Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udtrække, løse og identificere mitokondrie-super komplekser, som minimerer eksponeringen for rengøringsmidler og Coomassiel Blue. Denne protokol giver en optimal balance mellem opløsning og bevaring af enzym aktiviteter, samtidig med at risikoen for at miste labile protein-protein interaktioner minimeres.
Abstract
Komplekser af den oxidativ fosforyleringemaskiner danner supramokylære protein arrangementer ved navn super komplekser (SCS), som menes at give strukturelle og funktionelle fordele til mitokondrier. SCs er blevet identificeret i mange arter, fra gær til pattedyr, og et stigende antal undersøgelser rapporterer afbrydelse af deres organisation i genetiske og erhvervede sygdomme hos mennesker. Som følge heraf er et stigende antal laboratorier interesseret i at analysere SCs, hvilket kan være metodisk udfordrende. Denne artikel præsenterer en optimeret protokol, der kombinerer fordelene ved Blue-og Clear-Native PAGE-metoder til at løse og analysere SCs på en tidseffektiv måde. Med denne hybride KN/BN-PAGE-metode eksponeres mitokondrie SCs med optimale mængder af det milde rengøringsmiddel digitonin kort for det anioniske farvestof Coomassies Blue (CB) i begyndelsen af elektroforese, uden udsættelse for andre rengøringsmidler. Denne korte udsættelse for CB gør det muligt at adskille og løse SCs så effektivt som med traditionelle BN-PAGE metoder, og samtidig undgå den negative virkning af høje CB niveauer på in-gel aktivitet assays, og labile protein-protein interaktioner inden for SCs. Med denne protokol er det således muligt at kombinere præcise og hurtige målinger af gel-aktivitet med analytiske teknikker, der involverer 2D elektroforese, immuno-detektion og/eller proteomics til avanceret analyse af SCs.
Introduction
Mitochondrier producerer energi gennem oxidativ fosforylering, hvor respiratoriske komplekser I-II-III-IV oxideres substrater og overfører elektroner til ilt, hvilket genererer en gradient, der tillader fosforylering af ADP ved ATP-syntase (CV). I de seneste år har omfattende undersøgelser vist, at respiratoriske kæde komplekser ikke udelukkende er indarbejdet lineært i den indre mitokondriel membran, men også er organiseret i superkomplekser (SCS) arrangement1,2. I pattedyrs mitokondrier findes SCs i varierende stokiometri: CI/CIII2/CIV1-4 (som kaldes respirasome, og som er i stand til at NADH: O2 oxidoreduction in vitro)2, CI/CIII2og CIII2 /CIV1-23,4. Desuden fordeles respiratoriske komplekser under forskellige forhold mellem deres frie form og SCs-arrangementer. Det anslås derfor, at 85% – 100% af CI, 55% – 65% af CIII og 15% – 25% af CIV findes i SCs4. Disse supramoolekylære strukturer menes at mindske ROS produktion, stabilisere eller hjælpe i samlingen af individuelle komplekser, regulere respiratoriske kæde aktivitet, og forhindre protein aggregering i proteinrige indre mitokondriel membran5 ,6,7,8. Deres remodellerings evne efter variation i energiefterspørgslen og deres betydning i patogenesen af sygdomme er ved at blive undersøgt i flere laboratorier3,7,9,10, 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14. undersøgelser har vist, at patologiske ændringer i SCS-samlingen er til stede i en række forskellige lidelser, herunder, men ikke begrænset til, genetiske defekter i kardiolipin-syntese15, hjerteinsufficiens16, iskæmi-reperfusion17, diabetes12, og aldring18.
Native elektroforese og immunodetektion er almindeligt anvendt i SCS undersøgelser til at løse oxphos komplekser kvaternære arrangementer2,19,20,21. Native elektroforese kan yderligere kombineres med specifikke i gel aktivitet analyser eller 2D-SDS side for at muliggøre præcis Molekylær bestemmelse af de forskellige SCS samlinger1,19. Evnen til at studere SCs afhænger i afgørende grad af udvindings forholdene, herunder type og koncentration af anvendt vaskemiddel, ionisk styrke og pH, samt på elektroforetiske migrations forhold, som omfatter buffer sammensætning, tilstedeværelse af CB, gel størrelse og acrylamid procent2.
Protokoller og SCs band opløsning varierer meget mellem papirer, hvilket gør sammenligning mellem undersøgelser vanskelig og tilpasning af metoder udfordrende22. Derfor foreslås der i dette dokument en robust og optimal protokol til at udtrække SCs fra isolerede mitokondrier af forskellige kilder med det ikke-ioniske rengøringsmiddel digitonin og til at løse højmolekylære SCs-bånd. Den optimerede vaskemiddel koncentration, sammensætning af ekstraktions bufferen og fraværet af Coomassie Blue i prøveforberedelsen minimerer afbrydelse af protein komplekser. Denne protokol (Se figur 1 for en oversigt) kombinerer cn-Page og bn-Page for optimale SCS-samlinger opløsning på stor gel, og er kompatibel med in-gel aktivitet analyser giver bedre visualisering af reaktive bands, sammen med brugen af immun detektering for en detaljeret analyse SCs arrangementer og sammensætning.
Protocol
1. SC udvinding
- Forbered 100 mL ekstraktions buffer (Se tabel 2) ved at OPLØSE EDTA i vand. Øg pH-værdien med KOH, indtil den er helt opløst, og juster derefter pH til 7,5 med HCl. Tilsæt de resterende komponenter til opløsningen, Gennemfør den endelige volumen med vand, og hold på is. I et rør opløses digitonin i ekstraktions bufferen for at lave en 10% stamopløsning, vortex grundigt, indtil den er helt opløst, og holder på is.
Bemærk: ekstraktions bufferen kan tilberedes på forhånd og opbevares ved 4 °C i højst 2 måneder. Hvis bølgede bånd begynder at dukke op i bunden af gelen, betyder det, at ekstraktions bufferen er for gammel. Når du forbereder 10% digitonin-opløsningen, skal du forberede en lagerbeholdning, der tæller 500 μL pr. prøve ved brug af muse levermitokondrier. Digitonin opløselighed varierer afhængigt af herkomst og produktparti (Se tabel over materialer). - Mitokondrier isoleret fra animalsk væv (muse hjerte, muskel, lever; rotte hjerte) eller celler (Human fibroblast) ved hjælp af standardprotokoller23,24,25 kan anvendes til udvinding af SCS. Når mitokondrier er opnået, kvantificere proteinindhold ved hjælp af bicinchoninsyre Acid assay kit i henhold til producentens anbefalinger. Supplere isolerede mitokondrier med proteaser og fosfataser hæmmere på dette trin efter behov.
Bemærk: SCs kan ekstraheres på enten friske eller optøede mitokondrier. Det anbefales at udtrække SCs fra alle prøver på samme tid, for at forsikre de behandles med de samme partier af opløsninger og under de samme betingelser. - Baseret på den opnåede mitokondriel proteinkoncentration og det endelige digitonin/protein-forhold, der ønskes, beregnes volumenet af digitonin-opløsning og ekstraktions buffer i henhold til tabel 1. Til SC-ekstraktion tilsættes 1 μL ekstraktions buffer (tabel 2) indeholdende digitonin for hver 10 μg mitokondriel protein. Forholdet mellem digitonin og protein kan variere fra 2 til 8 g/g. Der skal altid udføres en digitonin titrering for hver ny type prøve (Se figur 2 for et eksempel).
- Pellet mitokondrier, i et 1,5 mL rør ved centrifugering ved 16.000 x g i 10 min ved 4 °c.
- Supernatanten kasseres og gensuspenderes mitokondriel pellet i den beregnede mængde iskold ekstraktions buffer, der indeholder digitonin. Anbring rørene på en mini rørs rotator og inkuberer i 30 min ved 4 °C ved en medium rotationshastighed. Sørg for, at prøverne bliver ordentligt blandet.
- Centrifuge prøverne ved 20.400 x g i 45 min ved 4 °c for at fjerne insolubiliserede fragmenter.
- Overfør supernatanten i et nyt rør på is og Kvantificer proteiner. Denne fraktion repræsenterer den respiratoriske superkomplekser ekstrakt. Hvis elektroforese ikke udføres samme dag, skal prøverne opbevares ved-80 °C.
Bemærk: 1) undgå at fryse/optø cyklusser af ekstrakten, da dette forstyrrer højere molekylære arrangementer af SCs. aliquot prøve før den første fryse/optønings cyklus, hvis det er nødvendigt. 2) for at udføre et standard BN-PAGE-eksperiment skal CB føjes til SCs-ekstrakten på dette trin. CB skal tilsættes i et forhold på 1 g/8G i forhold til den anvendte mængde vaskemiddel.
2. gradient gel støbning og Electrophoresis
- Forbered 3x gradient buffer og acrylamid bestande til fremstilling af gradient gel, aliquot, og opbevares ved-20 °C (Se tabel 3).
- Tilbered anode-og katopbuffere, og opbevar den ved 4 °C (Se tabel 5).
- Åbn støbe kammeret, og Anbring en udvendig glasplade (20 cm x 22 cm) i kammeret. Anbring et sæt afstandsstykker (1,5 mm) ved hjælp af justerings kortet for at sikre, at de sidder fast på kammerets side og hjørner. Anbring en indvendig glasplade (20 cm x 20 cm) oven på spacerne (dette danner gel-sandwich), og sæt en plastik separations plade oven på glaspladen.
- Gentag trin 2,3, indtil det ønskede antal geléer er nået. For denne protokol, er 4 geler støbt. Det Casting kammer system, vi bruger (Se tabel over materialer) tillader støbning af et maksimum på 10 geler ad gangen. Take-up den resterende plads i kammeret ved først at tilføje så mange akryl blokke efter behov, og derefter glasplader hvis det er nødvendigt.
Bemærk: montage skal være tæt forseglet; der bør ikke være mellemrum mellem gel sandwicher i kammeret. - Anbring en stribe parafilm i rillen, inden pakningen sidder fast i pakningen. Anbring tætningspladen på kammeret, og spænd alle 6 skruer. Stå støbe kammeret.
- Anbring gradient tidligere på en røre plade med en magnetisk omrører i "Light" blande kammer. Tilslut slangen af støbning kammer til gradient tidligere, fastgør slangen i kassetten af den peristaltiske pumpe, og sørg for stophanen af gradient tidligere er lukket.
- For at caste 4 geler skal der tilberedes 60 mL 4% og 60 mL 12% gel-opløsninger (Se tabel 4) i en Erlenmeyer-kolbe, og den hvirvles grundigt for at blande. Hæld 60 mL 4% gel opløsning i "Light" blandekammeret, og 60 mL af 12% i det "tunge" reservoir kammer af gradient tidligere. Indstil omrøre hastigheden på omrører pladen ved 350 rpm. Åbn stophanen, og tænd for pumpen ved 35 omdrejninger pr. minut.
- Når den lette fraktion er lavere end den tunge fraktion, pause pumpen og åbne ventil stilken mellem "lys" og "tunge" reservoirer, lad fraktioner volumen ligevægt, og genstart pumpen.
Bemærk: det er vigtigt, at der ikke kommer bobler ind i systemet og bliver fanget mellem glaspladerne. Hvis dette sker, skal du fortryde montage, vask og Annuller Fortryd. - Når gradient gel er helt hældes, stoppe pumpen, og overlay vand (ca. 1 mL) på hver gel sandwich for at forhindre tørring af gel. Lad polymerisere i 2 timer.
- Forbered 25 mL stabel gel i Erlenmeyer og Swirl for at blande grundigt. Fjern vand og Indsæt 15 brønd kamme i hver gel sandwich. Hæld stabling gel og lad polymerisere i 2 h.
Bemærk: gels kan være støbt og opbevares ved 4 °C i 1 uge. - Indsæt gel i sandwich klemmer og fjern kam. Når den korte glasplade vender nedad, skal du indsætte gel-sandwichen i køle kernen. Gentag på den anden side, og Placer kernen i elektroforese tanken.
- Hæld 300 mL blå katalyse buffer i det indre kammer af elektroforese tanken. Hæld 2 L anode buffer i det ydre kammer af elektroforese tank.
Bemærk: elektroden skal nedsænkes i katdebuffer, hvilket kræver ca. 300 mL. - Belastningen mellem 75 μg og 175 μg protein pr. brønd. Kør gel på 150 V for 1,5 h (eller indtil prøverne alle har indtastet gradient gel) i koldt rum (4 °C).
NOTE 1:1) der kræves et minimum på 75 μg pr. brønd for god opløsning af in-gel-aktivitets bånd. Indlæsning af over 175 μg protein vil føre til tab af tydelige bånd på grund af overdreven enzymaktivitet. 2) replikater af prøven skal indlæses i separate brønde for at muliggøre parallel bestemmelse af in-gel aktiviteter og immunoblot analyse af OXPHOS komplekser. Parallel bestemmelse af IGA for CI, CII, CIV og CV kræver mindst 300 μg. parallel immunoblotanalyse af CI, CII, CII, CIV og CV kræver mindst 375 μg. - Fjern Blue Cathode buffer med pipet eller vakuum, Erstat med 300 mL Coomassie blå-fri Cathode buffer, og Kør gel ved 200 V natten over (16 – 20 h) i koldt rum (4 °C). Fortsæt til trin 3 eller 4 for måling af aktivitet i gel eller immunoblotting.
3. in-gel-aktivitet for komplekser I, II, IV og CV
- Før udgangen af elektroforese, forberede in-gel aktivitet buffere i henhold til tabel 6, og holde i mørke på rt. 20 ml in-gel aktivitets buffer er tilstrækkelig til 3 prøvebaner.
Bemærk: dette CV i-gel aktivitet assay er baseret på den omvendte aktivitet af ATPsynthase (dvs., ATP hydrolyse), og bruger calcium som en co-faktor, som udfælder i gelen. Calcium er mindre skadeligt end det bly, der anvendes i andre protokoller. Desuden kræver anvendelsen af denne protokol ikke en præ-aktivering/konditionering af gel23. - Stop elektroforese og Hent gel. Cut baner, hvis det er nødvendigt, og overføre gel baner i plastikposer (3 sider skåret, og plastikpose åbnet som en bog). Seal 2 af de 3 sider med en varme sealer.
Bemærk: for at sammenligne sammensætningen af SC-bånd mellem forsøgsgrupper anbefales det at køre de samme prøver i replikater på samme gel. Skær banerne til at inkuere hver replikat i forskellige i-gel aktivitet buffere (CI, II, IV, V). For at bekræfte specificiteten af assays, kan yderligere replikater være forberedt til at køre i gel aktiviteter i tilstedeværelse af specifikke respirations kæde hæmmere. - For 3 eksperimentelle prøver (dvs. 3 brønde), tilsæt 20 mL in-gel aktivitets buffer, Fjern bobler, og forsegl 4th side af plastikpose.
Bemærk: Tilføj inhibitorer i negative kontrol eksperimenter, hvis de udføres: CI: Rotenone 1 μM; CII: natrium Malonat 10 mM; CIII: Antimycin-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: oligomycin 0,5 μM. - Der inkube gel baner ved 37 °C i mørke og kontrollér hver 15 min. inkubationstid varierer afhængigt af mængden af protein og komplekser. CI vil reagere hurtigere end CIV eller CV. optimal farvning sker normalt efter 2 timer for CI, 4 h for CIV og 6 h for CII og CV.
- Skyl gelbaner i vand for at stoppe reaktionen, og billede på en hvid baggrund for CI, CII, CIV, eller sort baggrund for CV.
Bemærk: gels kan opbevares i plastikposer ved RT eller 4 °C i flere måneder.
4. immunoblotting
- Forbered overførselsbufferen i henhold til tabel 7, og hold på rt. Forbered tbst og holde på rt.
- Anbring hele gelen eller udvalgte baner i en beholder, og Tilføj overførsels buffer suppleret med SDS (0,25% Final i overførsels buffer). Anbring beholderen på rocker og inkube i 1 time.
- Skær PVDF-membranen (størrelse svarende til gelen) og aktiver i 20 mL methanol under omrøring i 2 min. Udskift med 20 mL overførsels buffer, og Anbring under omrøring i 2 min.
- Forbered Transfer sandwich, fra bund til top, og sørg for at der ikke er nogen boble mellem gel og aktiveret PVDF membran: klar side af kassette/sort svamp/blotting papir/membran/gel/blotting papir/sort svamp/sort side af kassette. Luk og lås kassetten.
- Sted Transfer sandwich i Transfer tank, med klar side af sandwichen vender den røde side af elektroden, og hæld Transfer buffer til at indflette gelen. Tilslut kølesystemet til overførsels beholderen og sæt den til 4 °C. Tilslut til strømforsyningen, indstillet til 40 mA, og køre i 24 timer.
- Hent membraner, blok i 1 time i 5% BSA i TBST, og inkuere i primær antistof opløsning tilberedt i 5% BSA i TBST natten over ved 4 °C.
Bemærk: Se tabel 8 for anvendte antistoffer. - Skyl membraner i TBST 3x i 10 min. hver.
- Der inkuperer membraner i sekundære antistof opløsninger fremstillet i 5% BSA i TBST i 2 timer ved stuetemperatur.
- Skyl membraner i TBST 3x i 10 min. hver.
- Tilsæt kemiluminescens opløsning til membraner og billede.
5. analyse af
- I-gel-aktivitetsanalyse billeder eller immunoblots kan bruges til at analysere SCs. At analysere sammensætningen af bands, justere replikater og validere, hvilket kompleks reagerede positivt for hvert givent band.
- At analysere fordelingen af komplekser, i forskellige supramokylære samlinger, åbne billeder i ImageJ og bruge gel analyseværktøj (Se figur 5 for et eksempel).
- Vælg baner med rektangelværktøjet, og plot baner.
- Tegn streger for at lukke området under kurven for hvert interesse bånd, og klik på hvert område med stav værktøjet for at generere en tabel, der indeholder området under kurve værdierne.
- For at beregne fordelingen af komplekset skal værdierne for hvert bånd rapporteres i forhold til monomer.
Representative Results
Figur 2 viser resultater fra et digitonin titrerings eksperiment, der har til formål at identificere den korrekte mængde af digitonin, der kræves til udvinding af SCS. Dette beløb vil variere afhængigt af væv/celletype, og om prøven var frosset eller ej. Til dette eksperiment blev der udført en CIV in-gel-aktivitet for at visualisere SCs isoleret fra frisk muse levermitokondrier. Forholdet fra 2/1 til 10/1 g digitonin/g protein blev testet. Den optimale mængde af digitonin til denne prøve er 4 g/g, da det giver en god opløsning af monomerisk CIV, og høj molekylvægt SCs. Ved et lavere forhold, er bands ikke klar og løse i en smøre under elektroforese, hvorimod brugen af højere ratio af digitonin fører til afbrydelse af høj molekylvægt SC.
Figur 3 og figur 4 viser resultaterne af et komplet eksperiment udført på et præparat af muselever mitokondrier ekstraheret med 4 g digitonin/g protein. Proteiner blev separeret ved hjælp af hybrid BN/CN-PAGE, standard BN-PAGE eller CN-PAGE. Alle tre geler blev støbt på samme tid og baner blev lastet med replikater af samme prøve. Efter elektroforese blev individuelle baner skåret og forarbejdet til ved måling af gelaktivitet (CI, CII, CIV og CV på figur 3) og immunblotting (CI, CII, CIII, CIV, CV på figur 4).
Tilføjelse af CB enten i et øjeblik i katalyse buffer (dvs. hybrid CN/BN-PAGE) eller i prøve-og katorbufferbuffer i hele elektroforese (dvs. BN-PAGE) forbedrer mobiliteten og opløsningen af SC-båndene betydeligt, og individuelle luftvejs komplekser sammenlignet med KN-side (figur 3). Båndene kan let skelnes med hybrid teknikken eller BN-PAGE efter in-gel-aktivitet for CIV, hvorimod der i samme prøve, som er løst med CN-PAGE, er ikke nogen identifikation af SCs og monomere CIV-reaktive bånd.
Figur 3 og figur 4 viser, at opløsningen og banding mønstret for oxphos monomerer og supramoolekylære samlinger er KVALITATIVT sammenlignelig mellem hybrid cn/BN-PAGE og bn-Page. Der er dog betydelige forskelle. For det første er den elektroforetiske mobilitet af OXPHOS-komplekser svagt reduceret, når proteiner adskilles ved hjælp af hybride KN/BN-PAGE-betingelser vs . standard bn-Page på grund af reduceret mængde CB. Dette mobilitets Skift er større for CIV-monomerer, efterfulgt af CV-monomerer og CI (figur 3 og figur 4). For det andet er den blå baggrund lavere i den hybride KN/BN-PAGE sammenlignet med BN-PAGE (figur 3, venstre baner). Som et resultat, høje baggrundsniveauer efter bn-Page helt masker i-gel aktivitet farvning for CII, og forbedrer baggrundsstøj i forbindelse med aktiviteten af Civ dimere (figur 3). For det tredje er aktiviteten af CV højere, når prøverne drives under hybride KN/BN-PAGE betingelser sammenlignet med BN-PAGE (figur 3), på grund af den reducerede mængde af CB, som er kendt for at forstyrre CV katalytisk aktivitet. 26 cn/bn-Page giver også mulighed for bedre bevaring af CV-supramokylære samlinger, som det fremgår af en større andel af den samlede CV-aktivitet, der forbindes med CV-dimere (figur 3). Desuden er CV-oligomerer synlige under CN/BN-PAGE, mens de er fuldstændig dissocieret under BN-PAGE-betingelser. Det er interessant, at der også observeres særskilte bands, der viser CV-aktivitet mellem CV-monomerer og dimere, når prøverne køres under CN/BN-PAGE (figur 2).
Figur 5 viser en repræsentativ analyse af OXPHOS-kompleks distribution i supramoolekylære samlinger. Billedet viser CI i gel aktivitet af prøver opnået fra 4 forskellige sunde mus leveren mitokondrier præparater. Densitometri analyse gør det muligt at måle arealet under kurven af CI-reaktive bands, og at præsentere den relative fordeling af C1 aktivitet i monomerisk (I1) og supramokylære former (i1III2, i1III2IV 1, I1III2IVn). Lignende analyse kan udføres efter immunoblot.
Figur 1: analyse arbejdsgang. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Digitonin titrering for at udtrække superkomplekser fra frisk muse levermitokondrier. Dette eksempel viser aliquoter af mus leveren mitokondrier, isoleret fra et dyr, der blev behandlet med stigende mængder af digitonin at udtrække respiratoriske super komplekser. Prøverne blev derefter løst ved en hybrid KN/BN PAGE, og CIV-aktiviteten i gel blev bestemt. CIV1: komplekse IV monomerer; CIV2: komplekse IV-dimere; SC: super komplekser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: in-gel-aktivitet af OXPHOS-komplekser efter hybrid cn/bn-Page, bn-Page eller cn-Page. Leveren mitokondrier isoleret fra en mus blev behandlet med digitonin (4 g/g ratio digotonin/protein) til at udtrække respiratoriske super komplekser. Aliquoter af denne prøve blev derefter lastet på flere brønde i tre forskellige geler og indsendt til cn/bn-Page, bn-Page eller cn-Page. Hver replikat bane inden for hver gel blev derefter skåret og straks anvendt til in-gel aktivitet analyser (mærket CI, CII, CIV og CV). En bane blev brugt som kontrol til at vise baggrund (mærket BG) farvning med Coomassie Blue. OXPHOS-komplekser og supramomolekylære samlinger identificeres ved hjælp af standard nomenklaturen med tal i indeks, der angiver molekyl støkiometri for hvert OXPHOS-kompleks. Det skal bemærkes, at positionen af CIII-holdige supramoolekylære samlinger er baseret på immun påvisning, da der ikke blev udført in-gel-aktivitet for CIII i dette særlige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunoblot-analyse af OXPHOS-komplekser efter hybrid cn/bn-Page eller bn-Page. Replikater fra de eksperimenter, der er beskrevet i figur 3 legenden blev elektro-overført på en enkelt membran. Efter overførslen blev individuelle baner skåret og inkueret med specifikke antistoffer, der genkender CI, CII, CIII, CIV og CV. OXPHOS-komplekser og supramoolekylære samlinger identificeres ved hjælp af standard nomenklaturen, med tal i indeks, der angiver Molekylær støkiometri af hvert OXPHOS-kompleks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kvantificering af CI-fordelingen i monomerisk og supramokylære enheder. A) CI in-gel-aktivitet bestemt efter hybrid cn/bn-Page i lever mitokondria s.c.-ekstrakter opnået fra 4 mus. B) densitogrammer, der er fremstillet ved hjælp af ImageJ 's gel-analyseværktøj, der viser forskellige toppe svarende til CI monomerer (i1) og forskellige CI-holdige supramoolekylære komplekser (i1III2, I1III2IV1 , og I1III2IVn). C) kvantificering af den relative fordeling af C1-aktiviteten. Dataene repræsenterer middel og SEM af de 4 mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Digitonin/protein-forhold (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| Volumen af ekstraktions buffer (μL) | 400 af | 300 af | 200 af | 100 af |
| Volumen på 10% lager-digitonin (μL) | 100 af | 200 af | 300 af | 400 af |
| Samlet mængde af ekstraktions buffer (μL) | 500 af | 500 af | 500 af | 500 af |
Tabel 1: volumen, der kræves for at udtrække Sc'er fra 5 mg mitokondriske proteiner ved hjælp af forskellige digitonin/protein-forhold.
| Sammensatte | Afsluttende koncentration |
| EDTA, pH 7,5 | 1 mM i |
| HEPES | 30 mM i |
| Kaliumacetat | 150 mM |
| Glycerol | 12 |
| 6-aminocapinsyre | 2 mM i |
Tabel 2: SC-ekstraktions buffer (afsluttende koncentrationer). Opbevares ved 4 °C i højst 3 måneder.
| Sammensatte | Afsluttende koncentration |
| 3X gel buffer: Aliquot og opbevares ved-20 °c, pH 7,5 | |
| Imidazol/HCl pH-7,0 | 75 mM |
| 6-aminocapinsyre | 1,5 mio. |
| Acrylamidbuffer: Aliquot og opbevares ved-20 °c | |
| Acrylamid | 99,5% af |
| BIS-acrylamid | 3 |
Tabel 3: gelé-lager buffere.
| For 2 gels: | 4% (60 mL) | 12% (60 mL) | Stabling (4%) (25 mL) |
| 3X gel buffer | 19,8 mL | 19,8 mL | 8,25 mL |
| Acrylamidbuffer | 4,8 mL | 14,4 mL | 2 mL af |
| H2O | 35 mL | 13,1 mL | 14,6 mL |
| Glycerol | - | 12 mL af | - |
| APS 10% | 360 μL | 60 μL | 150 μL |
| TEMED | 24 μL | 12 μL | 10 μL |
Tabel 4:4% – 12% gradient gel.
| Sammensatte | Afsluttende koncentration |
| Anode buffer: opbevares ved 4 °C, pH 7,5 | |
| Imidazol | 25 mM i |
| Katdebuffer: opbevares ved 4 °C, pH 7,5 | |
| Tricine | 50 mM |
| Imidazol | 7,5 mM |
| Med eller uden Coomassie Blue (G250) | 0,022% af |
Tabel 5: elektroforese buffere.
| Sammensatte | Afsluttende koncentration |
| Kompleks i aktivitet buffer: Forbered frisk i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Nitrotetrazolium blå | 3 mM i |
| Nadh | 14 mM i |
| Kompleks II aktivitet buffer: Forbered frisk i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Succinat | 20 mM i |
| PMSF | 0,2 mM |
| Nitrotetrazolium blå | 3 mM i |
| Kompleks IV aktivitet buffer: Forbered frisk i 50 mM na-fosfat pH 7,2 | |
| Cytokrom C | 0,05 mM |
| Af diaminobenzidin | 2,3 mM |
| ATPsynthase aktivitet buffer: Forbered frisk i vand, justere pH til 8 med KOH | |
| Glycin | 50 mM |
| MgCl2 | 5 mM i |
| HEPES | 50 mM |
| CaCl2 | 30 mM i |
| Atp | 5 mM i |
Tabel 6: in-gel-aktivitetsanalyse buffere.
| Sammensatte | Afsluttende koncentration |
| Overfør buffer | |
| Tris base | 25 mM i |
| Glycin | 192 mM |
| Sds | 4 |
| Methanol | 20 |
| Af TBST | |
| Tris base | 20 mM i |
| Nacl | 137 mM |
| Mellem 20 og | 0,1% af |
Tabel 7: immunoblotting-buffere.
| Komplekse | Underenhed | Klon |
| I | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| Ii | Af SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| Iii | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| Iv | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | Af ATPB | 3D5 |
Tabel 8: antistoffer, der anvendes til immunblotting for at detektere respirations kæden SC. Se tabellen over materialer for virksomheder og lotnumre.
Discussion
Mitokondrielle super komplekser er aktivt undersøgt for at belyse deres fysiologiske rolle, og deres betydning i patogenesen af talrige sygdomme hos mennesker, uanset om de erhverves eller genetiske mitokondrielle sygdomme3,7 , 9 ud af , 10 stk. , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14. for at opnå pålidelige resultater er det nødvendigt at overveje flere aspekter. Denne protokol er blevet testet med muselever mitokondrier, mus skeletmuskulatur mitokondrier (resultater ikke vist), rotte hjerte mitokondrier, og humane fibroblast mitokondrier (resultater ikke vist), men kunne helt sikkert tilpasses til andre kilder til isolerede Mitokondrier. Metoden kombinerer forskellige aspekter af bn og cn-side protokoller, som gør det muligt at reducere eksponeringen for detergenter og anioniske forbindelser til et minimum i forhold til offentliggjorte protokoller20,27,28.
Forberedelse af prøver
Prøveforberedelse er et afgørende skridt for en vellykket adskillelse af SCs. buffer sammensætning bør nøje udvælges for at opnå en korrekt opløselig opløsning af proteiner og proteiner, samtidig med at det bevarer så meget som muligt deres funktionelle og strukturel integritet. Ionisk styrke og pH af ekstraktions bufferen er to vigtige faktorer at overveje. Saltkoncentrationer, der er for lave (< 50 mM K-acetat eller NaCl), vil resultere i dårlig opløsning af proteiner i tilstedeværelse af nonioniske rengøringsmidler, mens saltkoncentrationer over 500 mM vil fremme protein stabling/-aggregering og udfældning af CB og proteiner29. SCs bør derfor ekstraheres ved hjælp af buffere nær fysiologisk ionstyrke. Med hensyn til pH anbefales det at anvende en nær fysiologisk pH-værdi.
Vaskemiddel type og forholdet mellem rengørings-og protein er også afgørende for optimal SC ekstraktion. For maksimal bevaring af indbyggede SCs foretrækkes digitonin26. Som det fremgår af denne protokol og andre offentliggjorte metoder23,30,31,32, bevarer dette milde rengøringsmiddel den supramoolekylære sammensætning af flere SC-samlinger, og den dimeriske og oligomerisk struktur af ATPsynthase (figur 3 og figur 4). Titrering af prøver af interesse med forskellige mængder af digitonin er afgørende for at identificere de forhold, der muliggør optimal solubilisering, samtidig med at enzymaktivitet og fysiologiske protein interaktioner bevares. Titrering skal udføres med forhold mellem 2 og 8 g/g26. Optimale resultater for leveren, skeletmuskulaturen og hjerte mitokondrier opnås med henholdsvis 4, 5 og 6 g digitonin/g protein. Det skal bemærkes, at digitonin kan erstattes af Triton X-100, som under optimale forhold resulterer i tilsvarende migration og SC-komposition som dem, der observeres med digitonin2. Dette rengøringsmiddel bør dog anvendes med forsigtighed, da relativ lille stigning i forholdet mellem rengøringsmiddel og protein (f. eks. fra 1 til 1,5 g/g) kan resultere i en fuldstændig afkobling af SCs-samlinger2, hvilket kan resultere i eksperimentelle uoverensstemmelser. Efter ekstraktion suppleres prøverne traditionelt med coomassie Blue for at give proteiner en ladning, når de påføres gelen, med undtagelse af den traditionelle KN-side20,26. For at minimere protein eksponeringen for coomassie blå og potentiel afkobling af labile proteiner suppleres prøverne ikke med coomassie Blue i denne protokol.
Elektroforese
Både CN-PAGE og BN-PAGE er blevet brugt til at studere mitokondrial OXPHOS-komplekser, der hver især har særskilte fordele og begrænsninger. De mildere betingelser, der anvendes under CN-PAGE (hovedsagelig fraværet af CB, som har en vaske-lignende effekt), muliggør en bedre konservering af ATP-syntase i-gel-aktivitet og begrænser dissociationen af labile proteiner i højmolekylære SCs og ATP-syntase Samlinger26. Fraværet af det anioniske farvestof CB i proteinet ekstrakt og elektroforese buffere får proteinerne til at migrere baseret på deres iboende ladning og isoelektrisk punkt, hvilket reducerer den elektroforetiske mobilitet af proteiner i gelen26. Desuden, i mangel af CB, proteiner med utilstrækkelig negativ ladning tendens til at aggregere, og dermed reducere opløsningen af protein komplekser i gel20,26. For at omgå disse begrænsninger er den såkaldte KN-side med høj opløsning blevet udviklet af Wittig og Schragger20. I denne protokol tilsættes natriumdeoxycholat (DOC) og forskellige milde, ikke-ioniske rengøringsmidler (DDM, Triton X100) til katinbufferen for at holde membran proteinerne opløsnet og pålægge et negativt gebyr skift på proteiner, hvilket resulterer i en betydelig forbedring af resolution20.
Et karakteristisk træk ved den nuværende hybride KN/BN-protokol er, at der kan opnås en sammenlignelig opløsning uden disse vaske-og rengøringsmidler. Momentan tilsætning af CB til kattebufferen i begyndelsen af elektroforese er tilstrækkelig til at begrænse protein sammenlægningen og øge mobiliteten i gelen (figur 3 og figur 4). Som et resultat, denne hybrid teknik muliggør fremragende opløsning af særskilte SC samlinger og meget lav eller ingen eksponering for vaske-og rengøringsmidler. Tilstedeværelsen af lave mængder af CB giver også bedre beskyttelse af CV aktivitet, forbedret bevaring af dimeriske og oligomere CV forsamlinger (figur 3 og Wittig og schägger 200526), og en reduktion af den blå baggrundsstøj, der kan hæmme kvantificeringen af gel-aktiviteter, især for CII og CIV (figur 2). Desuden begrænser fraværet af CB i protein ekstrakten afbrydelsen af labile protein interaktioner inden for SCs. For eksempel, fysisk Association af ATP syntase med ANT til at danne synthasome 33 eller med cyclophilin-D til at regulere PTP åbning 34 ses bedre i fravær af CB. Midlertidig udsættelse for CB under elektroforese kan derfor være nyttig til at afsløre nye protein interaktioner inden for SCs. denne hybride KN/BN-PAGE-protokol giver således mulighed for at kombinere præcise og hurtige målinger af gel-aktivitet med analytiske teknikker, der involverer 2D elektroforese, immuno-detektion og/eller proteomics til avanceret analyse af SCs. Det skal bemærkes, at med den stigende interesse for SCS, et stigende antal undersøgelser bruger små 10 x 10 cm geler for native Page. Selv om denne fremgangsmåde kan være tilstrækkelig til at identificere grove ændringer i de overvældende SC-samlinger, er den lavere separations kapacitet for små geler sandsynligvis begrænset til at løse subtile rekonstruktioner eller til at skære særskilte bånd til proteomiske analyse. Desuden har flere undersøgelser, der anvender mindre geler, rapporteret, at respirasomet migrerer i samme størrelse som ATPsynthase dimer, hvilket gør det vanskeligt at adskille dem22. Derfor bør brugen af store geler foretrækkes.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jenna Rossi for teknisk assistance, og Dr. Mireille Khacho, Dr. David Patten og Dr. Ujval Anil Kumar for nyttige diskussioner, mens udvikling af denne metode. Dette arbejde blev finansieret af de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) og national Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC). AC er modtager af doktor Award-Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarships (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
References
- Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
- Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
- Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
- Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
- Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
- Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
- Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Methods in Cell Biology. 80, Academic Press. 3-44 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582 (2009).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Beutner, G., Porter, G. A. Jr Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).
- Von Hagen, J. Proteomics Sample Preperation. , Wiley InterScience. 485 (2008).
- Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).
