Summary
Her presenterer vi en protokoll for å trekke ut, løse og identifisere mitokondrie supercomplexes som minimerer eksponering for vaskemidler og Coomassie Blue. Denne protokollen gir en optimal balanse mellom oppløsning, og bevaring av enzym aktiviteter, samtidig som risikoen for å miste labilt protein-protein interaksjoner.
Abstract
Komplekser av oksidativt fosforylering maskineri danner supramolekylært protein ordninger kalt supercomplexes (SCs), som antas å tildele strukturelle og funksjonelle fordeler til mitokondrier. SCs har blitt identifisert i mange arter, fra gjær til pattedyr, og et økende antall studier rapporterer forstyrrelse av deres organisasjon i genetisk og ervervet menneskelige sykdommer. Som et resultat, et økende antall laboratorier er interessert i å analysere SCs, som kan være metodologisk utfordrende. Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll som kombinerer fordelene med blå-og Clear-native PAGE metoder for å løse og analysere SCs på en tid effektiv måte. Med denne hybrid CN/BN-PAGE metoden, mitokondrie SCs ekstrahert med optimale mengder av mildt vaskemiddel digitonin utsettes kort til anioniske fargestoff Coomassie Blue (CB) i begynnelsen av elektroforese, uten eksponering for andre vaskemidler. Denne korte eksponering for CB gjør det mulig å skille og løse SCs så effektivt som med tradisjonelle BN-side metoder, og samtidig unngå den negative virkningen av høye CB nivåer på in-gel aktivitet analyser, og labilt protein-protein interaksjoner innen SCs. Med denne protokollen er det mulig å kombinere presis og rask i gel aktivitet målinger med analytiske teknikker som involverer 2D elektroforese, Immuno-deteksjon, og/eller Proteomikk for avansert analyse av SCs.
Introduction
Mitokondrier produserer energi gjennom oksidativt fosforylering, der respiratoriske komplekser I-II-III-IV oksidere underlag og overfører elektroner til oksygen, og genererer en gradering som gjør at fosforylering av ADP av ATP-syntase (CV). I de siste årene har omfattende studier vist at åndedretts kjede komplekser ikke utelukkende er innarbeidet i en lineær måte i den indre mitokondrie membranen, men er også organisert i supercomplexes (SCs) ordninger1,2. I pattedyr mitokondrier, SCs finnes i varierende stoichiometries: CI/CIII2/CIV1-4 (som heter respirasome, og som er i stand til å NADH:O 2 oxidoreduction in vitro)2, CI/CIII2, og CIII2 /CIV1-23,4. Videre fordeles åndedretts komplekser under forskjellige forhold mellom deres fri form og SCs ordninger. Derfor er det anslått at 85% – 100% av CI, 55% – 65% av CIII, og 15% – 25% av CIV finnes i SCs4. Disse supramolekylært strukturer antas å redusere ROS produksjon, stabilisere eller bistå i forsamlingen av individuelle komplekser, regulere åndedretts kjede aktivitet, og forebygge protein aggregering i proteinet rike indre mitokondrie membran5 ,6,7,8. Deres Remodelling evne på variasjon i energietterspørselen og deres betydning i patogenesen av sykdommer blir undersøkt i flere Labs3,7,9,10, 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14. studier har vist at patologiske forandringer i SCs forsamlingen er til stede i en rekke lidelser, inkludert, men ikke begrenset til, genetisk defekt i cardiolipin syntese15, hjertesvikt16, ischemia-reperfusion17, diabetes12, og aldring18.
Native elektroforese og immunodetection er mye brukt i SCs Studies å løse OXPHOS komplekser kvartær ordninger2,19,20,21. Native elektroforese kan videre kombineres med spesifikke i gel aktivitet analyser eller 2D-SDS side for å muliggjøre presis molekylær bestemmelse av de ulike SCs forsamlinger1,19. Evnen til å studere SCs er kritisk avhengig av utvinnings forholdene, inkludert type og konsentrasjon av vaskemiddel brukt, ioniske styrke og pH, samt på Elektroforetiske migrasjon forhold, som omfatter buffer sammensetning, tilstedeværelsen av CB, gel størrelse og akrylamid prosent2.
Protokoller og SCs band oppløsning varierer sterkt blant papirer, noe som gjør sammenligning mellom studier vanskelig og tilpasning av metoder utfordrende22. Derfor foreslår dette papiret en robust og optimal protokoll for å trekke ut SCs fra isolerte mitokondrier av forskjellige kilder med den ikke-ioniske vaskemiddel digitonin, og for å løse høy molekylvekt SCs band. Den optimaliserte konsentrasjonen av vaskemiddel, sammensetningen av utvinnings bufferen og fraværet av Coomassie Blue i prøve forberedelsene minimerer forstyrrelsen av protein komplekser. Denne protokollen (se figur 1 for en oversikt) kombinerer cn-Page og BN-side for optimale SCs forsamlinger oppløsning på store gel, og er kompatibel med in-gel aktivitet analyser som gir bedre visualisering av reaktive bånd, sammen med bruk av immunodetection for en detaljert analyse SCs ordninger og sammensetning.
Protocol
1. SC-ekstraksjon
- Klargjør 100 mL utvinnings buffer (se tabell 2) ved å oppløse EDTA i vann. Øk pH med KOH til helt oppløst, og juster deretter pH til 7,5 med HCl. Legg resterende komponenter til løsningen, komplett til endelig volum med vann, og holde på isen. I et rør, oppløse digitonin i utvinnings buffer for å gjøre en 10% lagerløsning, Vortex grundig til helt oppløst, og holde på isen.
Merk: Avsugs buffer kan tilberedes på forhånd og oppbevares ved 4 ° c i 2 måneder maksimum. Hvis bølgete bånd begynner å vises nederst på gelen, betyr det at avsugs bufferen er for gammel. Når du klargjør 10% digitonin løsning, utarbeide en lager volum telling 500 μL per prøve hvis du bruker musen leveren mitokondrier. Digitonin løselighet varierer etter proveniens og produkt masse (se tabell over materialer). - Mitokondrier isolert fra animalsk vev (mus hjerte, muskel, lever; Rat hjerte) eller celler (humant Fibroblast) ved hjelp av standardprotokoller23,24,25 kan brukes til ekstraksjon av SCs. Når mitokondrier er innhentet, kvantifisere proteininnhold ved hjelp av bicinchoninic acid analysen Kit i henhold til produsentens anbefalinger. Supplere isolerte mitokondrier med proteaser og phosphatases hemmere på dette trinnet etter behov.
Merk: SCs kan trekkes ut på enten fersk eller tint mitokondrier. Det anbefales å trekke SCs fra alle prøver samtidig, for å sikre at de blir behandlet med samme grupper av løsninger og under samme vilkår. - Basert på den mitokondrie protein konsentrasjonen oppnådd, og den endelige digitonin/protein ratio ønsket, beregne volumet av aksjen digitonin løsning og utvinning buffer som kreves som per tabell 1. For SC-ekstraksjon, tilsett 1 μL av utvinnings buffer (tabell 2) som inneholder digitonin for hvert 10 μg mitokondrie protein. Digitonin/protein-forholdet kan variere fra 2 til 8 g/g. En digitonin titrering skal alltid utføres for hver nye type prøve som brukes (se figur 2 for et eksempel).
- Pellet mitokondrier, i en 1,5 mL rør ved sentrifugering ved 16 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Forkast supernatanten og re-suspendere mitokondrie pellet i det beregnede volumet av iskald utvinnings buffer som inneholder digitonin. Plasser rørene på en mini tube Rotator og ruge i 30 min ved 4 ° c ved en middels rotasjonshastighet. Sørg for at prøvene blir riktig blandet.
- Sentrifuge prøver ved 20 400 x g for 45 min ved 4 ° c for å fjerne insolubilized fragmenter.
- Overfør supernatanten i et nytt rør på isen og kvantifisere proteiner. Denne fraksjonen representerer åndedretts supercomplexes ekstrakt. Hvis elektroforese ikke utføres på samme dag, lagre prøver ved-80 ° c.
Merk: 1) unngå å fryse/tine sykluser av ekstraktet, da dette forstyrrer høyere molekylære ordninger av SCs. Alikvot prøve før første fryse/tine syklus hvis nødvendig. 2) for å utføre en standard BN-side eksperiment, bør CB legges til SCs ekstrakt på dette trinnet. CB bør tilsettes i en 1g/8g ratio i forhold til mengden av vaskemiddel som brukes.
2. gradient gel støping og elektroforese
- Klargjør 3x gradient buffer og akrylamid aksjer for å lage gradient gel, alikvot, og lagre ved-20 ° c (se tabell 3).
- Klargjør anode og bilde buffere og hold ved 4 ° c (se tabell 5).
- Åpne støping kammer og plassere en ytre glassplate (20 cm x 22 cm) i kammeret. Plasser ett sett med avstandsstykker (1,5 mm) ved hjelp av justerings kortet for å sikre at de sitter godt mot siden og hjørnene av kammeret. Plasser en indre glassplate (20 cm x 20 cm) på toppen av avstandsstykker (dette danner gel sandwich), og sette en plast separasjon ark på toppen av glassplaten.
- Gjenta trinn 2,3 til du oppnår ønsket antall gels å kaste. For denne protokollen, er 4 gels støpt. Støping kammer systemet vi bruker (se tabell av materialer) tillater støping av maksimalt 10 gels om gangen. Ta opp de resterende plass i kammeret ved først å legge til så mange akryl blokker som nødvendig, og deretter glassplater hvis nødvendig.
Merk: Montage må være tett forseglet; Det bør ikke være noen plass mellom gel smørbrød i kammeret. - Plasser en stripe av parafilm i sporet før du setter pakningen fast i pakningen hakk. Plasser tetnings platen på kammeret og stram til alle de 6 skruene. Stå støping kammeret.
- Plasser gradient tidligere på en rør plate med en magnetisk rører i "lys" blande kammer. Koble slangen av støping kammer til gradient tidligere, sikre slangen i kassetten på peristaltisk pumpen, og sørge for at stopcock av gradient tidligere er lukket.
- Å kaste 4 gels, forberede 60 mL 4% og 60 mL 12% gel løsninger (se Tabell 4) i en Erlenmeyer kolbe og virvel grundig for å blande. Pour 60 mL 4% gel løsning i "Light" blande kammer, og 60 mL 12% i "tunge" reservoar kammer av gradient tidligere. Sett rør hastigheten på rør platen ved 350 RPM. Åpne stopcock og slå på pumpen ved 35 RPM.
- Når lyset Brøkdelen er lavere enn den tunge fraksjonen, pause pumpen og åpne ventilen stammen mellom "lys" og "tunge" reservoarer, la fraksjoner volum likevekt, og start pumpen.
Merk: det er viktig at ingen bobler kommer inn i systemet og blir fanget mellom glassplater. Hvis dette skjer, angrer du Montage, vasker og gjør om. - Når gradient gel er helt helles, stoppe pumpen, og overlay vann (ca 1 mL) på hver gel sandwich for å hindre tørking av gel. La polymeres for 2 t.
- Forbered 25 mL stabling gel i Erlenmeyer og virvel å blande grundig. Fjern vann og sett 15 brønn kammer i hver gel sandwich. Hell stabling gel og la polymeres for 2 t.
Merk: gels kan bli støpt og oppbevares ved 4 ° c i 1 uke. - Sett gel i sandwich klemmer og fjerne kam. Med den korte glassplaten vendt ned, sett gel smørbrødet i kjøle kjernen. Gjenta på den andre siden, og plasser kjernen i elektroforese tanken.
- Hell 300 mL av blå bilde-buffer i Inner kammeret på elektroforese tanken. Hell 2 L av anode buffer i ytre kammer av elektroforese tank.
Merk: elektroden må senkes i bilde buffer, noe som krever ca. 300 mL. - Last mellom 75 μg og 175 μg protein per brønn. Løpe gel for 150 V for 1,5 h (eller til prøvene ha alle inngikk det gradient gel) inne kulden rom (4 ° c).
Merk 1:1) et minimum på 75 μg per brønn er nødvendig for god oppløsning av in-gel aktivitet band. Lasting av over 175 mikrogram protein vil føre til tap av klare bånd på grunn av overdreven enzym aktivitet. 2) replikerer av prøven skal lastes i separate brønner for å muliggjøre parallell bestemmelse av in-gel aktiviteter og immunoblot analyse av OXPHOS komplekser. Parallell bestemmelse av IGA for CI, CII, CIV og CV krever minimum 300 μg. parallell immunoblot analyse av CI, CII, CII, CIV og CV krever minst 375 μg. - Fjern blå bilde-buffer med Pipet eller vakuum, Erstatt med 300 mL Coomassie blå-gratis bilde buffer, og Kjør gel ved 200 V over natten (16 – 20 timer) i kaldt rom (4 ° c). Gå videre til trinn 3 eller 4 for måling av in-gel-aktivitet eller proteinimmunoblotting.
3. in-gel aktivitet for komplekser I, II, IV og CV
- Før slutten av elektroforese, Forbered in-gel aktivitet buffere i henhold til tabell 6, og holde i MØRKET på RT. 20 ml av in-gel aktivitet buffer er tilstrekkelig for 3 sample baner.
Merk: denne CV in-gel aktivitet analysen er basert på den omvendte aktiviteten til ATPsynthase (dvs. ATP hydrolyse), og bruker kalsium som en co-faktor, som precipitates i gel. Kalsium er mindre skadelig enn kundeemnet som brukes i andre protokoller. Videre er bruken av denne protokollen ikke krever en pre-aktivering/condition av gel23. - Stopp elektroforese og hente gel. Cut baner, om nødvendig, og overføre gel Lanes i plastposer (3 sider kuttet, og plastpose åpnet som en bok). Seal 2 av de 3 sidene med en varme sealer.
Merk: for å sammenligne sammensetningen av SC bånd mellom eksperimentelle grupper, anbefales det å kjøre de samme prøvene i replikerer på samme gel. Cut kjørefelt for å ruge hver replikere i ulike in-gel aktivitet buffere (CI, II, IV, V). For å bekrefte spesifisitet av analysene, kan ytterligere replikerer være forberedt på å kjøre i gel aktiviteter i nærvær av spesifikke åndedretts kjede hemmere. - For 3 eksperimentelle prøver (dvs. 3 brønner), tilsett 20 mL av in-gel aktivitet buffer, fjerne bobler, og forsegle 4th side av plastpose.
Merk: Legg til hemmere i negativ kontroll eksperimenter hvis det utføres: CI: rotenon 1 μM; CII: natrium Malonat 10 mM; CIII: Antimycin-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycin 0,5 μM. - Ruge gel Lanes for 37 ° c i mørket og sjekk hver 15 min. inkubasjonstid varierer avhengig av mengden protein og komplekser. CI vil reagere raskere enn CIV eller CV. optimale flekker oppstår vanligvis etter 2 timer for CI, 4 h for CIV og 6 h for CII og CV.
- Skyll gel-baner i vann for å stoppe reaksjonen, og bildet på en hvit bakgrunn for CI, CII, CIV eller svart bakgrunn for CV.
Merk: gels kan oppbevares i plastposer ved RT eller 4 ° c i flere måneder.
4. proteinimmunoblotting
- Klargjør overføringsbuffer i henhold til Tabell 7, og hold på RT. Forbered TBST og hold på RT.
- Plasser hele gelen, eller utvalgte baner, i en beholder og Legg til overføringsbuffer supplert med SDS (0,25% endelig i overføringsbuffer). Plasser beholderen på rocker og ruge i 1 time.
- Skjær PVDF membran (størrelse som tilsvarer størrelsen på gelen) og aktivere i 20 mL av metanol under omrøring i 2 min. Skift ut med 20 mL overføringsbuffer og plasser under omrøring i 2 minutter.
- Forbered overføring sandwich, fra bunn til topp, noe som gjør at det ikke er boble mellom gel og aktivert PVDF membran: klar side av kassett/svart svamp/blotting papir/membran/gel/blotting papir/svart svamp/svart side av kassetten. Lukk og lås kassetten.
- Plasser overføre sandwich i overførings tanken, med den gjennomsiktige siden av smørbrødet vendt mot den røde siden av elektroden, og hell overføringsbufferen for å immerge gelen. Koble kjølesystemet til overførings tanken og Still inn ved 4 ° c. Koble til strømforsyningen, satt til 40 mA, og kjøre i 24 timer.
- Hent membraner, blokker for 1 time i 5% BSA i TBST, og ruge i primær antistoff løsning fremstilt i 5% BSA i TBST over natten ved 4 ° c.
Merk: se tabell 8 for antistoffer som brukes. - Skyll membraner i TBST 3x i 10 minutter hver.
- Ruge membraner i sekundære antistoff løsninger fremstilt i 5% BSA i TBST for 2 timer ved romtemperatur.
- Skyll membraner i TBST 3x i 10 minutter hver.
- Legg chemiluminiscerende løsning på membraner og bilde.
5. analyse
- In-gel aktivitet analysen bilder eller immunoblots kan brukes til å analysere SCs. For å analysere sammensetningen av bånd, justere replikerer og validere hvilke komplekse reagerte positivt for hvert gitt band.
- For å analysere fordelingen av komplekser, i ulike supramolekylært forsamlinger, åpne bilder i ImageJ og bruke gel analyseverktøyet (se figur 5 for et eksempel).
- Velg baner med rektangel verktøyet, og plot baner.
- Tegn linjer for å lukke området under kurven av hvert bånd av interesse og klikk på hvert område med tryllestaven verktøy for å generere en tabell som inneholder området under kurven verdier.
- Hvis du vil beregne fordelingen av komplekset, rapporterer du verdiene for hvert felt i forhold til monomer.
Representative Results
Figur 2 viser resultater fra et digitonin titrering eksperiment med sikte på å identifisere den riktige mengden av digitonin som kreves for ekstraksjon av SCs. Dette beløpet vil variere avhengig av vev/celle type og om prøven var frosset eller ikke. For dette eksperimentet ble en CIV in-gel-aktivitet utført for å visualisere SCs isolert fra ferske mus lever mitokondrier. Forhold fra 2/1 til 10/1 g digitonin/g protein ble testet. Den optimale mengden av digitonin for denne prøven er 4 g/g, da det gir en god oppløsning på monomere CIV, og høy molekylvekt SCs. Ved et lavere forhold, er band ikke klart og løse i en smøre under elektroforese, mens bruk av høyere ratio av digitonin fører til avbrudd av høy molekylvekt SC.
Figur 3 og Figur 4 viser resultatene av et komplett eksperiment utført på en fremstilling av mus leveren mitokondrier ekstrahert med 4 g digitonin/g protein. Proteiner ble separert ved hjelp av hybrid BN/CN-PAGE, standard BN-side, eller CN-PAGE. Alle tre gels ble støpt på samme tid og baner ble lastet med replikerer av samme prøve. Etter elektroforese ble individuelle baner kuttet og behandlet for i måling av gel aktivitet (CI, CII, CIV og CV på Figur 3) og PROTEINIMMUNOBLOTTING (CI, CII, CIII, CIV, CV på Figur 4).
Tilsetting av CB enten øyeblikk i bilderør buffer (dvs. hybrid CN/BN-side) eller i utvalg og bilderør buffer gjennom elektroforese (dvs. BN-side), forbedrer mobilitet og oppløsning av SC band, og individuelle åndedretts komplekser sammenlignet med CN-side (Figur 3). Band er lett gjenkjennelig med hybrid teknikk eller BN-side etter in-gel aktivitet for CIV, mens i samme prøve løst av CN-side, SCs og monomere CIV reaktive bånd ikke kan identifiseres.
Figur 3 og Figur 4 viser at oppløsningen og striper mønster av OXPHOS monomerer og supramolekylært forsamlinger er KVALITATIVT sammenlignbare mellom hybrid cn/BN-side og BN-side. Det finnes imidlertid bemerkelsesverdige forskjeller. For det første er Elektroforetiske mobilitet av OXPHOS komplekser noe redusert når proteiner skilles med hybrid CN/BN-PAGE forhold kontra standard BN-side, på grunn av redusert mengde CB. Dette mobilitets skiftet er større for CIV-monomerer, etterfulgt av CV-monomerer og CI (Figur 3 og Figur 4). For det andre er den blå bakgrunnen lavere i hybrid CN/BN-side i forhold til BN-side (Figur 3, venstre felt). Som et resultat, høy bakgrunn nivåer etter BN-side helt masker i-gel aktivitet farging for CII, og forsterker bakgrunnsstøyen forbundet med aktiviteten til CIV dimers (Figur 3). For det tredje er aktiviteten til CV høyere når prøvene kjøres under hybrid CN/BN-sideforhold i forhold til BN-side (Figur 3), på grunn av den reduserte MENGDEN av CB, som er kjent for å forstyrre CV katalysator aktivitet. 26 cn/BN-Page gir også bedre bevaring av CV supramolekylært forsamlinger, som vist ved en større andel av total CV aktivitet blir ASSOSIERT med CV dimers (Figur 3). Videre er CV oligomers synlige under CN/BN-PAGE, mens de er helt dissosiert under BN-sideforhold. Interessant, distinkte band viser CV aktivitet er også observert mellom CV monomerer og dimers, når prøvene er kjørt under CN/BN-side (figur 2).
Figur 5 viser en representativ analyse av OXPHOS kompleks distribusjon i supramolekylært forsamlinger. Bildet viser CI i gel aktivitet av prøvene innhentet fra 4 distinkte sunne mus leveren mitokondrier forberedelser. Densitometri analyse gjør det mulig å måleområdet under kurven av CI-reaktive band, og å presentere den relative fordelingen av C1 aktivitet i monomere (I1) og supramolekylært former (i1III2, I1III2IV 1, i1III2IVn). Lignende analyser kan utføres etter immunoblot.
Figur 1: arbeidsflyt for analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Digitonin titrering for å trekke ut supercomplexes fra friske mus lever mitokondrier. Dette eksempelet viser alikvoter av mus leveren mitokondrier, isolert fra ett dyr som ble behandlet med økende mengder digitonin å utvinne respiratoriske supercomplexes. Prøvene ble deretter løst av hybrid CN/BN PAGE, og in-gel aktivitet av CIV ble bestemt. CIV1: kompleks IV-monomerer; CIV2: kompleks IV dimers; SC: supercomplexes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: in-gel aktivitet av OXPHOS komplekser etter hybrid cn/BN-Page, BN-side eller cn-Page. Leveren mitokondrier isolert fra en mus ble behandlet med digitonin (4 g/g ratio digotonin/protein) for å trekke ut åndedretts supercomplexes. Alikvoter av denne prøven ble deretter lastet på flere brønner i tre forskjellige gels og sendt til CN/BN-PAGE, BN-side eller CN-side. Hvert replikere kjørefelt innenfor hver gel ble deretter kuttet og umiddelbart brukt til in-gel aktivitet analyser (merket CI, CII, CIV og CV). Ett kjørefelt ble brukt som kontroll for å vise bakgrunnen (merket BG) farging med Coomassie Blue. OXPHOS komplekser og supramolekylært forsamlinger identifiseres ved hjelp av standard nomenklatur, med tall i indekser som indikerer molekyl støkiometri for hvert OXPHOS-kompleks. Det bør bemerkes at plasseringen av CIII-inneholdende supramolekylært forsamlinger er basert på immunodetection siden in-gel aktivitet for CIII ble ikke utført i dette eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunoblot analyse av OXPHOS komplekser etter hybrid cn/BN-Page eller BN-side. Replikerer fra eksperimentene beskrevet i Figur 3 legenden ble elektro-overført på en enkelt membran. Etter overføring ble individuelle kjørefelt kuttet og inkubert med spesifikke antistoffer som gjenkjenner CI, CII, CIII, CIV og CV. OXPHOS komplekser og supramolekylært forsamlinger identifiseres ved hjelp av standardterminologien, med tall i indekser som indikerer molekylær støkiometri av hvert OXPHOS-kompleks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kvantifisering av CI-distribusjon i monomere og supramolekylært forsamlinger. (A) CI in-gel aktivitet bestemmes etter hybrid cn/BN-side av i LEVEREN mitokondrier SC ekstrakter Hentet fra 4 mus. (B) Densitograms innhentet ved hjelp ImageJ ' s gel analyseverktøyet viser distinkte TOPPER tilsvarende CI monomerer (i1) og ulike CI-inneholdende supramolekylært komplekser (i 1III2, I1III2IV1 , og jeg1III2IVn). (C) kvantifisering av den relative fordelingen av C1-aktivitet. Dataene representerer gjennomsnittet og SEM av de 4 musene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Digitonin/protein-forhold (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| Volum av utvinnings buffer (μL) | 400 for alle | 300 for alle | 200 for alle | 100 for alle |
| Volum på 10% lager digitonin (μL) | 100 for alle | 200 for alle | 300 for alle | 400 for alle |
| Totalt volum for utvinnings buffer (μL) | 500 for alle | 500 for alle | 500 for alle | 500 for alle |
Tabell 1: volumer som kreves for å trekke ut SCs fra 5 mg mitokondrie proteiner ved hjelp av ulike digitonin/protein forhold.
| Sammensatte | Endelig konsentrasjon |
| EDTA, pH 7,5 | 1 mM med |
| HEPES | 30 mM |
| Kalium acetate | 150 mM |
| Glyserol | 12 |
| 6-aminokapronsyre acid | 2 mM med |
Tabell 2: SC utvinnings buffer (endelige konsentrasjoner). Oppbevares ved 4 ° c i maksimalt 3 måneder.
| Sammensatte | Endelig konsentrasjon |
| 3X gel buffer: Alikvot og oppbevares ved-20 ° c, pH 7,5 | |
| Imidazole/HCl pH-7,0 | 75 mM |
| 6-aminokapronsyre acid | 1,5 til 5m |
| Akrylamid buffer: Alikvot og oppbevares ved-20 ° c | |
| Akrylamid | 99,5 prosent |
| BIS-akrylamid | 3 |
Tabell 3: lager buffere for gel.
| For 2 gels: | 4% (60 mL) | 12% (60 mL) | Stabling (4%) (25 mL) |
| 3X gel buffer | 19,8 mL | 19,8 mL | 8,25 mL |
| Akrylamid buffer | 4,8 mL | 14,4 mL | 2 mL med |
| H2O | 35 mL | 13,1 mL | 14,6 mL |
| Glyserol | - | 12 mL | - |
| APS 10% | 360 μL | 60 μL | 150 μL |
| TEMED | 24 μL | 12 μL | 10 μL |
Tabell 4:4% – 12% gradert gel.
| Sammensatte | Endelig konsentrasjon |
| Anode buffer: oppbevares ved 4 ° c, pH 7,5 | |
| Imidazole | 25 mM |
| Bilderør buffer: oppbevares ved 4 ° c, pH 7,5 | |
| Tricine | 50 mM |
| Imidazole | 7,5 mM |
| Med eller uten Coomassie Blue (G250) | 0,022 prosent |
Tabell 5: elektroforese buffere.
| Sammensatte | Endelig konsentrasjon |
| Kompleks jeg aktivitet buffer: forberede friskt i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Nitrotetrazolium blå | 3 mM av |
| NADH | 14 mM |
| Kompleks II aktivitet buffer: forberede friskt i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Succinate | 20 mM |
| PMSF | 0,2 mM |
| Nitrotetrazolium blå | 3 mM av |
| Kompleks IV aktivitet buffer: forberede friskt i 50 mM na-fosfat pH 7,2 | |
| Cytokrom C | 0,05 mM |
| Diaminobenzidine | 2,3 mM |
| ATPsynthase aktivitet buffer: forberede friskt i vann, justere pH til 8 med KOH | |
| Glysin | 50 mM |
| MgCl2 | 5 mM av |
| HEPES | 50 mM |
| CaCl2 | 30 mM |
| Atp | 5 mM av |
Tabell 6: in-gel aktivitet analysen buffere.
| Sammensatte | Endelig konsentrasjon |
| Overførings buffer | |
| Tris base | 25 mM |
| Glysin | 192 mM |
| Sds | 4 |
| Metanol | 20 |
| TBST | |
| Tris base | 20 mM |
| Nacl | 137 mM |
| Mellom 20 | 0,1 prosent |
Tabell 7: Proteinimmunoblotting buffere.
| Komplekse | Delenhet | Klone |
| I | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| Ii | SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| Iii | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| Iv | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | ATPB | 3D5 |
Tabell 8: antistoffer som brukes til proteinimmunoblotting for å detektere åndedretts KJEDEN SC. Se tabell over materialer for firmaer og partinumre.
Discussion
Mitokondrie supercomplexes blir aktivt studert for å belyse sin fysiologiske rolle, og deres betydning i patogenesen av mange menneskelige sykdommer, enten de er ervervet eller genetisk mitokondrie sykdommer3,7 , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14. for å oppnå pålitelige resultater, flere aspekter må vurderes. Denne protokollen har blitt testet med mus leveren mitokondrier, mus skjelettlidelser muskel mitokondrier (resultater ikke vist), rotte hjerte mitokondrier, og menneskelig Fibroblast mitokondrier (resultater ikke vist), men kan sikkert være tilpasset andre kilder av isolerte Mitokondrier. Metoden kombinerer optimalt ulike aspekter av BN og cn-side protokoller, som tillater å redusere eksponering for vaskemidler og anioniske forbindelser til et minimum i forhold til publiserte protokoller20,27,28.
Eksempel på tilberedning
Prøveklargjøring representerer et avgjørende skritt for en vellykket separasjon av SCs. buffer sammensetning bør nøye velges for å oppnå riktig oppløseliggjøringen av proteiner og proteiner forsamlinger, og samtidig bevare så mye som mulig deres funksjonelle og strukturell integritet. Ioniske styrke og pH i utvinnings bufferen er to viktige faktorer å vurdere. Salt konsentrasjoner som er for lav (< 50 mM K-acetate eller NaCl) vil resultere i dårlig oppløseliggjøringen av proteiner i nærvær av ikke-ioniske vaskemidler, mens salt konsentrasjoner over 500 mM vil fremme protein stabling/aggregering, og utfelling av CB og proteiner29. SCs bør derfor trekkes ut ved hjelp av buffere på nær fysiologisk ioniske styrke. Når det gjelder pH, anbefales bruk av en nær fysiologisk pH.
Vaskemiddel type og vaskemiddel/protein ratio er også avgjørende for optimal SC utvinning. For maksimal bevaring av innfødte SCs er digitonin foretrukket26. Som vist i den nåværende protokollen og andre publiserte metoder23,30,31,32, bevarer dette milde vaskemiddel den supramolekylært sammensetningen av flere SC-sammenstillinger, og dimeric og oligomer strukturen til ATPsynthase (Figur 3 og Figur 4). Titrering av prøver av interesse med ulike mengder digitonin er avgjørende for å identifisere de forhold som tillater optimal oppløseliggjøringen, samtidig som enzym aktivitet og fysiologiske protein interaksjoner. Titrering bør utføres med forholdstall mellom 2 og 8 g/g26. Optimale resultater for lever-, Skjelettmuskel-og CARDIAC mitokondrier er henholdsvis oppnådd med 4, 5 og 6 g digitonin/g protein. Det bør bemerkes at digitonin kan erstattes av Triton X-100, som under optimale forhold resulterer i lignende migrasjon og SC komposisjon som de som er observert med digitonin2. Imidlertid bør dette vaskemiddel brukes med forsiktighet, siden relativt liten økning i vaskemiddel/protein ratio (f. eks, fra 1 til 1,5 g/g) kan resultere i en fullstendig dissosiasjon av SCs forsamlinger2, som kan resultere i eksperimentelle inkonsekvenser. Etter ekstraksjon er prøvene tradisjonelt supplert med Coomassie blå for å gi proteiner en kostnad når den påføres gel, med unntak av tradisjonelle cn-side20,26. For å minimere protein eksponering for Coomassie blå og potensielle dissosiasjon av labilt proteiner, er prøvene ikke supplert med Coomassie blå i denne protokollen.
Elektroforese
Både CN-PAGE og BN-siden har blitt brukt til å studere mitokondrie OXPHOS komplekser, hver av dem har distinkte fordeler og begrensninger. De mildere forholdene som brukes under CN-PAGE (hovedsakelig fraværet av CB, som har en vaskemiddel-lignende effekt), gir bedre bevaring av ATP syntase in-gel aktivitet, og begrenser dissosiasjon av labilt proteiner i høy molekylvekt SCs og ATP syntase sammenstillinger26. Men fraværet av anioniske fargestoff CB i protein ekstrakt og elektroforese buffere forårsaker proteiner til å migrere basert på deres indre kostnad og isoelectric punkt, noe som reduserer Elektroforetiske mobilitet av proteiner i gel26. Videre, i fravær av CB, proteiner med utilstrekkelig negativ ladning tendens til å samle, og dermed redusere oppløsningen av protein komplekser i gel20,26. For å omgå disse begrensningene, har den såkalte høyoppløselig CN-siden blitt utviklet av Wittig og Schragger20. I denne protokollen, natrium natriumdeoksykolat (DOC) og ulike milde ikke-ioniske vaskemidler (DDM, Triton X100) er lagt til bilderør for å holde membran proteiner solubilized og pålegge en negativ ladning Skift på proteiner, noe som resulterer i en betydelig forbedring oppløsning20.
Et karakteristisk trekk ved den nåværende hybrid CN/BN-protokollen er at en sammenlignbar oppløsning kan nås uten disse vaskemidler. Kortvarig tillegg av CB til bilderør buffer i begynnelsen av elektroforese er tilstrekkelig til å begrense protein aggregering og forbedre mobilitet i gel (Figur 3 og Figur 4). Som et resultat, denne hybrid teknikken muliggjør utmerket oppløsning av distinkte SC forsamlinger og svært lav eller ingen eksponering for vaskemidler. Tilstedeværelsen av lave mengder CB gir også bedre bevaring av CV aktivitet, bedre bevaring av dimeric og oligomer CV forsamlinger (Figur 3 og Wittig og Schägger 200526), og en reduksjon av den blå bakgrunnsstøyen som kan hindre kvantifisering av i gel aktiviteter, spesielt for CII og CIV (figur 2). Videre begrenser fraværet av CB i protein ekstrakt forstyrrelsen av labilt protein interaksjoner innen SCs. For eksempel fysisk forening av ATP syntase med ANT å danne synthasome 33 eller med cyclophilin-D å regulere PTP åpning 34 er bedre sett i fravær av CB. Kortvarig eksponering for CB under elektroforese bare kan derfor være nyttig å avdekke romanen protein interaksjoner innen SCs. Overall, dette hybrid CN/BN-side-protokollen dermed gjør det mulig å kombinere presise og raske i gel aktivitet målinger med analytiske teknikker som involverer 2D-elektroforese, Immuno-deteksjon og/eller Proteomikk for avansert analyse av SCs. Det bør bemerkes at med den økende interessen for SCs, et økende antall studier bruker små 10 x 10 cm gels for native PAGE. Selv om denne tilnærmingen kan være tilstrekkelig til å identifisere brutto endringer i overflod SC forsamlinger, lavere separasjon kapasitet på små gels er trolig begrenset til å løse subtile rearrangements eller å kutte distinkte band for Proteomikk analyse. Videre har flere studier med mindre gels rapportert at respirasome migrerer i samme størrelse som ATPsynthase-dimer, noe som gjør det vanskelig å distansere dem22. Derfor bør bruk av store gels foretrekkes.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Jenna Rossi for teknisk assistanse, og Dr. Mireille Khacho, Dr. David Patten og Dr. Ujval Anil Kumar for nyttig diskusjon mens utvikle denne metoden. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes of Health Research (CIHR) og National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC). AC er en mottaker av doktorgrads Award-Frederick Banting og Charles best Canada Graduate stipender (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
References
- Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
- Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
- Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
- Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
- Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
- Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
- Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Methods in Cell Biology. 80, Academic Press. 3-44 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582 (2009).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Beutner, G., Porter, G. A. Jr Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).
- Von Hagen, J. Proteomics Sample Preperation. , Wiley InterScience. 485 (2008).
- Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).
