Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att extrahera, lösa och identifiera mitokondriella superkomplex som minimerar exponeringen för rengörings medel och Coomassie Blue. Detta protokoll erbjuder en optimal balans mellan upplösning, och bevarande av enzym aktiviteter, samtidigt minimera risken för att förlora labila protein-proteininteraktioner.
Abstract
Komplex av den oxidativa fosforylering maskiner bildar Supramolekylär protein arrangemang som heter superkomplex (SCs), som tros ge strukturella och funktionella fördelar för mitokondrier. SCs har identifierats i många arter, från jäst till däggdjur, och ett ökande antal studier rapporterar störningar i deras organisation i genetiska och förvärvade mänskliga sjukdomar. Som ett resultat av detta är ett ökande antal laboratorier intresserade av att analysera SCs, vilket kan vara metodologiskt utmanande. I den här artikeln presenteras ett optimerat protokoll som kombinerar fördelarna med metoderna blå-och rensa inbyggda sidor för att lösa och analysera SCs på ett tids effektivt sätt. Med denna hybrid CN/BN-PAGE metod, mitokondriella SCs extraheras med optimala mängder av den milda rengörings medel digitonin utsätts kortfattat för den anjoniska färg ämnet Coomassie Blue (CB) i början av elektrofores, utan exponering för andra rengörings medel. Denna korta exponering för CB gör det möjligt att separera och lösa SCs så effektivt som med traditionella BN-PAGE metoder, samtidigt som man undviker de negativa effekterna av höga CB nivåer på in-gel aktivitet analyser, och labila protein-protein interaktioner inom SCs. Med detta protokoll är det således möjligt att kombinera precisa och snabba mätningar av gel aktivitet med analytiska tekniker som involverar 2D-elektrofores, immuno-detektion och/eller Proteomik för avancerad analys av SCs.
Introduction
Mitokondrier producera energi genom oxidativ fosforylering, där respiratoriska komplex i-II-III-IV oxidera substrat och överföra elektroner till syre, genererar en gradient som tillåter fosforylering av ADP av ATP syntas (CV). Under de senaste åren har omfattande studier visat att respiratoriska kedje komplex inte enbart införlivas på ett linjärt sätt i det inre mitokondriella membranet, utan också är organiserade i superkomplex (SCs) arrangemang1,2. I mitokondrierna hos däggdjur finns SCs i varierande stökiometrier: CI/CIII2/civ1-4 (som heter respirasome, och som kan NADH: O2 oxidoreduktion in vitro)2, CI/CIII2och CIII2 /Civ1-23,4. Dessutom är respiratoriska komplex fördelas under olika förhållanden mellan deras fri form och SCs arrangemang. Det uppskattas därför att 85% – 100% av CI, 55% – 65% av CIII och 15% – 25% av CIV finns i SCs4. Dessa Supramolekylär strukturer tros minska ROS produktion, stabilisera eller bistå vid montering av enskilda komplex, reglera respiratorisk kedje aktivitet, och förhindra protein aggregation i proteinet rika inre mitokondrie membran5 ,6,7,8. Deras ombyggnad förmåga vid variationer i efter frågan på energi och deras betydelse i patogenesen av sjukdomar unders öks i flera Labs3,7,9,10, 11 för att , 12 av de , 13 det , 14. studier har visat att patologiska förändringar i SCs-sammansättningen finns i en mängd olika sjukdomar, inklusive, men inte begränsat till, genetisk defekt i kardiolipin syntes15, hjärt svikt16, ischemia-reperfusion17, diabetes12, och åldrande18.
Native elektrofores och immunodetection används ofta i SCs studier för att lösa oxphos komplex Kvartära arrangemang2,19,20,21. Native elektrofores kan ytterligare kombineras med specifika i gel verksamhet analyser eller 2D-SDS sida för att möjliggöra exakt molekylär bestämning av de olika SCs församlingar1,19. Förmågan att studera SCs är kritiskt beroende av extraktionsförhållanden, inklusive typ och koncentration av använt disk medel, jonisk styrka och pH, samt på elektrofores förhållanden, som omfattar buffertsammansättning, förekomst av CB, gel storlek och akrylamid i procent2.
Protokoll och SCs band upplösning varierar kraftigt bland papper, göra jämförelser mellan studier svårt och anpassning av metoder utmanande22. Därför föreslår detta dokument ett robust och optimalt protokoll för att extrahera SCs från isolerade mitokondrier av olika källor med den nonjoniska rengörings medel digitonin, och att lösa hög molekyl vikt SCs band. Den optimerade rengörings medels koncentrationen, sammansättningen av extraktionsbufferten och frånvaron av Coomassie Blue i prov preparering minimerar störningen av protein komplex. Detta protokoll (se figur 1 för en översikt) kombinerar CN-Page och bn-Page för optimala SCs-sammansättningar upplösning på stor gel, och är kompatibel med in-gel aktivitet analyser möjliggör bättre visualisering av reaktiva band, tillsammans med användning av immunodetection för en detaljerad analys SCs arrangemang och sammansättning.
Protocol
1. SC extraktion
- Bered 100 mL extraktionsbuffert (se tabell 2) genom att lösa upp EDTA i vatten. Öka pH med KOH tills helt upplöst, sedan justera pH till 7,5 med HCl. Tillsätt resterande komponenter till lösningen, komplett till slutlig volym med vatten, och hålla på is. I ett rör, lös digitonin i extraktionsbuffert för att göra en 10% lager lösning, Vortex grundligt tills helt upplöst, och hålla på is.
Anmärkning: extraktionsbuffert kan förberedas i förväg och förvaras vid 4 ° c i högst 2 månader. Om vågiga band börjar visas längst ner på gelen, betyder det extraktion buffert är för gammal. När du förbereder 10% digitonin lösning, förbereda en lager volym räkning 500 μL per prov om du använder musen lever mitokondrier. Digitonin löslighet varierar beroende på härkomst och produkt parti (se material tabell). - Mitokondrier isolerad från djur vävnad (mus hjärta, muskler, lever, rått hjärta) eller celler (Human fibroblast) med standard protokoll23,24,25 kan användas för utvinning av SCs. När mitokondrier erhålls, kvantifiera protein innehåll med hjälp av bicinchoninic syra assay kit enligt tillverkarens rekommendationer. Komplettera isolerade mitokondrier med proteaser och foshataser hämmare i detta steg som behövs.
Obs: SCs kan extraheras på antingen färska eller tinade mitokondrier. Det rekommenderas att extrahera SCs från alla prover på samma gång, för att försäkra att de behandlas med samma partier av lösningar och under samma villkor. - Baserat på den erhållna mitokondriella protein koncentrationen, och den slutliga digitonin/protein kvoten önskas, beräkna volymen av beståndet digitonin lösning och extraktion buffert som krävs enligt tabell 1. För SC-extraktion, tillsätt 1 μL extraktionsbuffert (tabell 2) som innehåller digitonin för varje 10 μg mitokondriellt protein. Digitonin/protein förhållandet kan variera från 2 till 8 g/g. En digitonin-titrering bör alltid utföras för varje ny typ av prov som används ( se figur 2 för ett exempel).
- Pelletmitokondrier, i ett 1,5 mL-rör genom centrifugering vid 16 000 x g under 10 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten och återsuspendera den mitokondriella pelleten i den beräknade volymen av iskall extraktionsbuffert som innehåller digitonin. Placera rören på en mini-rör rotator och inkubera i 30 min vid 4 ° c vid en medelhög rotations hastighet. Se till att proverna blir ordentligt blandade.
- Centrifugera proverna vid 20 400 x g för 45 min vid 4 ° c för att ta bort insolubilized fragment.
- Överför supernatanten i en ny tub på is och kvantifiera proteiner. Denna fraktion representerar den respiratoriska superkomplex extrakt. Om elektrofores inte utförs samma dag, förvara proverna vid-80 ° c.
Anmärkning: 1) Undvik att frysa/Tina cykler av extraktet, eftersom detta stör högre molekyl ära arrangemang av SCs. alikvot provet före den första frysningen/tining cykeln om det behövs. 2) för att utföra ett standard BN-PAGE experiment, bör CB läggas till SCs-extrakt i det här steget. CB ska läggas till i ett 1g/8g-förhållande i förhållande till mängden använt rengörings medel.
2. gradient gel gjutning och elektrofores
- Förbered 3x gradient buffert och akrylamid lager för att göra gradienten gel, alikvot och lagra vid-20 ° c (se tabell 3).
- Förbered anoden och katodebuffertar och Behåll vid 4 ° c (se tabell 5).
- Öppna gjutkammaren och placera en yttre glas platta (20 cm x 22 cm) i kammaren. Placera en uppsättning distanser (1,5 mm) med hjälp av justerings kortet så att de sitter stadigt mot kammarens sida och hörn. Placera en inre glas skiva (20 cm x 20 cm) ovanpå distansen (detta bildar gelen Sandwich), och sätta en plast separering ark ovanpå glas plattan.
- Upprepa steg 2,3 tills önskat antal geler som ska kastas uppnås. För detta protokoll, 4 geler är gjutna. Den gjutning kammar system vi använder (se tabell över material) tillåter gjutning av högst 10 geler i taget. Ta upp det återstående utrymmet i kammaren genom att först lägga till så många akryl block som behövs, och sedan glas plåtar om det behövs.
Anmärkning: montage måste vara tätt förseglad; det ska inte finnas något mellanrum mellan gelmackor i kammaren. - Placera en remsa av parafilm i spåret innan du placerar packningen ordentligt i packningen skåran. Placera tätnings plattan på kammaren och dra åt alla 6 skruvarna. Ställ gjutkammaren.
- Placera gradient tidigare på en rör platta med en magnetisk omrörare i "ljus" blandnings kammaren. Anslut slangen av gjutning kammaren till gradienten fd, säkra slangen i kassetten av den peristaltiska pumpen, och se till att kranen av gradienten fd är stängd.
- För att kasta 4 geler, Förbered 60 mL 4% och 60 mL 12% gel lösningar (se tabell 4) i en Erlenmeyer kolv och snurra ordentligt för att blanda. Häll 60 mL 4% gel lösning i "lätt" blandnings kammaren, och 60 mL 12% i den "tunga" reservoar kammare av gradienten fd. Ställ rör hastighet av rör plattan vid 350 RPM. Öppna kranen och slå på pumpen vid 35 RPM.
- När ljus fraktionen är lägre än den tunga fraktionen, pausa pumpen och öppna ventilen stammen mellan "ljus" och "tunga" reservoarer, låt fraktioner volym jämvikt, och starta om pumpen.
Obs: det är viktigt att inga bubblor in i systemet och fastna mellan glas plattor. Om detta händer, ångra montage, tvätta och gör om. - När gradienten gel är helt hälls, stoppa pumpen, och overlay vatten (ca 1 mL) på varje gel smörgås för att förhindra torkning av gelen. Låt polymerisera för 2 h.
- Förbered 25 mL stapling gel i Erlenmeyer och snurra för att blanda ordentligt. Ta bort vatten och sätt in 15 bra kammar i varje gel smörgås. Häll stapling gel och låt polymerisera för 2 h.
Obs: geler kan gjutas och förvaras vid 4 ° c i 1 vecka. - Sätt i gelen i sandwichklämmor och ta bort kam. Med den korta glas plattan vänd nedåt, sätt i gel Sandwich i kylkärnan. Upprepa på andra sidan, och placera kärnan i elektrofores tanken.
- Häll 300 mL blå Katodbuffert i elektrofores behållarens inre kammare. Häll 2 L Anodbuffert i den yttre kammaren av elektrofores tank.
Anmärkning: elektroden måste vara nedsänkt i katodbuffert, vilket kräver cirka 300 mL. - Lasta mellan 75 μg och 175 μg protein per brunn. Kör gel på 150 V för 1,5 h (eller tills proverna har kommit in i gradienten gel) i kallt rum (4 ° c).
Anmärkning 1:1) minst 75 μg per brunn krävs för god upplösning av in-gel aktivitets band. Lastning över 175 μg protein kommer att leda till en förlust av tydliga band på grund av överdriven enzym aktivitet. 2) replikat av provet bör lastas i separata brunnar för att möjliggöra parallell bestämning av in-gel aktiviteter och immunoblot analys av OXPHOS komplex. Parallell bestämning av IGA för CI, CII, CIV och CV kräver minst 300 μg. parallell immunoblot analys av CI, CII, CII, CIV och CV kräver minst 375 μg. - Ta bort blå katod buffert med Pipettera eller vakuum, Ersätt med 300 mL Coomassie blå-fri Katodbuffert, och kör gel på 200 V över natten (16-20 h) i kallt rum (4 ° c). Gå vidare till steg 3 eller 4 för in-gel aktivitet mätning eller Immunoblotting.
3. in-gel aktivitet för komplex i, II, IV och CV
- Före slutet av elektrofores, Förbered i-gel aktivitet buffertar enligt tabell 6, och hålla i MÖRKRET vid RT. 20 ml i-gel aktivitetbuffert är tillräcklig för 3 prov kör fält.
Anmärkning: detta CV i-gel aktivitet analysen är baserad på den omvända aktiviteten av ATPsynthase (dvs., ATP hydrolys), och använder kalcium som en co-faktor, som fälls ut i gelen. Kalcium är mindre skadligt än det bly som används i andra protokoll. Dessutom kräver användningen av detta protokoll inte en pre-aktivering/konditionering av gel23. - Sluta elektrofores och hämta gel. Klipp köer, om nödvändigt, och överföra gel kör fält i plast påsar (3 sidor klippa, och plast påse öppnas som en bok). Tätning 2 av de 3 sidorna med en värme för segling.
Anmärkning: för att jämföra sammansättningen av SC band mellan experimentella grupper, rekommenderas att köra samma prover i replikat på samma gel. Skär köer för att Inkubera varje replikat i olika i-gel aktivitet buffertar (CI, II, IV, V). För att bekräfta specificiteten hos analyserna kan ytterligare replikat förberedas för att köras i gel aktiviteter i närvaro av specifika luftvägs hämmare. - För 3 experimentella prover (dvs. 3 brunnar), tillsätt 20 mL i-gel aktivitet buffert, ta bort bubblor, och tätning 4: e sidan av plast påse.
Anmärkning: tillsätt inhibitorer i negativa kontroll experiment om de utförs: CI: Rotenone 1 μM; CII: Natriummalonat 10 mM; CIII: Antimycin-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycin 0,5 μM. - Inkubera gelbanor vid 37 ° c i mörker och kontrol lera var 15 min. inkubations tiden varierar beroende på mängden protein och komplex. CI kommer att reagera snabbare än CIV eller CV. optimal färgning sker vanligt vis efter 2 h för CI, 4 h för CIV och 6 h för CII och CV.
- Skölj gel kör fält i vatten för att stoppa reaktionen, och bilden på en vit bakgrund för CI, CII, CIV, eller svart bakgrund för CV.
Obs: geler kan förvaras i plast påsar vid RT eller 4 ° c i flera månader.
4. Immunoblotting
- Förbered överföringbufferten enligt tabell 7och Behåll vid RT. Förbered tbst och Behåll vid RT.
- Placera hela gelen, eller utvalda köer, i en behållare och Lägg överföringbufferten kompletteras med SDS (0,25% final i överföringbufferten). Placera behållaren på rocker och inkubera i 1 h.
- Skär PVDF membran (storlek motsvarar storleken på gelen) och aktivera i 20 mL metanol under agitation i 2 min. Ersätt med 20 mL överföringskub och placera under omrörning i 2 min.
- Förbered överföring smörgås, från botten till toppen, att se till att det inte finns någon bubbla mellan gel och aktive ras PVDF membran: klar sida av kassett/svart svamp/blotting papper/membran/gel/blotting papper/svart svamp/svart sida av kassett. Stäng och lås kassetten.
- Placera Transfer smörgås i överförings tanken, med fri sida av smörgås mot den röda sidan av elektroden, och häll överföringbufferten för att Immerge gelen. Anslut kyl systemet till överförings tanken och Ställ in vid 4 ° c. Anslut till strömförsörjningen, Ställ in på 40 mA, och kör i 24 h.
- Hämta membran, block för 1 h i 5% BSA i TBST, och inkubera i primär anti kropps lösning beredd i 5% BSA i TBST över natten vid 4 ° c.
Se tabell 8 för anti kroppar som används. - Skölj membran i TBST 3x för 10 min vardera.
- Inkubera membran i sekundära anti kropps lösningar som bereds i 5% BSA i TBST för 2 h vid rums temperatur.
- Skölj membran i TBST 3x för 10 min vardera.
- Tillsätt kemiluminescent lösning till membran och bild.
5. analys av
- I-gel aktivitet assay bilder eller Immunoblots kan användas för att analysera SCs. För att analysera sammansättningen av band, justera replikat och validera vilka komplexa reagerade positivt för varje givet band.
- För att analysera fördelningen av komplex, i olika Supramolekylär församlingar, öppna bilder i imagej och använda gel analys verktyget (se figur 5 för ett exempel).
- Välj kör fält med rektangelverktyget och rita filer.
- Rita linjer för att stänga området under kurvan för varje band av intresse och klicka på varje område med staven verktyget för att generera en tabell som innehåller området under kurvan värden.
- För att beräkna fördelningen av komplexet, rapportera värdena för varje band i förhållande till monomeren.
Representative Results
Figur 2 visar resultaten från ett digitonin titreringsexperiment som syftar till att identifiera den mängd digitonin som krävs för extrahering av SCs. Detta belopp kommer att variera beroende på vävnad/cell typ och om provet var fryst eller inte. För detta experiment, en CIV i-gel aktivitet utfördes för att visualisera SCs isolerad från färska mus levern mitokondrier. Nyckeltal från 2/1 till 10/1 g digitonin/g protein testades. Den optimala mängden digitonin för detta prov är 4 g/g, eftersom det ger en bra upplösning av monomer CIV, och hög molekyl vikt SCs. Vid ett lägre förhållande, är banden inte tydliga och lösa in i ett utstryk under elektrofores, medan användningen av högre förhållandet mellan digitonin leder till störningar av hög molekyl vikt SC.
Figur 3 och figur 4 visar resultaten av ett komplett experiment utfört på en beredning av mus lever mitokondrier extraheras med 4 g digitonin/g protein. Proteiner separerades med hjälp av hybrid BN/CN-PAGE, standard BN-sida, eller CN-PAGE. Alla tre geler var gjutna på samma gång och köer lastades med replikat av samma prov. Efter elektrofores, var enskilda köer skärs och bearbetas för i gel aktivitet mätning (CI, CII, CIV och CV på figur 3) och Immunoblotting (CI, CII, CIII, civ, CV på bild 4).
Tillsats av CB antingen tillfälligt i katodbuffert (dvs. hybrid CN/BN-sida) eller i prov och katodbuffert under hela elektrofores (dvs. BN-sida), avsevärt förbättrar rörligheten och upplösningen av SC band, och enskilda respiratoriska komplex jämfört med CN-PAGE (figur 3). Band är lätt att särskilja med hybrid teknik eller BN-sida efter in-gel aktivitet för CIV, medan i samma prov matchas av CN-PAGE, SCs och monomeriska CIV reaktiva band inte kan identifieras.
Figur 3 och figur 4 visar att upplösningen och bandnings mönstret för oxphos monomerer och Supramolekylära sammansättningar är kvalitativt jämförbart mellan hybrid CN/BN-PAGE och bn-Page. Det finns dock anmärknings värda skillnader. För det första är den elektroforetiska rörligheten för OXPHOS komplex något reducerad när proteiner separeras med hjälp av hybrid CN/BN-PAGE villkor vs standard bn-sida, på grund av minskad mängd CB. Denna rörlighets förskjutning är större för CIV-monomerer, följt av CV-monomerer och CI (figur 3 och figur 4). För det andra är den blå bakgrunden lägre i hybrid CN/BN-sidan jämfört med BN-PAGE (figur 3, vänster kör fält). Som ett resultat, hög bakgrunds nivåer efter bn-Page helt masker i-gel aktivitet färgning för CII, och förbättrar bakgrunds brus i samband med aktiviteten hos Civ dimerer (figur 3). För det tredje är aktiviteten hos CV högre när proverna körs under hybrid-CN/BN-PAGE-förhållanden jämfört med BN-PAGE (figur 3), på grund av den reducerade mängden CB, som är känt för att störa den CV-katalytiska aktiviteten. 26 CN/bn-Page möjliggör också bättre bevarande av CV-Supramolekylär sammansättningar, vilket framgår av en större andel av den totala CV-aktiviteten som associeras med CV-dimerer (figur 3). Dessutom är CV-oligomerer synliga under CN/BN-PAGE, medan de är helt separerade under BN-sidans förhållanden. Intressanta, distinkta band som visar CV-aktivitet observeras också mellan CV monomerer och dimers, när proverna körs under CN/BN-sida (figur 2).
Figur 5 visar en representativ analys av OXPHOS komplex distribution i Supramolekylära församlingar. Bilden visar CI i gel aktivitet av prover som erhållits från 4 olika friska mus levern mitokondrier preparat. Densitometri analys gör det möjligt att mäta arean under kurvan för CI-reaktiva band, och att presentera den relativa fördelningen av C1 aktivitet i monomer (I1) och Supramolekylära former (i1III2, i1III2IV 1, i1III2IVn). Liknande analys kan utföras efter immunoblot.
Figur 1: analys arbets flöde. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Digitonin titrering för att extrahera superkomplex från färska mus lever mitokondrier. Detta exempel visar Ali kvoter av mus lever mitokondrier, isolerade från ett djur som behandlades med ökande mängder digitonin att extrahera respiratoriska superkomplex. Proverna löstes sedan genom hybrid CN/BN PAGE, och i-gel aktivitet av CIV bestämdes. CIV1: komplexa IV-monomerer; CIV2: komplexa IV-dimers; SC: superkomplex. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: i-gel aktivitet av OXPHOS komplex efter hybrid CN/bn-Page, bn-sida eller CN-Page. Lever mitokondrier isolerade från en mus behandlades med digitonin (4 g/g förhållandet digotonin/protein) för att extrahera respiratoriska superkomplex. Ali kvoter av detta prov lastades sedan på flera brunnar i tre olika geler och överlämnades till CN/BN-PAGE, BN-sida eller CN-PAGE. Varje replikat Lane inom varje gel klipptes sedan och omedelbart används för in-gel aktivitet analyser (märkt CI, CII, CIV och CV). Ett kör fält användes som kontroll för att Visa bakgrund (märkt BG) färgning med Coomassie Blue. OXPHOS-komplex och Supramolekylära sammansättningar identifieras med hjälp av standard nomenklaturen, med siffror i index som anger molekyl stökiometri för varje OXPHOS-komplex. Det bör noteras att positionen för CIII-innehållande Supramolekylära sammansättningar är baserad på immunodetection eftersom in-gel aktivitet för CIII inte utfördes i detta särskilda experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: immunoblot-analys av OXPHOS-komplex efter hybrid-CN/bn-Page eller bn-sida. Replikat från de experiment som beskrivs i figur 3 legenden var Electro-överförs på ett enda membran. Efter överföringen klipptes enskilda köer och inkuberades med specifika anti kroppar som erkände CI, CII, CIII, CIV och CV. OXPHOS-komplex och Supramolekylära sammansättningar identifieras med hjälp av standard nomenklaturen, med siffror i index som anger molekyl ära stökiometri av varje OXPHOS-komplex. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kvantifiering av CI-distributionen i monomer och Supramolekylär sammansättningar. (A) CI in-gel-aktivitet fastställd efter hybrid CN/bn-sida i lever mitokondrie-extrakt från 4 möss. Bdensitogram erhållna med hjälp av imagej ' s gel analys verktyg som visar distinkta toppar motsvarande CI monomerer (i1) och olika CI-innehållande Supramolekylära komplex (i1III2, i1III2IV1 och i1III2IVn). Ckvantifiering av den relativa fördelningen av C1-aktiviteten. Datan föreställer medelvärde och SEM av de 4 mössen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Digitonin/protein-förhållande (g/g) | 2 g/g | 4 g/g | 6 g/g | 8 g/g |
| Volym för extraktionsbuffert (μL) | 400 | 300 | 200 | 100 |
| Volym på 10% digitonin (μL) | 100 | 200 | 300 | 400 |
| Total extraktionsbuffertvolym (μL) | 500 | 500 | 500 | 500 |
Tabell 1: volymer som krävs för att extrahera SCs från 5 mg mitokondriella proteiner med hjälp av olika digitonin/protein nyckeltal.
| Sammansatta | Slutlig koncentration |
| EDTA, pH 7,5 | med 1 mM |
| HEPES | på 30 mM |
| Kaliumacetat | 150 mM |
| Glycerol | 12 |
| 6-aminokapronsyra | 2 mM |
Tabell 2: SC extraktionsbuffert (slutliga koncentrationer). Förvaras vid 4 ° c i högst 3 månader.
| Sammansatta | Slutlig koncentration |
| 3X gel buffert: Alikvot och förvaras vid-20 ° c, pH 7,5 | |
| Imidazol/HCl pH-7,0 | 75 mM |
| 6-aminokapronsyra | 1,5 M |
| Akrylamidbuffert: Alikvot och förvaras vid-20 ° c | |
| Akrylamid | 99,5% av |
| BIS-akrylamid | 3 |
Tabell 3: buffertar för gellager.
| För 2 geler: | 4% (60 mL) | 12% (60 mL) | Stapling (4%) (25 mL) |
| 3X gel buffert | 19,8-100 mL | 19,8-100 mL | 8,25-100 mL |
| Akrylamidbuffert | 4,8-100 mL | 14,4-100 mL | till 2 mL |
| H2O | 35-100 mL | 13,1-100 mL | 14,6-100 mL |
| Glycerol | - | till 12 mL | - |
| APS 10% | 360 μL | 60 μL | 150 μL |
| TEMED | 24 μL | 12 μL | 10 μL |
Tabell 4:4% – 12% lutning gel.
| Sammansatta | Slutlig koncentration |
| Anodbuffert: förvaras vid 4 ° c, pH 7,5 | |
| Imidazol | på 25 mM |
| Katodbuffert: förvaras vid 4 ° c, pH 7,5 | |
| Tricine | 50 mM |
| Imidazol | 7,5 mM |
| Med eller utan Coomassie Blue (G250) | 0,022% av |
Tabell 5: elektrofores buffertar.
| Sammansatta | Slutlig koncentration |
| Komplex I aktivitet buffert: Förbered färskt i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Nitrotetrazolium blå | med 3 mM |
| Nadh | 14 mM |
| Komplex II aktivitet buffert: Förbered färskt i 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 | |
| Succinat | på 20 mM |
| Av PMSF | 0,2 mM |
| Nitrotetrazolium blå | med 3 mM |
| Komplex IV aktivitet buffert: Förbered färska i 50 mM na-fosfat pH 7,2 | |
| Cytokrom C | 0,05 mM |
| Diaminobenzidin | 2,3 mM |
| ATPsynthase aktivitet buffert: förbereda färskt i vatten, justera pH till 8 med KOH | |
| Glycin | 50 mM |
| MgCl2 | till 5 mM |
| HEPES | 50 mM |
| CaCl2 | på 30 mM |
| Atp | till 5 mM |
Tabell 6: buffertar för bestämning av gel aktivitet.
| Sammansatta | Slutlig koncentration |
| Överföringsbuffert | |
| Tris bas | på 25 mM |
| Glycin | 192 mM |
| Sds | 4 |
| Metanol | 20 |
| Mer från TBST | |
| Tris bas | på 20 mM |
| Nacl | 137 mM |
| Interpolering 20 | 0,1% av |
Tabell 7: Immunoblotting buffertar.
| Komplexa | Subunit | Klon |
| I | NDUFA9 | 20C11B11B11 |
| Ii | Mer från SDHA | 2E3GC12FB2AE2 |
| Iii | UQCRC2 | 13G12AF12BB11 |
| Iv | COX4 | 1D6E1A8 |
| V | För ATPB | 3D5 |
Tabell 8: anti kroppar som används för Immunoblotting för att detektera andnings kedjan SC. Se material tabell för företag och parti nummer.
Discussion
Mitokondriella superkomplex är aktivt studeras för att belysa deras fysiologiska roll, och deras betydelse i patogenesen av många mänskliga sjukdomar, oavsett om de förvärvas eller genetiska mitokondriella sjukdomar3,7 , 9 för att , 10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14. för att uppnå tillförlitliga resultat måste flera aspekter beaktas. Detta protokoll har testats med mus levern mitokondrier, mus Skelett muskel mitokondrier (resultat visas inte), råtta hjärta mitokondrier, och mänskliga fibroblast mitokondrier (resultat visas inte), men kan säkert anpassas till andra källor av isolerade Mitokondrier. Metoden kombinerar på ett optimalt sätt olika aspekter av bn och CN-Page protokoll, som gör det möjligt att minska exponeringen för tvätt-och anjoniska föreningar till ett minimum jämfört med offentliggjorda protokollen20,27,28.
Prov beredning
Prov beredning utgör ett avgörande steg för en lyckad separation av SCs. Buffertsammansättningen bör väljas noggrant för att uppnå korrekt upplösning av proteiner och proteiner, samtidigt som den bevarar så mycket som möjligt av deras funktionella och strukturell integritet. Jonisk styrka och pH i extraktionsbufferten är två viktiga faktorer att beakta. Saltkoncentrationer som är för låga (< 50 mM K-acetat eller NaCl) kommer att resultera i dålig solubilisering av proteiner i närvaro av icke-joniska rengörings medel, medan saltkoncentrationer över 500 mM kommer att främja protein stapling/agg regering, och utfällning av CB och proteiner29. SCs bör därför extraheras med buffertar vid nära fysiologisk jonisk styrka. När det gäller pH, rekommenderas användning av ett nära Fysiologiskt pH.
Rengörings medels typ och rengörings medels/protein förhållande är också avgörande för optimal SC-extraktion. För maximal bevarande av infödda SCs, är digitonin föredras26. Som framgår av detta protokoll och andra publicerade metoder23,30,31,32, detta milda rengörings medel bevarar Supramolekylära sammansättningen av flera SC församlingar, och dimeriskt och oligomeriska strukturen hos Atpsyntas (figur 3 och figur 4). Titrering av proverna av intresse med olika mängder digitonin är avgörande för att identifiera de förhållanden som möjliggör optimal solubilisering, samtidigt som enzym aktivitet och fysiologiska proteininteraktioner. Titrering ska utföras med nyckeltal som varierar mellan 2 och 8 g/g26. Optimala resultat för lever, skelett mus kula tur och kardiella mitokondrier erhålls med 4, 5 och 6 g digitonin/g protein. Det bör noteras att digitonin kan ersättas av Triton X-100, som under optimala förhållanden resulterar i liknande migration och SC sammansättning som de som observerats med digitonin2. Detta rengörings medel bör dock användas med försiktighet, eftersom relativt liten ökning av tvätt medels/protein kvoten (t. ex. från 1 till 1,5 g/g) kan resultera i en fullständig dissociation av SCs-sammansättningar2, vilket kan resultera i experimentella inkonsekvenser. Efter extraktion, är prover traditionellt kompletteras med Coomassie blå för att ge proteiner en laddning när den appliceras på gelen, med undantag för traditionella CN-sidan20,26. För att minimera protein exponeringen till Coomassie blått och potentiell dissociation av labila proteiner, är tar prov inte kompletterat med Coomassie blått i detta protokoll.
Elektrofores
Både CN-PAGE och BN-PAGE har använts för att studera mitokondriella OXPHOS-komplex, var och en av dem har distinkta fördelar och begränsningar. De mildare villkor som används under CN-PAGE (främst avsaknaden av CB, som har en tvätt medel-liknande effekt), möjliggör bättre bevarande av ATP syntas i-gel aktivitet, och begränsar dissociation av labila proteiner i hög molekyl vikt SCs och ATP syntas sammanställningar26. Men avsaknaden av den anjoniska färg ämnet CB i protein extraktet och elektrofores buffertar orsakar proteiner att migrera baserat på deras inneboende laddning och isoelektriska punkt, vilket minskar den elektrofores rörlighet av proteiner inom gel26. Dessutom, i avsaknad av CB, proteiner med otillräcklig negativ laddning tenderar att aggregera, vilket minskar upplösningen av protein komplex i gel20,26. För att kringgå dessa begränsningar har den så kallade högupplösta CN-sidan utvecklats av Wittig och Schragger20. I detta protokoll tillsätts natriumdeoxycholat (DOC) och olika milda icke-joniska rengörings medel (DDM, Triton X100) till katodbufferten för att hålla membran proteiner lösta och införa en negativ laddnings förskjutning på proteiner, vilket resulterar i en avsevärd förbättring resolution20.
Kännetecknande för det nuvarande hybrid CN/BN-protokollet är att en jämförbar lösning kan uppnås utan dessa rengörings medel. Momentan tillsats av CB till katoden buffert i början av elektrofores är tillräckligt för att begränsa protein aggregation och öka rörligheten i gelen (figur 3 och figur 4). Som ett resultat, denna hybrid teknik möjliggör utmärkt upplösning av distinkta SC församlingar och mycket låg eller ingen exponering för rengörings medel. Närvaron av låga mängder CB möjliggör också bättre bevarande av CV-aktivitet, förbättrat bevarande av dimeriskt och oligomeriska CV-sammansättningar (figur 3 och Wittig och schägger 200526), och en reduktion av det blå bakgrunds ljudet som kan kvantifieringen av i gel aktiviteter, särskilt för CII och CIV (figur 2). Avsaknaden av CB i protein extraktet begränsar dessutom störningen av labila proteininteraktioner inom SCs. Till exempel läkar undersökning anslutningen av ATP-synthasen med ANT för att bilda synthasomen 33 eller med Cyclophilin-D för att reglera PTP öppningen 34 ses bättre i frånvaro av CB. Momentan exponering för CB under elektrofores endast kan därför vara användbart för att avslöja nya proteininteraktioner inom SCs. sammantaget gör detta hybrid CN/BN-PAGE-protokoll det möjligt att kombinera exakt och snabbt i mätningar av gel aktivitet med analytiska tekniker som involverar 2D-elektrofores, immuno-detektion och/eller Proteomik för avancerad analys av SCs. Det bör noteras att med det växande intresset för SCs, ett ökande antal studier använder små 10 x 10 cm geler för infödda PAGE. Även om detta tillvägagångs sätt kan vara tillräckligt för att identifiera brutto förändringar i överflöd SC församlingar, den lägre separations kapaciteten hos små geler är sannolikt begränsad till lösa subtila omställningar eller att skära distinkta band för proteomiska analys. Dessutom har flera studier med mindre geler rapporterat att respirasome migrerar i samma storlek som ATPsynthase dimer, vilket gör det svårt att separera dem22. Därför bör användningen av stora geler gynnas.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jenna Rossi för tekniskt bistånd, och Dr Mireille Khacho, Dr David Patten och Dr Ujval Anil Kumar för hjälpsam diskussion samtidigt utveckla denna metod. Detta arbete finansierades av kanadensiska institut för hälso forskning (CIHR) och den nationella vetenskaps-och ingenjörs rådet i Kanada (NSERC). AC är en mottagare av doktors priset-Frederick Banting och Charles bästa Kanada Graduate stipendier (CIHR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
| 6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Sigma | A3553 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
| Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
| Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
| Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
| Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
| COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
| Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
| Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
| Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
| Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
| Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
| PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
| PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
| PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
| PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
| PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
| SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
| Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
| Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |
References
- Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
- Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
- Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
- Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
- Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
- Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
- Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Methods in Cell Biology. 80, Academic Press. 3-44 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582 (2009).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Beutner, G., Porter, G. A. Jr Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).
- Von Hagen, J. Proteomics Sample Preperation. , Wiley InterScience. 485 (2008).
- Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).
