है या नहीं । इस प्रयोग के लिए, एक CIV में जेल गतिविधि ताजा माउस जिगर mitochondria से अलग अनुसूचित जातियों कल्पना करने के लिए किया गया था । 2/1 से 10/1 जी डिजिटोनइन/जी प्रोटीन के अनुपात का परीक्षण किया गया । इस नमूने के लिए डिजिटोनिन की इष्टतम राशि 4 g/g है, के रूप में यह एकलक civ का एक अच्छा संकल्प प्रदान करता है, और उच्च आणविक वजन अनुसूचित जाति । कम अनुपात में, बैंड स्पष्ट नहीं है और electrophoresis के दौरान एक धब्बा में हल कर रहे हैं, जबकि डिजिटोनिन के उच्च अनुपात का उपयोग उच्च आणविक वजन अनुसूचित जाति के विघटन की ओर जाता है ।

चित्र 3 और चित्र 4 माउस लिवर माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी पर किए गए एक पूर्ण प्रयोग के परिणामों को दिखाएँ जो 4 ग्राम डिजिटोइन/जी प्रोटीन के साथ निकाले गए हैं । संकर BN/CN-पृष्ठ, मानक BN-पृष्ठ, या CN-पृष्ठ का उपयोग कर प्रोटीन अलग किए गए थे । सभी तीन जैल एक ही समय में casted थे और गलियों एक ही नमूने की प्रतिकृति से भरी हुई थी । Electrophoresis के बाद, व्यक्तिगत लेन काट रहे थे और जेल गतिविधि मापन में के लिए संसाधित (CI, सीआईआई, CIV और CV चित्रा 3पर) और immunoblotting (CI, सीआईआई, CIV, CIV, cv चित्रा 4पर) ।

सीबी के अतिरिक्त कैथोड बफर में या तो क्षण भर (यानी हाइब्रिड CN/बीएन-पृष्ठ) या में नमूना और कैथोड बफर में वैद्युतकणसंचलन (यानी बीएन-पृष्ठ), काफी गतिशीलता और अनुसूचित जाति बैंड के संकल्प में सुधार, और व्यक्तिगत श्वसन परिसरों की तुलना में CN-पृष्ठ (चित्रा 3) । बैंड आसानी से संकर तकनीक या बीएन-पृष्ठ के साथ civ के लिए जेल गतिविधि के बाद अलग हैं, जबकि एक ही नमूने में CN द्वारा हल-पृष्ठ, अनुसूचित जाति और एकलक civ प्रतिक्रियाशील बैंड की पहचान नहीं की जा सकती है ।

चित्र 3 और अंक 4 यह दर्शाते हैं कि ऑक्सीफोस मोनोमर्स और सुप्रामोलेक्यूलर असेंबलियों के विभेदन और बैंडिंग पैटर्न संकर सीएन/बीएन-पृष्ठ और बीएन-पृष्ठ के बीच गुणात्मक रूप से तुलनीय है । हालांकि, उल्लेखनीय मतभेद मौजूद हैं । सबसे पहले, OXPHOS परिसरों की इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता थोड़ा कम है जब प्रोटीन संकर CN/बीएन-पृष्ठ शर्तों बनाम मानक बीएन-पृष्ठ का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, सीबी की कम राशि के कारण. यह गतिशीलता परिवर्तन CIV monomers के लिए अधिक है, सीवी monomers द्वारा पीछा किया, और CI (चित्रा 3 और 4 चित्रा). दूसरा, नीली पृष्ठभूमि संकर में कम है CN/बीएन-पृष्ठ की तुलना में बीएन-पृष्ठ (चित्रा 3, बाईं लेन). एक परिणाम के रूप में, उच्च पृष्ठभूमि के बाद बीएन-पृष्ठ पूरी तरह से मास्क में जेल गतिविधि CII के लिए धुंधला, और CIV dimers की गतिविधि के साथ जुड़े पृष्ठभूमि शोर को बढ़ाता है (चित्रा 3) । तीसरा, CV की गतिविधि अधिक है जब नमूनों संकर CN के तहत चलाए जा रहे है/बीएन पृष्ठ की स्थिति बीएन पृष्ठ की तुलना में (चित्रा 3), सीबी, जो CV उत्प्रेरक गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है की कम मात्रा के कारण । 26 CN/बीएन-पृष्ठ भी सीवी dimers के साथ संबद्ध किया जा रहा कुल सीवी गतिविधि का एक बड़ा अनुपात द्वारा दिखाया गया है के रूप में cv supramolecular विधानसभाओं के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है (चित्रा 3). इसके अलावा, सीवी ओलिमर्स CN/bn-पृष्ठ के तहत दिखाई दे रहे हैं, जबकि वे पूरी तरह से बीएन-पृष्ठ शर्तों के तहत वियोजित रहे हैं । दिलचस्प बात यह है कि सीवी गतिविधि को प्रदर्शित करने वाले विशिष्ट बैंड सीवी मोनोमर्स और डिमर्स के बीच भी देखे जाते हैं, जब नमूने सीएन/बीएन-पेज के तहत चलाए जाते हैं (चित्रा 2) ।

चित्र 5 में अधिआण्विक असेंबलियों में ऑक्फोस संकुल वितरण का प्रतिनिधि विश्लेषण दर्शाया गया है । छवि से पता चलता है 4 अलग स्वस्थ माउस जिगर माइटोकॉन्ड्रिया तैयारी से प्राप्त नमूनों की जेल गतिविधि । Densitometry विश्लेषण के लिए CI-प्रतिक्रियाशील बैंड के वक्र के तहत क्षेत्र को मापने की अनुमति देता है, और एकलक में C1 गतिविधि के सापेक्ष वितरण पेश करने के लिए (मैं1) और supramolecular रूपों (मैं1iii2, मैं1iii2चतुर्थ 1, मैं1III2चतुर्थn) । इसी तरह के विश्लेषण इम्यूनोलॉट के बाद किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: कार्यप्रवाह परख । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Digitonin अनुमापन ताजा माउस जिगर mitochondria से supercomplexes निकालने के लिए । यह उदाहरण माउस लिवर माइटोकॉन्ड्रिया के aliquots को दर्शाता है, एक जानवर से अलग किया गया है जो श्वसन supercomplexes को निकालने के लिए डिजिटोनइन की बढ़ती मात्रा के साथ उपचारित था । नमूनों तो संकर द्वारा हल कर रहे थे CN/बीएन पृष्ठ, और CIV के जेल गतिविधि में निर्धारित किया गया था । CIV1: जटिल चतुर्थ मोनोमर्स; CIV2: परिसर चतुर्थ dimers; अनुसूचित जाति: supercomplexes । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हाइब्रिड cn/बीएन-पृष्ठ, बीएन-पृष्ठ या CN-पृष्ठ निम्नलिखित OXPHOS परिसरों की जेल गतिविधि. एक चूहे से अलग किए गए यकृत माइटोकॉन्ड्रिया ने श्वसन सुपरकॉम्प्लेक्स निकालने के लिए डिजिटोनिइन (4 जी/जी अनुपात डिगोटोनिन/protein) से उपचार किया । इस नमूने के aliquots तो तीन अलग जैल में कई कुओं पर लोड और सीएन/बीएन-पृष्ठ, बीएन-पृष्ठ या CN-पृष्ठ प्रस्तुत किया गया । प्रत्येक जेल के भीतर एक दोहराने लेन तो काट दिया गया था और तुरंत में जेल गतिविधि assays है (CI, सीआईआई, CIV और CV लेबल) के लिए इस्तेमाल किया । एक लेन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था पृष्ठभूमि दिखाने के लिए (बीजी लेबल) Coomassie नीले रंग के साथ धुंधला । ऑक्फोस परिसरों और अधिमोलाकुलर असेंबलियों की पहचान मानक नामकरण का उपयोग करते हुए की जाती है, जिसमें सूचकांकों में संख्याओं के साथ प्रत्येक ऑक्फॉस कॉम्प्लेक्स की आण्विक स्टॉइकोमेट्री का उल्लेख होता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि CIII-युक्त supramolecular विधानसभाओं की स्थिति immunodetection के बाद से में जेल गतिविधि CIII के लिए इस विशेष प्रयोग में नहीं किया गया था पर आधारित है. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: हाइब्रिड CN/bn-पृष्ठ या bn-पृष्ठ के बाद OXPHOS परिसरों का इम्यूनोलॉट विश्लेषण । चित्रा 3 लीजेंड में वर्णित प्रयोगों से replicates विद्युत एक ही झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया. हस्तांतरण के बाद, व्यक्तिगत लेन काट रहे थे और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इंक्यूबेट सीआई, सीआईआई, CIII, CIII, और CV पहचानने । OXPHOS परिसरों और अधिमॉलिक्यूलर विधानसभाओं की पहचान की जाती प्रत्येक ऑक्फोस परिसर की आण्विक रसहिमीमिति इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मोनोमेरिक और supramolecular विधानसभाओं में CI वितरण का परिमाणीकरण. (क) CI इन-जेल गतिविधि के बाद निर्धारित संकर CN/बीएन-पृष्ठ में जिगर माइटोकॉन्ड्रिया अनुसूचित जाति के अर्क से प्राप्त 4 चूहों । (ख) है imagej जेल विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर प्राप्त अलग ci मोनोमर्स (मैं 1) और विभिंन ci-युक्त supramolecular परिसरों (मैं 1 iii2, मैं1iii2चतुर्थ 1 से संबंधित चोटियों दिखा , और मैं1III2चतुर्थn) । (ग) C1 गतिविधि के सापेक्ष वितरण का परिमाणीकरण । डेटा 4 चूहों का मतलब है और SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

डिजिटोनइन/प्रोटीन अनुपात (जी/जी) 2 g/g 4 g/g 6 g/g 8 g/g
निष्कर्षण बफर की मात्रा (μL) ४०० ३०० २०० १००
10% स्टॉक डिजिटोनइन (μL) की मात्रा १०० २०० ३०० ४००
कुल निष्कर्षण बफर मात्रा (μL) ५०० ५०० ५०० ५००

सारणी 1: अनुसूचित जातियों को 5 मिग्रा की माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन से निकालने के लिए विभिन्न डिजिटिन/प्रोटीन अनुपातों का उपयोग करके खंडों की आवश्यकता होती है ।

यौगिक अंतिम सांद्रण
EDTA, पीएच ७.५ 1 मिमी
HEPES 30 एमएम
पोटैशियम ऐसीटेट १५० मिमी
ग्लिसरॉल 12
6-एमिनोएप्रोइक अम्ल 2 मिमी

तालिका 2: SC निष्कर्षण बफ़र (अंतिम सांद्रता) । अधिकतम 3 महीने के लिए 4 ° c पर रखें ।

यौगिक अंतिम सांद्रण
3X जेल बफर: Aliquot और पर रखें-20 ° c, पीएच ७.५
Imidazole/HCl pH-७.० ७५ मिमी
6-एमिनोएप्रोइक अम्ल १.५ मीटर
एक्रिलामाइड बफ़र: Aliquot और पर रखें-20 डिग्री सेल्सियस
एक्रिलामाइड ९९.५%
बिस-एक्रिलामाइड 3

तालिका 3: जेल स्टॉक बफ़र्स ।

2 जैल के लिए: 4% (६० मिलीलीटर) 12% (६० मिलीलीटर) Stacking (4%) (25 मिलीलीटर)
3X जेल बफर १९.८ मिलीलीटर १९.८ मिलीलीटर ८.२५ मिलीलीटर
ऐक्रिलामाइड बफर ४.८ मिलीलीटर १४.४ मिलीलीटर 2 मिलीलीटर
एच2ओ ३५ मिलीलीटर १३.१ मिलीलीटर १४.६ मिलीलीटर
ग्लिसरॉल - 12 मिलीलीटर -
एपीएस 10% ३६० μL ६० μL १५० μL
TEMED 24 μL 12 μL 10 μL

तालिका 4:4% – 12% ग्रैडिएंट जेल.

यौगिक अंतिम सांद्रण
ऐनोड बफर: 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, पीएच ७.५
Imidazole 25 मिमी
कैथोड बफर: 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, पीएच ७.५
ट्राइसीन 50mm
Imidazole ७.५ मिमी
के साथ या बिना Coomassie नीला (G250) ०.०२२%

5 तालिका: Electrophoresis बफ़र्स ।

यौगिक अंतिम सांद्रण
जटिल मैं गतिविधि बफर: 5 मिमी TRIS-HCl पीएच ७.४ में ताजा तैयार
नाइट्राटेट्राज़ोलियम नील 3 मिमी
एनएडीएच 14 एमएम
जटिल द्वितीय गतिविधि बफर: 5 मिमी TRIS-HCl पीएच ७.४ में ताजा तैयार
Succinate 20 एमएम
पीएमएसएफ ०.२ मिमी
नाइट्राटेट्राज़ोलियम नील 3 मिमी
परिसर चतुर्थ गतिविधि बफर: ५० मिमी Na-फॉस्फेट पीएच ७.२ में ताजा तैयार
साइटोक्रोम सी ०.०५ मिमी
डाइनॉमीबेन्जियाडीन २.३ मिमी
ATPsynthase गतिविधि बफर: पानी में ताजा तैयार, KOH के साथ 8 से पीएच समायोजित
Glycine 50mm
एमजीसीएल2 5 मिमी
HEPES 50mm
CaCl2 30 एमएम
एटीपी 5 मिमी

6 तालिका: में जेल गतिविधि परख बफ़र्स ।

यौगिक अंतिम सांद्रण
अंतरण बफर
Tris आधार 25 मिमी
Glycine १९२ मिमी
Sds 4
मेथनॉल 20
TBST
Tris आधार 20 एमएम
Nacl १३७ मिमी
Tween 20 ०.१%

तालिका 7: बफ़र्स इम्यूनोलॉटिंग ।

जटिल सबयूनिट क्लोन
मैं NDUFA9 20C11B11B11
द्वितीय सोढ़ा 2E3GC12FB2AE2
Iii UQCRC2 13G1214BB11
Iv COX4 1D6E1A8
वी ATPB 3D5

तालिका 8: श्वसन श्रृंखला अनुसूचित जाति का पता लगाने के लिए immunoblotting के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी. कंपनियों और बहुत संख्या के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

Discussion

माइटोकॉन्ड्रियल सुपरकॉम्प्लेक्स सक्रिय रूप से उनकी शारीरिक भूमिका को स्पष्ट करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है, और कई मानव रोगों के रोगजनन में उनके महत्व, चाहे वे प्राप्त कर रहे हैं या आनुवंशिक माइटोकॉन्ड्रियल रोगों3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. आदेश में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल माउस जिगर माइटोकॉन्ड्रिया, माउस कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया (नहीं दिखाया परिणाम) के साथ परीक्षण किया गया है, चूहा दिल माइटोकॉन्ड्रिया, और मानव फाइकोब्लास्ट माइटोकॉन्ड्रिया (परिणाम नहीं दिखाया गया है), लेकिन निश्चित रूप से अलग के अंय स्रोतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता Mitochondria. विधि बेहतर BN और CN-पृष्ठ प्रोटोकॉल, जो डिटर्जेंट और ऋणायनी यौगिकों के लिए एक ंयूनतम करने के लिए जोखिम को कम करने की अनुमति के विभिंन पहलुओं को जोड़ती है प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में20,27,28।

नमूना तैयारी

नमूना तैयार करना अनुसूचित जातियों के सफल पृथक्करण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । बफर संघटन ध्यान से प्रोटीन और प्रोटीन विधानसभाओं के उचित विलेयीकरण प्राप्त करने के लिए चयन किया जाना चाहिए, जबकि संरक्षण के रूप में ज्यादा के रूप में संभव उनके कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता । ईओण शक्ति और निष्कर्षण बफर के पीएच दो महत्वपूर्ण कारकों पर विचार कर रहे हैं । नमक की सांद्रता जो बहुत कम (< ५० मिमी-एसीटेट या NaCl) है, में गैर-आयनिक अपमार्जकों की उपस्थिति में प्रोटीन के अल्प विलेनीकरण का परिणाम होगा, जबकि ५०० मिमी से अधिक नमक सांद्रण प्रोटीन stacking/एकत्रीकरण को बढ़ावा देगा, और सीबी और प्रोटीन29। अनुसूचित जातियों इसलिए निकट शारीरिक ईओण ताकत पर बफ़र्स का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए । पीएच के संबंध के साथ, एक निकट शारीरिक पीएच के उपयोग की सिफारिश की है ।

इष्टतम अनुसूचित जाति निष्कर्षण के लिए डिटर्जेंट प्रकार और डिटर्जेंट/प्रोटीन अनुपात भी महत्वपूर्ण है । मूल अनुसूचित जातियों के अधिकतम परिरक्षण के लिए, डिजिटोइन को26वरीयता दी जाती है । के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल और अंय प्रकाशित विधियों23,30,31,३२में दिखाया गया है, इस हल्के डिटर्जेंट एकाधिक अनुसूचित जाति विधानसभाओं के supramolecular संरचना को बरकरार रखता है, और द्विभाजक और एपेसिनथेस की अल्पमारिक संरचना (चित्रा 3 और चित्रा 4). डिजिटोनिन की विभिंन मात्रा के साथ ब्याज के नमूनों की अनुमापन के लिए स्थिति है कि इष्टतम solubilization की अनुमति की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि एंजाइम गतिविधि और शारीरिक प्रोटीन बातचीत के संरक्षण । अनुमापन 2 और 8 जी के बीच लेकर अनुपात के साथ प्रदर्शन किया जानाचाहिए/ जिगर के लिए इष्टतम परिणाम, कंकाल की मांसपेशी और कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया क्रमशः 4, 5, और 6 जी digitonin/जी प्रोटीन के साथ प्राप्त कर रहे हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डिजिटोनिन triton एक्स से प्रतिस्थापित किया जा सकता है-१००, जो इष्टतम शर्तों के तहत इसी तरह के प्रवास में परिणाम और अनुसूचित जाति संरचना के रूप में डिजिटोनिन2के साथ मनाया । हालांकि, इस डिटर्जेंट का इस्तेमाल सावधानी से किया जाना चाहिए, क्योंकि डिटर्जेंट/प्रोटीन अनुपात (जैसे, 1 से १.५ g/g) में अपेक्षाकृत छोटी वृद्धि के परिणामस्वरूप SCs विधानसभाओं2का पूर्ण पृथक्करण हो सकता है, जो प्रयोगात्मक विसंगतियों में परिणाम कर सकता है । निष्कर्षण के बाद, नमूनों परंपरागत रूप से coomassie नीले रंग के साथ पूरक है प्रोटीन एक चार्ज देने के लिए जब जेल के लिए लागू, पारंपरिक CN के अलावा-पृष्ठ20,26। Coomassie नीले और अस्थिर प्रोटीन के संभावित पृथक्करण के लिए प्रोटीन जोखिम को कम करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में Coomassie नीले रंग के साथ नमूनों पूरक नहीं हैं ।

वैद्युतकणसंचलन

दोनों CN-पृष्ठ और बीएन-पृष्ठ माइटोकॉन्ड्रियल oxphos परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनमें से प्रत्येक के विशिष्ट लाभ और सीमाएं हैं । मामूली CN-पृष्ठ के तहत इस्तेमाल किया शर्तों (मुख्य रूप से सीबी, जो एक डिटर्जेंट की तरह प्रभाव है की अनुपस्थिति), एटीपी सिंथेज़ में जेल गतिविधि के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, और उच्च आणविक वजन में अस्थिर प्रोटीन के पृथक्करण को सीमित करता है एससी और एटीपी सिंथेस विधानसभाओं26। हालांकि, प्रोटीन निकालने और वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स में ऋणायनी डाई सीबी के अभाव प्रोटीन उनके आंतरिक चार्ज और समविभव बिंदु है, जो जेल26के भीतर प्रोटीन की इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता को कम कर देता है के आधार पर विस्थापित करने के लिए कारण बनता है । इसके अलावा, सीबी के अभाव में, अपर्याप्त नकारात्मक चार्ज के साथ प्रोटीन समग्र करने के लिए करते हैं, इस प्रकार जेल20,26में प्रोटीन परिसरों के संकल्प को कम करने । इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, तथाकथित उच्च संकल्प CN-पृष्ठ Wittig और Schragger20द्वारा विकसित किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, सोडियम deoxycholate (डॉक्टर) और विभिंन हल्के गैर ईओण डिटर्जेंट (DDM, Triton X100) कैथोड बफर करने के लिए जोड़ रहे है झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन पर एक नकारात्मक प्रभारी परिवर्तन लागू रखने के लिए, जो एक काफी सुधार में परिणाम 20संकल्प की ।

वर्तमान हाइब्रिड सीएन/बीएन प्रोटोकोल की एक विशिष्ट विशेषता यह है कि इन अपमार्जक के बिना तुलनात्मक विभेदन किया जा सकता है । का क्षणिक अतिरिक्त सीबी कैथोड बफर करने के लिए वैद्युतकणसंचलन की शुरुआत में प्रोटीन एकत्रीकरण की सीमा और जेल में गतिशीलता को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 3 और 4 चित्रा) । नतीजतन, इस संकर तकनीक विशिष्ट अनुसूचित जाति विधानसभाओं के उत्कृष्ट संकल्प और बहुत कम या डिटर्जेंट के लिए कोई जोखिम में सक्षम बनाता है । सीबी की कम मात्रा की उपस्थिति भी CV गतिविधि के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, द्विभाजक और ओलिमोएरिक CV विधानसभाओं के सुधार संरक्षण (चित्रा 3 और Wittig और Schägger २००५26), और नीले रंग की पृष्ठभूमि शोर की कमी है कि कर सकते है विशेष रूप से सीआईआई और सीआईवी (चित्रा 2) के लिए जेल गतिविधियों में परिमाणीकरण में बाधा । इसके अलावा, प्रोटीन निकालने में सीबी की अनुपस्थिति अनुसूचित जातियों के भीतर अस्थिर प्रोटीन पारस्परिक क्रिया के विघटन को सीमित कर रही है । उदाहरण के लिए, चींटी के साथ एटीपी सिंथेस के शारीरिक संघ ३३ synthasome बनाने के लिए या Cyclophilin-D ptp उद्घाटन ३४ को विनियमित करने के लिए सीबी के अभाव में बेहतर देखा जाता है । इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान सीबी के लिए क्षणिक जोखिम केवल इसलिए अनुसूचित जातियों के भीतर उपंयास प्रोटीन बातचीत प्रकट करने के लिए उपयोगी हो सकता है । कुल मिलाकर, इस संकर CN/ अनुसूचित जातियों के उन्नत विश्लेषण के लिए 2 डी वैद्युत्-संचलन, इम्यूनो-डिटेक्शन और/अथवा प्रोटोमिक्स सहित तकनीकें । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनुसूचित जातियों के लिए बढ़ती रुचि के साथ, अध्ययन की एक बढ़ती संख्या स्थानीय पृष्ठ के लिए छोटे 10 x 10 सेमी जैल का उपयोग करें । हालांकि इस दृष्टिकोण बहुतायत अनुसूचित जाति विधानसभाओं में सकल परिवर्तन की पहचान करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, छोटे जैल की कम जुदाई क्षमता की संभावना सूक्ष्म पुनर्व्यवस्था का समाधान करने के लिए या proteomic विश्लेषण के लिए अलग बैंड में कटौती करने के लिए सीमित है । इसके अलावा, कई छोटे जैल का उपयोग अध्ययनों से पता चलता है कि respirasome ATPsynthase dimer के रूप में एक ही आकार में माइग्रेट्स, यह मुश्किल22उंहें अलग करना करने के लिए बना । इसलिए, बड़े जैल का उपयोग इष्ट होना चाहिए ।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

लेखकों को तकनीकी सहायता के लिए Jenna Rossi शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और डॉ Mireille Khacho, डॉ डेविड खड़ाऊं और डॉ उज्जवल अनिल कुमार उपयोगी चर्चा के लिए इस पद्धति को विकसित करते हुए । इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों (CIHR) और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग परिषद (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया । एसी डॉक्टरेट पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता-फ्रेडरिक बैंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति (CIHR) है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate Sigma D5637
6-amino caproic acid sigma A2504
Acrylamide Sigma A3553
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate sigma A3377
Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker Abcam ab14730 Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] Abcam ab14715 Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] Abcam ab14745 Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide Biorad 1610201
Brilliant Blue G Sigma 27815
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) Invitrogen 459600 Lot number TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrome c from equine heart sigma C7752
Digitonin Sigma D141
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps Thermo Fisher 13-310-660
Imidazole Sigma I0250
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate Biorad 1651823
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems Biorad 1654120
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) Invitrogen 459100 Lot number TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6639
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate Biorad 1651824
Phenylmethanesulfonyl floride Sigma P7626
Powerpack 1000 Biorad Serial Number 286BR 07171
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right Biorad 1651902
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs Biorad 1651811
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651873
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards Biorad 1652025
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651849
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 VWR 11215-388
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette Biorad 1703956
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper Biorad 1703939

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हाइब्रिड स्पष्ट/माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला Supercomplexes के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए प्राकृतिक इलेक्ट्रोफोरेसिस
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Cuillerier, A., Burelle, Y. Hybrid… More

Cuillerier, A., Burelle, Y. Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes. J. Vis. Exp. (147), e59294, doi:10.3791/59294 (2019).

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