Summary
여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.
Abstract
산화 적 인 산화 기계 장치의 복합체는 미토 콘 드리 아에 구조적이 고 기능적인 이점을 부여 하는 것으로 추정 되는 슈퍼 복합체 (SCs) 라는 초 분 자체 단백질 배열을 형성 한다. SCs는 효 모에서 포유류에 이르기까지 많은 종에서 확인 되었으며, 연구의 증가는 유전 및 후천성 인간 질병에 있는 그들의 조직의 중단을 보고 합니다. 결과적으로, 실험실의 증가 수는 방법론적으로 까다로울 수 있는 SCs 분석에 관심이 있습니다. 이 문서에서는 블루 및 클리어 네이티브 페이지 방법의 장점을 결합 하 여 시간 효율적인 방식으로 SCs를 확인 하 고 분석 하는 최적화 된 프로토콜을 제공 합니다. 이 하이브리드 CN/BN 페이지 방법으로, 중성 세제의 최적 양으로 추출 된 미토 콘 드리 아 SCs는 다른 세제에 노출 되지 않고 전기 영동의 시작 부분에서 음이온 성 염료 Coomassie 블루 (CB)에 간략하게 노출 digitonin. CB에 대 한이 짧은 노출은 기존의 BN 페이지 방법과 마찬가지로 SCs를 효과적으로 분리 하 고 해결 하는 동시에, SCs 내에서 젤 내 활성 분석에 대 한 높은 CB 수준의 부정적인 영향을 피하는 한편, 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 허용 합니다. 이 프로토콜을 사용 하면 SCs의 고급 분석을 위한 2D 전기 영동, 면역 검출 및/또는 프로 테오 믹스를 포함 하는 분석 기법과 젤 활성 측정에서 정밀 하 고 신속 하 게 결합할 수 있습니다.
Introduction
미토 콘 드리 아는 산화 적 인 산화를 통해 에너지를 생산 하 고 호흡기 복합체 I-II-III-IV는 기질을 산화 시키고 전자를 산소로 전달 하 여 ATP 신 타제 (CV)에 의해 ADP의 인 산화를 허용 하는 그라데이션을 생성 합니다. 지난 몇 년 동안, 광범위 한 연구에 따르면 호흡기 사슬 복합체는 미토 콘 드리 아 막 내부에서 선형 방식으로만 통합 되지는 않았지만 슈퍼 복합체 (SCs) 배열1,2로 구성 됩니다. 포유류 미토 콘 드리 아에서, SCs는 다양 한 stoichiometries에 존재 합니다: CI/CIII2/문명1-4 (respirasome로 명명 되 고 nadh의 능력이 있는 경우)2, CI/ciii 2 및 ciii 2 /문명1-23,4. 또한, 호흡기 복합체는 자유로운 형태와 SCs 배열 사이의 상이한 비율로 분배 된다. 따라서 SCs의 85%는 CIII의 55% ~ 65%, 그리고 CIV의 15%가 발견 되는 것으로 추정 됩니다. 이러한 초 분자 구조는 ROS 생산을 감소 시키거나, 개별 복합체의 조립을 안정화 시키거나, 호흡기 사슬 활성을 조절 하 고, 단백질이 풍부한 내부 미토 콘 드리 아 막 5에서 단백질 응집을 방지 하는 것으로 생각 된다 ,6,7,8. 그들의 에너지 수요의 변화와 질병의 발병 기 전에 서의 중요성에 대 한 그들의 재 모델링 능력은 여러 실험실에서 조사 되 고 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14. 연구에의 하면 SCs 조립 체의 병리학 적 변화는 심장 마비16의 심장과 올 리 핀 합성에서 유전적 결함을 포함 하 되이에 국한되지 않는 다양 한 장애에 존재 한다는 것을 입증 하였으며, 허 혈 재 관류17, 당뇨병12및 노화18.
기본 전기 영동 및 면역 검출은 oxphos 복합체 4 차 배열2,19,21을 해결 하기 위해 SCs 연구에서 널리 사용 됩니다. 천연 전기 영동은 다양 한 SCs 어셈블리1,19의 정밀한 분자 측정을 가능 하 게 하기 위해 겔 활성 분석 또는 2d-sds 페이지에서 특정 하 게 결합 될 수 있다. SCs를 연구 하는 능력은 사용 되는 세제의 유형 및 농도, 이온 강도 및 pH 뿐만 아니라 완충 조성, CB, 젤의 존재를 포함 하는 전기 영동 마이그레이션 조건 등 추출 조건에 결정적으로 의존 합니다. 크기 및 아크릴 아 미드 비율2.
프로토콜 및 SCs 대역 해상도는 논문에 따라 크게 달라 지 며, 연구 간의 비교는 어렵고22에 도전 하는 방법의 적응을 어렵게 합니다. 따라서, 본 논문은 비 이온 성 세제 digitonin와 다른 소스의 격리 된 미토 콘 드리 아 로부터 SCs를 추출 하 고, 고 분자량 SCs 대역을 해결 하기 위해 강력 하 고 최적의 프로토콜을 제안 한다. 최적화 된 세제 농도, 추출 완충 액의 조성, 시료 전처리 시 Coomassie 청색의 부재는 단백질 복합체의 파괴를 최소화 합니다. 이 프로토콜 ( 그림 1 참조)은 대형 젤에 대 한 최적의 SCs 어셈블리 분해능을 위해 CN 페이지와 BN 페이지를 결합 하 고 있으며, 반응성 밴드의 더 나은 시각화를 가능 하 게 하는 젤 내 활동 분석과 호환 됩니다. 상세한 분석을 위한 면역 검출 SCs 배열 및 조성 물.
Protocol
1. SC 추출
- 물에 EDTA를 용 해 하 여 추출 완충 액 100 mL를 준비 합니다 ( 표 2참조). KOH를 완전히 녹을 때까지 pH를 증가 시킨 다음 HCl로 pH를 7.5로 조정 하십시오. 용액에 남아 있는 성분을 추가 하 고 물로 최종 부피를 완성 하 고 얼음을 유지 합니다. 튜브에서 추출 완충 액을 digitonin 용 해 하 여 10%의 스톡 용액을 완전히 녹을 때까지 철저히 녹 인 후 얼음을 유지 하십시오.
주: 추출 완충 액은 미리 준비 하 여 4°c에서 최대 2 개월 동안 보관할 수 있다. 물결 모양의 밴드가 겔의 바닥에 나타나기 시작 하면 추출 버퍼가 너무 오래 되었음을 의미 합니다. 10% digitonin 용액을 준비 하는 경우, 마우스 간 미토 콘 드리 아를 사용 하는 경우 샘플 당 500 µ L을 계산 하는 스톡 볼륨을 준비 합니다. Digitonin 용 해도는 원산지 및 제품 로트에 따라 다릅니다 ( 재료 표참조). - 동물 조직 으로부터 분리 된 미토 콘 드리 아 (쥐 심장, 근육, 간; 쥐 심장) 또는 표준 프로토콜을 사용하 여 (인간 섬유 아 세포),25 는 SCs의 추출을 위해 사용 될 수 있다. 미토 콘 드리 아가 얻어진 후에는 제조사의 권장 사항에 따라 bicin전북 산 성 분석 키트를 사용 하 여 단백질 함량을 정량화 합니다. 필요에 따라이 단계에서 프로 테아 제 및 phosphatases 억제제와 격리 된 미토 콘 드리 아를 보충.
참고: SCs는 신선한 또는 해 동 된 미토 콘 드리 아 중에서 추출할 수 있습니다. 동시에 모든 샘플에서 SCs를 추출 하 여 동일한 조건에서 동일한 솔루션 배치로 처리 되도록 하는 것이 좋습니다. - 얻어진 미토 콘 드리 아 단백질 농도에 기초 하 여, 원하는 최종 digitonin/단백질 비는 표 1에 따라 필요한 스톡 digitonin 용액 및 추출 완충 액의 부피를 계산 한다. SC 추출의 경우, 미토 콘 드리 아 단백질의 10 µ g에 대 한 digitonin를 포함 하는 추출 완충 액 (표 2)의 1 µ l을 추가 한다. Digitonin/단백질 비율은 2에서 8g에 변화할 수 있습니다. Digitonin 적정은 사용 되는 각각의 새로운 샘플 유형에 대해 항상 수행 해야 합니다 (예제는 그림 2 참조).
- 펠 릿 미토 콘 드리 아, 16000에서 원심 분리 하 여 1.5 mL 튜브에서 4°c에서 10 분 동안 x g .
- 상층 액을 버리고 계산 된 부피의 digitonin를 포함 하는 얼음-저온 추출 완충 액에서 미토 콘 드리 아 펠 렛을 다시 일시 중단 한다. 튜브를 미니 튜브 회전자에 놓고 중간 회전 속도로 4°c에서 30 분 동안 배양 합니다. 샘플이 제대로 혼합 되어 있는지 확인 하십시오.
- 시료를 4°c에서 45 분 동안 20400 x g 에서 원심 분리 하 여 불용 화 된 조각을 제거 합니다.
- 얼음에 새로운 튜브에 상층 액을 전달 하 고 단백질을 정량화. 이 분 획은 호흡기 수퍼 복합체 추출 물을 나타낸다. 전기 영동을 같은 날에 수행 하지 않으면-80 ° c에서 샘플을 저장 합니다.
참고: 1) 추출 물의 동결/해 동 주기를 피하십시오, 이것은 SCs의 더 높은 분자 배열을 방해 하기 때문에 제 1 동결/해 동 주기 전에 샘플 필요. 2) 표준 BN 페이지 실험을 수행 하려면이 단계에서 SCs 추출 물에 CB를 추가 해야 합니다. CB는 사용 되는 세제의 양을 기준으로 1g/8g 비율로 첨가 해야 합니다.
2. 그라데이션 젤 주조 및 전기 영동
- 그라데이션 젤, 분 취 제를 만들기 위한 3 배의 그라데이션 버퍼 및 아크릴 아 미드 스톡을 준비 하 고-20°c에서 보관 하십시오 ( 표 3참조).
- 양극 및 음극 버퍼를 준비 하 고 4°c에서 유지 합니다 ( 표 5참조).
- 캐스팅 챔버를 열고 챔버에 외부 유리판 (20cm x 22cm)을 놓습니다. 정렬 카드를 사용 하 여 스페이서의 한 세트 (1.5 mm)를 배치 하 여 챔버의 측면과 모서리에 단단히 고정 되도록 합니다. 내부 유리 접시 (20cm x 20cm)를 스페이서의 상단에 올려 놓고 (이것은 젤 샌드위치를 형성 합니다), 유리판 위에 플라스틱 분리 시트를 넣는다.
- 원하는 수의 젤이 도달할 때까지 2.3 단계를 반복 합니다. 이 프로토콜의 경우 4 개의 젤이 주조 됩니다. 우리가 사용 하는 주조 챔버 시스템 ( 재료 표참조)은 한 번에 최대 10 개의 젤을 주조 할 수 있습니다. 필요에 따라 먼저 많은 아크릴 블록을 추가 하 여 챔버의 나머지 공간을 차지 하 고, 필요한 경우 유리 접시.
참고: 몽타주는 단단히 봉인 해야 합니다. 챔버의 젤 샌드위치 사이에는 공백이 없어야 합니다. - 개스킷 노치에 단단히 가스 켓을 장착 하기 전에 홈에 파라 필름의 스트립을 놓습니다. 실링 플레이트를 챔버에 놓고 나사 6 개를 모두 조입니다. 캐스팅 챔버를 서 있습니다.
- "빛" 혼합 챔버에 자석 교 반기가 있는 교 반 판에 그래디언트 전자를 배치 하십시오. 그라데이션 전자에 주조 챔버의 튜브를 연결 하 고, 연동 펌프의 카세트에 튜브를 고정 하 고, 그라데이션 전자의 모양이 닫혀 있는지 확인 합니다.
- 4 개의 젤을 시 전할 때, 60 mL의 4%와 60 mL의 12% 젤 용액을 준비 합니다 ( 표 4참조) 삼각 플라스 크에 넣고 완전히 소용돌이 어 서 섞어 줍니다. "빛" 혼합 챔버에 4% 젤 용액 60 mL를 붓고 그라데이션 전자의 "무거운" 저수지 챔버에서 12%의 60 mL를 부 어 줍니다. 350 rpm에서 교 반 판의 교 반 속도를 설정 합니다. 스톱 콕을 열고 35 rpm에서 펌프를 켜십시오.
- 일단 광 분 율이 중량 분 율 보다 낮으면 펌프를 일시 중지 하 고 "빛"과 "무거운" 저장소 사이에 밸브 스템을 열고 분 획 량 평형을 하 게 하 고 펌프를 다시 시작 하십시오.
참고: 거품이 시스템을 입력 하 고 유리 접시 사이에 갇혀 얻을 하는 것이 중요 합니다. 이 경우, 몽타주를 실행 취소, 씻고 다시 실행. - 일단 그라데이션 젤을 완전히 붓고, 펌프를 중지 하 고 젤의 건조를 방지 하기 위해 각 젤 샌드위치에 물 (약 1 mL)을 오버레이. 2 시간 동안 중 합 하자.
- 에 르 렌 마이어에서 25 mL 스태킹 젤을 준비 하 고 완전히 섞어 줍니다. 물을 제거 하 고 각 젤 샌드위치에 15 우물 빗을 삽입 합니다. 스태킹 젤을 붓고 2 시간 동안 중 합 하자.
참고: 젤은 1 주일 동안 4°c에서 주조 및 보관할 수 있습니다. - 샌드위치 클램프에 젤을 넣고 빗을 제거 합니다. 짧은 유리판이 아래로 향하게 하 여 냉각 코어에 젤 샌드위치를 넣습니다. 반대쪽을 반복 하 고, 전기 영동 탱크에 코어를 놓습니다.
- 전기 영동 탱크의 내부 챔버에 청색 음극 완충 액 300 mL를 붓 습니다. 전기 영동 탱크의 외부 챔버에 양극 버퍼의 2l를 붓는 다.
참고: 전극은 음극 완충 액에 잠겨 있어야 하며이는 약 300 mL가 필요 합니다. - 웰 당 75 μ g과 단백질 175 μ g 사이의 부하. 차가운 방 (4°c)에서 1.5 시간 동안 또는 샘플이 모두 그라데이션 젤에 들어갈 때까지 150 V에서 젤을 실행 하십시오.
참고 1:1) 젤 내 활성 밴드의 양호한 분해능을 위해 웰 당 최소 75 μ g가 필요 합니다. 단백질의 175 μ g 이상을 적재 하면 과도 한 효소 활성으로 인 한 명확한 밴드가 손실 될 수 있습니다. 2) 샘플의 복제는 OXPHOS 복합체의 젤 내 활동과 면역 분석의 병렬 측정을 가능 하 게 하기 위해 별도의 웰에 적재 되어야 합니다. CI, CII, 문명 및 CV에 대 한 IGA의 병렬 결정에는 최소 300 µ g이 필요 합니다. CI, CII, CII, 문명 및 CV의 병렬 면역 분석 분석이 최소 375 µ g이 필요 합니다. - Pipet 또는 진공을 사용 하 여 파란색 음극 버퍼를 제거 하 고, 300 mL Coomassie 무 블루 캐 소드 버퍼로 교체 하 고, 콜드 룸 (4°c)에서 하룻밤 동안 200 V에서 젤을 실행 합니다. 젤 내 활성 측정 또는 면역 조절에 대해 3 단계 또는 4 단계로 진행 합니다.
3. 복합체 I, II, IV 및 CV에 대 한 젤 내 활동
- 전기 영동이 끝나기 전에 표 6에 따라 젤 내 활동 버퍼를 준비 하 고 RT에서 어둠 속에 보관 하십시오. 3 개의 샘플 레인에 대해 젤 내 활성 완충 액 20 mL이 충분 합니다.
참고:이 CV-겔 활성 분석은 ATPsynthase의 역 활성을 기반으로 하며 (즉, ATP 가수분해) 겔에서 침전 되는 보조 인자로 칼슘을 사용 합니다. 칼슘은 다른 프로토콜에서 사용 되는 납 보다 덜 유해 하다. 더욱이,이 프로토콜의 사용은 겔 (23)의 사전 활성화/컨디셔닝을 필요로 하지 않는다. - 전기 영동을 멈추고 젤을 회수 하십시오. 필요한 경우 차선을 자르고 비닐 봉지에 젤 레인을 옮겨 (3 개의 면이 자르고 비닐 봉지를 책 처럼 열었습니다). 열 실러와 함께 3 면의 2를 밀봉.
참고: 실험 그룹 간에 SC 밴드의 구성을 비교 하려면 동일한 젤에서 동일한 샘플을 복제에 실행 하는 것이 좋습니다. 각각 다른 젤 내 활동 버퍼 (CI, IV, V)에서 복제를 배양 하는 차선을 절단 합니다. 분석 법의 특이성을 확인 하기 위해, 추가의 복제는 특정 호흡기 사슬 억제제의 존재 하에 젤 활동에서 실행 되도록 준비 될 수 있다. - 3 개의 실험 시료 (예: 3 웰)의 경우 20 mL의 젤 내 활동 완충 액을 넣고 거품을 제거 하 고 비닐 봉지의 4번째 면을 밀봉 합니다.
참고: 수행 되는 경우 네거티브 컨트롤 실험에 억제제를 추가 하십시오: 1 µ M; CII: 나트륨 말론 10 mM; CIII: Antimycin 8 µ M; 문명: KCN 0.6 mM; CV: Oligomycin 0.5 µ - 어둠 속에서 37 ° c에서 젤 레인을 배양 하 고 15 분 마다 확인 하십시오. 배양 시간은 단백질과 복합체의 양에 따라 달라진 다. CI는 문명 또는 CV 보다 더 빠르게 반응할 것입니다. 최적의 염색은 보통 CI의 경우 2 시간, 문명에는 4 시간, CII 및 CV의 경우 6 시간 후에 발생 합니다.
- 반응 정지를 위해 물에 젤 레인을 헹 구 고 CV에 대 한 CI, CII, 문명 또는 검은색 배경의 흰색 배경에 이미지를 바르 십시오.
참고: 젤은 몇 개월 동안 RT 또는 4°c에서 비닐 봉지에 보관할 수 있습니다.
4. 면역 세포
- 표 7에 따라 전송 버퍼를 준비 하 고, RT. Tbst를 준비 하 고 rt에 보관 하십시오.
- 전체 젤 또는 선택한 레인을 컨테이너에 배치 하 고 SDS (0.25% 최종 전송 버퍼)로 보충 된 전송 버퍼를 추가 합니다. 로커에 용기를 놓고 1 시간 동안 배양 하십시오.
- 절단 PVDF 멤브레인 (겔의 크기에 상응 하는 크기)을 2 분 동안 교 반 하에 20 ml의 메탄올로 교체 하 고 2 분간 교 반 하에서 20 mL의 이동 완충 액으로 대체 한다.
- 아래쪽에서 위쪽으로 전송 샌드위치를 준비 하 고 젤과 활성화 된 PVDF 멤브레인 사이에 거품이 없는지 확인 하십시오. 카세트/블랙 스폰지/종이/멤브레인/젤/종이/검은 색 스폰지/카세트의 투명 한 쪽. 카세트를 닫고 잠급니다.
- 전송 탱크에 배치 샌드위치를, 전극의 적색 면에 직면 샌드위치의 명확한 측면, 그리고 겔을 immerge 전송 버퍼를 붓는 다. 냉각 시스템을 이송 탱크에 연결 하 고 4°c에서 설정 합니다. 전원 공급 장치에 연결 하 고 40 mA로 설정 하 고 24 시간 동안 실행 합니다.
- 멤브레인을 검색 하 고, TBST에서 5% BSA에서 1 시간 동안 차단 하 고, 4°c에서 하룻밤 동안 TBST에서 5% BSA로 제조 된 일차 항 체 용액을 배양 하였다.
참고: 사용 된 항 체에 대해서는 표 8 을 참조 하십시오. - 각각 10 분간 TBST 3x에서 멤브레인을 헹 굽 니다.
- 상 온에서 2 시간 동안 TBST에서 5% BSA에서 제조 된 이차 항 체 용액에서 배양 된 멤브레인.
- 각각 10 분간 TBST 3x에서 멤브레인을 헹 굽 니다.
- 멤브레인 및 이미지에 화학 발광 솔루션을 추가 합니다.
5. 분석
- 인 겔 활성 분석 이미지 또는 면역 세포는 SCs 분석에 사용 될 수 있다. 밴드의 구성을 분석 하기 위해, 정렬 복제 및 각 주어진 밴드에 대해 긍정적으로 반응 하는 복합체를 확인 합니다.
- 복합체의 분포를 분석 하기 위해, 다양 한 초 분자 어셈블리에서, ImageJ에서 이미지를 열고 젤 분석 도구를 사용 합니다 (예를 들어 그림 5 참조).
- 직사각형 도구를 사용 하 여 차선을 선택 하 고 차선을 플롯 합니다.
- 선을 그려 각 관심 밴드의 곡선 아래 영역을 닫고 선택 도구를 사용 하 여 각 영역을 클릭 하 여 곡선 값 아래의 영역을 포함 하는 테이블을 생성 합니다.
- 복합체의 분포를 계산 하기 위해, 단량체에 대 한 각 밴드에 대 한 값을 보고 한다.
Representative Results
도 2 는 SCs의 추출에 필요한 적절 한 digitonin 양을 식별 하는 것을 목적으로 하는 digitonin 적정 실험의 결과를 보여준다. 이 양은 조직/세포 유형 및 샘플이 동결 되었는지 여부에 따라 달라질 것 이다. 이 실험을 위해, CIV-겔 활성은 신선한 마우스 간 미토 콘 드리 아 로부터 분리 된 SCs를 가시화 하기 위해 수행 되었다. 2/1에서 10/1 그램의 digitonin 단백질의 비율을 검사 하였다. 이 샘플에 대 한 최적의 digitonin 양은 단량체 성 CIV 및 고 분자량 SCs의 양호한 분해능을 제공 하므로 4g/g입니다. 낮은 비율에서, 밴드는 명확 하 고 전기 영동 하는 동안 얼룩으로 해결 하는 반면, digitonin의 높은 비율의 사용은 고 분자량 SC의 중단으로 이끌어 냅니다.
도 3 과 도 4 는 4g digitonin/g 단백질로 추출한 마우스 간 미토 콘 드리 아의 제조에 수행한 완전 한 실험의 결과를 보여준다. 단백질은 하이브리드 BN/CN 페이지, 표준 BN 페이지 또는 CN 페이지를 사용 하 여 분리 하였다. 세 개의 젤이 모두 동시에 주조 되었고, 동일한 샘플에 대 한 복제로 차선이 로드 되었습니다. 전기 영동을 거쳐 그림 3의 ci, CII, 문명 및 cv와 같은 젤 활동 측정에 개별 차선을 절단 하 고 처리 하였으며, 그림 4에는 ci, CII, CII, 문명 cv 등의 면역이 있습니다.
캐 소드 버퍼 (하이브리드 CN/BN 페이지) 또는 전기 영동을 통해 샘플 및 음극 완충 액에 순간적으로 CB를 추가 하는 것은 SC 대역의 이동성 및 분해능을 크게 향상 시키며 개별 호흡기 복합체 페이지를 참조 하십시오 (그림 3). 밴드는 CIV에 대 한 젤 내 활동 후 하이브리드 기법 또는 BN 페이지와 쉽게 구별할 수 있지만, CN 페이지에서 해결 한 동일한 샘플에서는 SCs 및 단량체 성 CIV 반응성 밴드를 식별할 수 없습니다.
도 3 및 도 4 는 oxphos 단량체 및 초 분자 어셈블리의 해상도 및 밴딩 패턴이 하이브리드 CN/BN 페이지 및 bn 페이지 사이에서 질적으로 필적 함을 보여준다. 그러나 주목할 만한 차이점이 존재 합니다. 첫째, OXPHOS 복합체의 전기 영동 이동성은 CB의 감소로 인해 하이브리드 CN/BN 페이지 조건 대 표준 BN 페이지를 사용 하 여 단백질을 분리할 때 약간 감소 합니다. 이러한 이동성 변화는 문명 단량체, CV 단량체 및 CI에 대해 더 크다 (도 3 및 도 4). 둘째, 파란색 배경은 BN 페이지 (그림 3, 왼쪽 차선)와 비교 하 여 하이브리드 CN/bn 페이지에서 더 낮습니다. 그 결과, BN 페이지 다음의 높은 배경 레벨은 CII에 대 한 인 겔 활성 염색을 완전히 마스크 하 고, CIV이 머의 활동과 관련 된 배경 잡음을 향상 시킨다 (도 3). 셋째, cv의 활성은 CV 촉매 활성을 방해 하는 것으로 알려져 있는 CB의 감소 된 양으로 인해 샘플이 BN 페이지 (그림 3)에 비해 하이브리드 CN/bn 페이지 조건에서 실행 될 때 더 높다. 26 CN/BN 페이지 또한 cv 다이 머와 관련 되는 총 cv 활성의 더 큰 비율로 도시 된 바와 같이 cv 초 분 자체 어셈블리의 더 나은 보존을 허용 한다 (도 3). 또한, CV 올리고 머는 BN 페이지 조건에서 완전히 해리 되는 반면 CN/BN 페이지에서 볼 있습니다. 흥미롭게도, cv 활성을 표시 하는 별개의 밴드는 샘플이 CN/BN-페이지에서 실행 될 때 CV 단량체와 디 머 사이 에서도 관찰 됩니다 (그림 2).
도 5 는 초 분자 어셈블리에서의 oxphos 복합체 분포의 대표적인 분석을 보여준다. 이 이미지는 4 가지 건강 한 마우스 간 미토 콘 드리 아 제제 로부터 얻어진 샘플의 겔 활성에 CI를 보여준다. 치밀도 분석은 CI 반응성 밴드의 곡선 하에서 면적을 측정 하 고 단량체 성의 C1 활성과 초 분 자체의 상대 분포를 제시 하는 것을 가능 하 게 한다 (1 iii,나는iii 2 IV 1III2IVn). 유사한 분석은 면역 세포 후에 수행 될 수 있다.
그림 1: 분석 워크플로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 신선한 쥐 간 미토 콘 드리 아에서 슈퍼 복합체를 추출 하는 Digitonin 적정. 이 예는 호흡기 슈퍼 복합체를 추출 하는 digitonin의 증가 금액으로 치료 된 한 동물에서 고립 된 마우스 간 미토 콘 드리 아의 알리 쿼 츠를 보여줍니다. 그런 다음 하이브리드 CN/BN 페이지에 의해 샘플을 해결 하 고, CIV의 젤 내 활동을 결정 하였다. 문명1: 복합 IV 단량체; 문명2: 복합 IV 디 머; SC: 슈퍼 콤플렉스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: 하이브리드 cn/bn 페이지, bn 페이지 또는 cn 페이지에 따라 OXPHOS 복합체의 젤 내 활동. 한 마우스 로부터 분리 된 간 미토 콘 드리 아는 호흡기 슈퍼 복합체를 추출 하기 위해 digitonin (4g/g 비 digotonin/단백질)로 처리 하였다. 이 샘플의 각은 다음 세 개의 별개의 젤에 여러 우물에 로드 하 고 CN/BN 페이지, BN 페이지 또는 CN 페이지에 제출 했다. 각 겔 내의 각각의 복제 차선은 이어서 절단 되 고 즉시 겔 활성 분석 (CI, CII, CIV 및 CV로 표지 됨)을 위해 사용 되었다. 한 레인은 Coomassie 파란색으로 배경 (레이블이 붙은 BG) 염색을 표시 하는 컨트롤로 사용 되었습니다. OXPHOS 복합체 및 초 분 자체는 표준 명명법을 사용 하 여 식별 되며, 각각의 OXPHOS 복합체의 분자 화학 량 론을 나타내는 지 수와 함께 표시 됩니다. Ciii에 대 한 인 겔 활성이 특정 실험에서 수행 되지 않았기 때문에 CIII 함유 초 분자 어셈블리의 위치는 면역 검출에 기초한 다는 점에 유의 해야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4: 하이브리드 CN/bn 페이지 또는 bn 페이지에 따라 OXPHOS 복합체의 면역 세포 분석. 도 3 에 기재 된 실험 으로부터 복제 된 범례는 단일 멤브레인 상에 서 전기 전사 되었다. 트랜스퍼 후에, 개별 차선을 절단 하 고 CI, CII, CII, 문명 및 CV를 인식 하는 특정 항 체와 함께 인큐베이션 하였다. OXPHOS 복합체 및 초 분 자체 어셈블리는 표준 명명법을 사용 하 여 식별 되며, 숫자를 나타내는 인덱스는 각 OXPHOS 복합체의 분자 화학 량 론이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 5: 단량체 성 및 초 분자 어셈블리에서의 CI 분포의 정량화. (A)-4 마리의 마우스 로부터 얻어진 간 미토 콘 드리 아 SC 추출 물의 하이브리드 CN/BN 페이지에 따라 결정 된 CI-겔 활성. (B) ci 단량체에 대응 하는 뚜렷한 피크를 나타내는 imagej의 겔 분석 도구를 사용 하 여 얻어진 치밀도 (i 1) 및 다양 한 ci 함유 초분자 복합체(i 1iii,나는 제 2 IV 1 나는 III2IVn). (C) C1 활성의 상대적인 분포의 정량화. 데이터는 4 마리의 생쥐의 평균과 SEM을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Digitonin/단백질 비율 (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| 추출 완충 액 (µ L)의 부피 | 400 | 300 | 200 | 100 |
| 10% 재고 digitonin (µ L) | 100 | 200 | 300 | 400 |
| 총 추출 버퍼 체적 (µ L) | 500 | 500 | 500 | 500 |
표 1: 다양 한 digitonin/단백질 비율을 사용 하 여 5 mg의 미토 콘 드리 아 단백질 로부터 SCs를 추출 하는 데 필요한 부피.
| 화합물 | 최종 농도 |
| EDTA, pH 7.5 | 1Mm |
| 헤 페 스 | 30mm |
| 칼륨 아세테이트 | 150 mM |
| 글리세롤 | 12 |
| 6-아미노 카프로 산 | 2Mm |
표 2: SC 추출 완충 액 (최종 농도). 최대 3 개월 동안 4°c에서 보관 하십시오.
| 화합물 | 최종 농도 |
| 3X 젤 버퍼: -20°c, pH 7.5에서 유지 | |
| 이미 다 졸/HCl pH-7.0 | 75 mM |
| 6-아미노 카프로 산 | 1.5 M |
| 아크릴 아 미드 버퍼: -20°c에서 유지 | |
| 아크릴 아 미드 | 99.5% |
| 비스 아크릴 아 미드 | 3 |
표 3: 젤 스톡 버퍼.
| 2 젤: | 4% 60 | 12% 60 | 스태킹 (4%) (25ml) |
| 3X 젤 버퍼 | 19.8 mL | 19.8 mL | 8.25 mL |
| 아크릴 아 미드 완충 액 | 4.8 mL | 14.4 mL | 2 mL |
| H2o | 35 mL | 13.1 mL | 14.6 mL |
| 글리세롤 | - | 12 mL | - |
| AP 10% | 360 μ l | 60 μ l | 150 μ l |
| TEMED | 24 μ l | 12 μ l | 10 μ l |
표 4:4%-12% 그라데이션 젤
| 화합물 | 최종 농도 |
| 양극 버퍼: 4°c, pH 7.5에서 유지 | |
| 이미 다 졸 | 25mm |
| 음극 완충 액: 4°c, pH 7.5에서 유지 | |
| 순도 | 50 mM |
| 이미 다 졸 | 7.5 mM |
| Coomassie 블루 (G250) 유무 | 0.022% |
표 5: 전기 영동 완충 액.
| 화합물 | 최종 농도 |
| 복합 I 활동 버퍼: 5mm에서 신선 하 게 준비 합니다. 트리 스-HCl pH 7.4 | |
| Nitrotetrazolium 블루 | 3mm |
| NADH | 14 mM |
| 복합체 II 활동 완충 액: 5mm에서 신선 하 게 준비 합니다. 트리 스-HCl pH 7.4 | |
| 숙 시 네이트 | 20mm |
| PMSF | 0.2 mM |
| Nitrotetrazolium 블루 | 3mm |
| 복합 IV 활성 완충 제: 50 mM Na 인산 염 pH 7.2에서 신선한 준비 | |
| 시 토 크롬 C | 0.05 mM |
| 산물이 | 2.3 mM |
| ATPsynthase 활동 완충 액: 물에서 신선 하 게 준비 하 고, 코로 pH를 8로 조정 합니다. | |
| 글리신 | 50 mM |
| MgCl2 | 5Mm |
| 헤 페 스 | 50 mM |
| CaCl2 | 30mm |
| Atp | 5Mm |
표 6: 겔 내 활성 분석 버퍼.
| 화합물 | 최종 농도 |
| 전송 버퍼 | |
| 트리 트리 베이스 | 25mm |
| 글리신 | 192 mM |
| Sds | 4 |
| 메탄올 | 20 |
| Tbst | |
| 트리 트리 베이스 | 20mm |
| Nacl | 137 mM |
| 트윈 20 | 0.1% |
표 7: 면역 조절 버퍼.
| 복잡 | Subunit | 복제 |
| 나 | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| Ii | SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| Iii | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| Iv | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | ATPB | 3D5 |
표 8: 호흡기 사슬 SC를 검출 하기 위해 면역 세포를 사용 하는 항 체. 회사 및 로트 번호에 대 한 자료 표 를 참조 하십시오.
Discussion
미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체는 그들의 생리 적 역할을 명료 하 게 연구 하 고 있으며, 수많은 인간 질병의 발병 기 전에 서 그들의 중요성, 또는 유전 적 미토 콘 드리 아 질환의 획득 여부는3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 측면을 고려해 야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 간 미토 콘 드리 아로 테스트 되었습니다, 마우스 골격 근육 미토 콘 드리 아 (결과 표시 되지 않음), 쥐 심장 미토 콘 드리 아 및 인간 섬유 아 세포 미토 콘 드리 아 (결과 표시 되지 않음), 하지만 확실히 고립의 다른 소스에 적응 될 수 있다 미토 콘 드리 아. 이 방법은 BN 및 CN 페이지 프로토콜의 다양 한 측면을 최적으로 결합 하 여 출판 된 프로토콜20,27,28에 비해 세제 및 음이온 성 화합물에 대 한 노출을 최소로 줄일 수 있습니다.
시료 전처리
샘플 준비는 SCs의 성공적인 분리를 위한 중요 한 단계를 나타냅니다. 완충 조성 물은 단백질 및 단백질 어셈블리의 적절 한 가용 화를 달성 하기 위해 신중 하 게 선택 되어야 하며, 가능한 한 많은 기능을 유지 하면서 및 구조적 무결성. 추출 완충 액의 이온 강도와 pH는 고려해 야 할 두 가지 중요 한 요소 이다. 너무 낮은 염 농도 (< 50 m K 아세테이트 또는 염화 나트륨)는 비 이온 성 세제의 존재 하에 단백질의 낮은 가용 화를 초래할 것이 고, 500 mM 이상의 염 농도는 단백질 적 층/응집을 촉진 하 고 CB의 침전 및 단백질29. 따라서 SCs는 거의 생리 적 이온 강도에서 완충 액을 사용 하 여 추출 되어야 합니다. PH에 관해서는, 가까운 생리 적 pH의 사용을 권장 합니다.
최적의 SC 추출을 위해서는 세제 유형 및 세제/단백질 비율이 중요 합니다. 기본 SCs의 최대 보존을 위해, digitonin가 바람직하다26. 본 프로토콜 및 기타 공개 된 방법에 도시 된바와 같이,도31,32,이 중성 세제는 다 수의 SC 어셈블리의 초 분자 조성 물을 보존 하 고,이 성체 및 올리고 머 구조 ATPsynthase (도 3 및 도 4). 효소 활동과 생리 적 단백질 상호 작용을 보존 하면서 최적의 가용 화를 가능 하 게 하는 조건을 확인 하기 위해서는 다양 한 양의 digitonin 관심 샘플을 적정 하는 것이 중요 합니다. 적정은 2~8g/g26사이의 비율로 수행 해야 합니다. 간, 골격 근 및 심장 미토 콘 드리 아에 대 한 최적의 결과는 각각 4, 5 및 6g digitonin/g 단백질로 얻어진 다. Digitonin는 트리톤 X-100으로 대체 될 수 있으며, 최적의 조건에서 digitonin2에서 관찰 되는 것과 유사한 마이그레이션 및 SC 구성을 초래 한다는 점에 유의 해야 합니다. 그러나이 세제는 세제/단백질 비율이 상대적으로 약간 증가 하기 때문에 (예: 1 ~ 1.5/g) SCs 어셈블리2의 완전 한 해리를 초래할 수 있으므로 주의 해 서 사용 해야 합니다 .이는 실험적 불일치를 초래할 수 있습니다. 추출 후 샘플은 전통적 CN (20페이지)을 제외 하 고 젤에 적용 될 때 단백질을 충전 하기 위해 coomassie 청색으로 일반적으로 보충 됩니다. Coomassie 청색 및 불안정 한 단백질의 잠재적인 해리에 대 한 단백질 노출을 최소화 하기 위해, 샘플은이 프로토콜에서 Coomassie 청색으로 보충 되지 않습니다.
전기
모두 CN 페이지 및 십억-페이지는 미토 콘 드리 아 OXPHOS 복합체를 연구 하는 데 사용 되었습니다., 그들 각각의 뚜렷한 장점과 한계를가지고. CN-페이지 (주로 세제와 같은 효과를 가진 CB의 부재)에서 사용 되는 온화한 조건은 ATP 신 타제 in 젤 활성을 더 잘 보존 할 수 있으며 고 분자량 SCs 및 ATP에서 불안정 한 단백질의 해리를 제한 합니다 신 타제 어셈블리26. 그러나, 단백질 추출 물 및 전기 영동 완충 액에서 음이온 성 염료 CB의 부재는 단백질이 젤 (26) 내의 단백질의 전기 영동 이동성을 감소 시키는 그들의 본질적인 전 하 및 등전기 점을 기준으로 이동 하는 원인이 된다. 또한, CB가 없는 경우, 불충분 한 음 전 하를 갖는 단백질은 응집 하는 경향이 있으므로, 겔 (20)에서 단백질 복합체의 분해능이 감소 한다 (26). 이러한 한계를 회피 하기 위해, 소위 고 분해능 CN-페이지는 Wittig 및 Schragger20에 의해 개발 되었다. 이 프로토콜에서 나트륨 deoxycholate (DOC) 및 다양 한 온화한 비 이온 성 세제 (DDM, 트리톤 X100)가 음극 완충 액에 첨가 되어 멤브레인 단백질의 가용 화를 유지 하 고 단백질에 음의 전 하 시프트를 부과 하 여 상당한 개선을 초래 합니다. 해상도20.
본 하이브리드 CN/BN 프로토콜의 특징은 이러한 세제 없이 비교 가능한 분해능에 도달할 수 있다는 것입니다. 전기 영동의 시작에서 캐 소드 버퍼에 CB를 순간적으로 첨가 하는 것은 단백질 응집을 제한 하 고 겔에서 이동성을 향상 시키기에 충분 하다 (도 3 및 도 4). 결과적으로,이 하이브리드 기술은 별개의 SC 어셈블리의 탁월한 분해능을 가능 하 게 하며 세제에 대 한 노출이 매우 낮습니다. 낮은 양의 CB의 존재는 또한 CV 활성의 향상 된 보존,이 성체 및 올리고 머 CV 어셈블리의 개선 된 보존 (그림 3 과 Wittig 및 Schägger 200526)을 허용 하 고 파란색 배경 노이즈의 감소 특히 CII와 문명에 대 한 젤 활동의 정량화를 방해 합니다 (그림 2). 더욱이, 단백질 추출 물에서 CB의 부재는 SCs 내에서 불안정 한 단백질 상호 작용의 중단을 제한 합니다. 예를 들어, synthasome 33 를 형성 하는 ANT와 함께 ATP 신 타제의 물리적 협회 또는 PTP 개방 34 을 조절 하는 사이클로 필 인-D는 CB의 부재에서 더 잘 볼 수 있습니다. 전기 영동 중에 CB에 순간적으로 노출 되는 것은 따라서 SCs 내에서 새로운 단백질 상호 작용을 공개 하는 데 유용할 수 있습니다. 전반적으로,이 하이브리드 CN/BN 페이지 프로토콜은 분석을 통해 젤 활동 측정에서 정밀 하 고 빠른 결합을 가능 하 게 합니다. SCs의 고급 분석을 위한 2D 전기 영동, 면역 검출 및/또는 프로 테오 믹스를 포함 하는 기술. SCs에 대 한 관심이 증가 하면서 연구 횟수가 증가 하면 네이티브 페이지를 위한 작은 10 x 10cm 젤이 사용 된다는 점에 유의 해야 합니다. 이 접근법은 풍부한 SC 어셈블리에서의 총 변화를 식별 하기에 충분할 수 있지만, 작은 겔의 낮은 분리 용량은 미묘한 재배열을 해결 하거나 단백질 분해 분석을 위해 별개의 밴드를 절단 하는 것으로 제한 될 가능성이 있습니다. 더욱이, 더 작은 젤을 사용 하는 몇몇 연구 결과는 respirasome가 ATPsynthase이 량 체와 같은 크기로 이주 한다는 것을 보고 하 고, 그들22를 해리 하기 어렵게 합니다. 따라서 큰 젤의 사용을 선호 해야 합니다.
Disclosures
없음
Acknowledgments
저자는 기술 지원을 위해 제 나로 시에 게 감사 하 고,이 방법을 개발 하는 동안 도움이 되는 토론을 위해 미르 일 크 파초 박사와 데이비드 패튼 박사를 부탁 드립니다. 이 작품은 캐나다 건강 연구 기관 (CIHR) 및 국가 과학 및 공학 위원회 (NSERC)에 의해 자금을 지원 했다. AC는 프레드릭 반 팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (CIHR)의 박사 학위를 받은 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
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