Summary
Det är ofta nödvändigt att bedöma den potentiella cytotoxiciteten hos en uppsättning av föreningar på odlade celler. Här beskriver vi en strategi för att tillförlitligt skärm för giftiga föreningar i en 96-väl format.
Abstract
Cytotoxicitet är en kritisk parameter som måste kvantifieras när man studerar läkemedel som kan ha terapeutiska fördelar. På grund av detta, många Drug screening analyser utnyttja cytotoxicitet som en av de kritiska egenskaper som ska profileras för enskilda föreningar. Celler i kulturen är en användbar modell för att bedöma cytotoxicitet innan du fortsätter att följa upp lovande blyföreningar i mer kostsamma och arbetsintensiva djurmodeller. Vi beskriver en strategi för att identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en tdTomato uttrycker mänskliga neurala stamceller (NSC) linje. Strategin använder två kompletterande analyser för att bedöma cell nummer. En analys fungerar via minskningen av 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) till formazan som en proxy för cell nummer och den andra direkt räknar tdTomato uttrycker NSCs. De två analyserna kan utföras samtidigt i ett enda experiment och är inte arbetsintensiva, snabba och billiga. Den strategi som beskrivs i denna demonstration testade 57 föreningar i en förberedande primär skärm för toxicitet i en 96-bra plåtformat. Tre av träffarna karakteriserades ytterligare i en sex-punkts dos svar med samma assay set-up som den primära skärmen. Förutom att ge utmärkt bekräftelse för toxicitet, jämförelse av resultaten från de två analyserna kan vara effektiva i att identifiera föreningar som påverkar andra aspekter av celltillväxt.
Introduction
En av de viktigaste egenskaperna som måste bestämmas för en kemisk förening som har terapeutisk potential är dess toxicitet för djurceller. Denna egenskap kommer att avgöra om ett läkemedel är en bra kandidat för mer omfattande studie. I de flesta fall, föreningar med minimal toxicitet söks men det finns situationer där en förening med kapacitet att döda specifika celltyper är av intresse, e.g., anti-tumorigenic läkemedel. Även om hela djur är de bästa modellsystem för att bestämma systemisk toxicitet, är kostnaden och arbetskraft som är oöverkomliga när mer än ett fåtal föreningar måste testas. Som sådan däggdjurs-cellkultur används allmänt som det effektivaste alternativet1,2. Små till medelstora genomströmning drog skärmar är en viktig modalitet genom vilken toxicitet kan bedömas i cellkulturen. Dessa skärmar kan användas för att förhöra kommenterade bibliotek som riktar sig till enskilda signaleringsvägar. Det allmänna formatet på en sådan skärm är att initialt testa alla föreningar i biblioteket vid en engångsdos (vanligtvis 10 μM) i en undersökande primär toxicitet skärm, och sedan utföra en djupgående sekundär dos svar skärm för att fullt ut karakterisera toxiciteten profil för träffar från den primära skärmen. Metoderna för att genomföra denna strategi kommer att beskrivas här och ge ett snabbt, effektivt och billigt sätt att identifiera och karakterisera giftiga föreningar.
Flera metoder har utvecklats för att bedöma cytotoxicitet av små föreningar och nanomaterial i däggdjursceller3,4. Det bör noteras att vissa material kan interagera med analysen ger vilseledande resultat, och sådana interaktioner bör testas när karakterisera träffar från toxicitet skärmar4. Cytotoxicitetsanalyser inkluderar trypan Blue utslagning5, laktatdehydrogenas (LDH) Release assay6, Alamar Blue assay7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, och ATP-analysen9. Alla dessa analyser mäter olika aspekter av cellmetabolism som kan fungera som en proxy för cell nummer. Medan alla erbjuder fördelar, tetrazolium saltbaserade analyser såsom 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), 2, 3-bis (2-metoxi-4-Nitro-5-sulfofeny)-2H-tetrazolium-5-karboxyanilidinnersalt (XTT)-1, och 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-bensen disulfonat (WST-1)10,11 ger god noggrannhet och enkel användning till låg kostnad. MTT, som kommer att användas i denna demonstration, reduceras till en olöslig formazan av en mitokondriell reduktas och hastigheten av denna omvandling korrelerar starkt med cell nummer. Denna analys har rutinmässigt utnyttjas i både en liten skala och för screening bibliotek med upp till 2 000 föreningar12. Direkt räkning av celler med en märkt markör erbjuder en annan metod för att bedöma mobiltelefonnumret, och till skillnad från MTT-analysen kan det ge ytterligare information om dynamiken i cellulära tillväxt. Flera allmänt tillgängliga algoritmer finns tillgängliga för att utföra automatiserade cell räknings analyser och det finns även egenutvecklade algoritmer som ingår i mjukvarupaket för bildläsare13,14. I denna metodbeskrivning, en mänsklig neurala stamcells (NSC) linje som har genetiskt redigerats till konstitutivt uttrycka tdTomato15 kommer att fungera som en test linje för att jämföra cellulära lönsamhet resultat mellan en MTT-analys och en automatiserad cellräkning analys på en skärm som bedömer toxiciteten hos 57 testsubstanser. Även om det primära målet med denna strategi var att identifiera och karakterisera giftiga föreningar, det har den ytterligare fördelen att potentiellt identifiera tillväxthämmande och tillväxtförbättrande föreningar och därmed ger en effektiv metod för att identifiera läkemedel som kan modulera cellulära tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NSC-kulturen
Anmärkning: manipulering av en mänsklig NSC-linje kommer att beskrivas nedan, men alla cellinjer kan användas för detta protokoll. Allt cellkultur arbete utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Coat en 96-brunn tallrik med basalmembran/extracellulär matrix (ECM).
- Tina alikvot av ECM (tabell över material), som kommer att underlätta fastsättning av NSC, på is. Späd ut ECM till lämplig koncentration (vanligtvis 1:100) i 10 mL bas medium (tabell över material) och tillsätt 50 μl per brunn till var och en av 60 invändiga brunnar av en 96-brunn tallrik (figur 1). Använd endast interiören 60 brunnar för att undvika artefakter som kan resultera från kant effekten16.
- Låt plattan sitta vid rumstemperatur eller i en cell odlings inkubator (37 ° c, 5% CO2) i minst 30 min.
- Separera och platta neurala stamceller.
Anmärkning: celler för användning i denna metod bör odlas till minst 80% sammanflödet i en T75 kolv.- Kultur celler i en T75 kolv i en cellkultur inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 i NSC medium som består av bas medium, B27, icke-essentiella aminosyror, 2 mm glutamin, och 10 ng/ml grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (FGFb eller FGF2).
- Ta bort celler från inkubatorn när de når 80% sammanflödet och aspirera utanför NSC medium. Tillsätt en lämplig mängd cell dissociationsreagens (3 mL för en T75 kolv; Tabell över material) Inkubera i 5 minuter i inkubatorn.
- Efter inkubering tillsätts 7 mL NSC-medium i T75-kolven och pipetteras kraftigt för att säkerställa att alla celler lossnar. Överför den separerade cell lösningen till en 15 mL tub och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten från röret och Omsuspendera cellerna i 10 mL NSC-medium och räkna celler.
- Justera koncentrationen av celler till 200 000 celler/mL med NSC-medium. Se till att cellerna är helt återsuspenderade för homogen plätering i brunnar.
- Platta 100 μL av cell blandningen (20 000 celler) i de 60 innerbrunnarna av 3 96-brunnar och plattor som har belagts enligt beskrivningen i avsnitt 1,1. Använd sex av de åtta spåren i en 8-kanals flerkanalspipitor till plattceller kolumn för kolumn.
- Tillsätt 100 μL bas medium eller NSC-medium till alla brunnar utan celler för att minimera potentiell avdunstning från de yttersta brunnarna.
- Under ett cellkultur Mikroskop, inspektera visuellt minst 10 brunnar på var och en av 3 96-brunnsplattor för att bekräfta att cellerna är seedade vid den förväntade densiteten. Fortsätt inte med analysen om cellerna är klädd i en densitet för glesa eller täta.
2. behandling av celler med föreningar
Obs: det hemgjorda biblioteket testas i denna demonstration innehåller föreningar som modulera vinglösa/integrerade (WNT), retinoinsyra, omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β), och Sonic Hedgehog signalering vägar samt en mängd olika tyrosinkinaser.
-
Explorativ primär skärm för toxicitet/cell nummer
- Aliquot 50 − 100 mL av upp till 57 test föreningar (kompletterande tabell 1) med en koncentration av 10 mM i 100% dimetylsulfoxid (DMSO) in i interiören 60 brunnar av en U-bottnad, V-bottnat eller rundbottnad 96-brunn platta med tre DMSO brunnar som kontroll (se Bild 1 för en plattkarta). Detta kommer att fungera som befälhavaren sammansatta plattan med 25 μL av förening som kan frysas och tinade flera gånger.
Obs: platta bottnade plattor bör inte användas eftersom det blir svårare att aspirera små mängder av föreningar från dem med en bänk pipettor. - Ta bort cell odlings plåtar från inkubator 16-24 h efter delning enligt beskrivningen i avsnitt 1 och aspirera av NSC medium kolumn-för-kolonn med en 8-kanals multi-well multikanalspipettor med endast sex av de åtta multi-well slots. Tillsätt 95 μL färskt NSC-medium till cellerna i var och en av de tre replikplattorna och placera plattorna tillbaka i inkubatorn tills steg 2.1.4 nedan är slutförd.
- Tillsätt 49 μL NSC-medium till var och en av invändiga 60 brunnar av en tom U-bottnad, V-bottnad eller rundbottnad 96-brunnsplattan med en 8-kanals multi-well pipettor. Unseal befälhavaren sammansatta plattan och använda en bänk pipetten eller motsvarande instrument för att Pipettera 1 μL av substansen från befälhavaren plattan i 49 μL av NSC medium i varje interiör 60 brunnar.
- Blanda den utspädda substansen 3x med bänkskiva pipettor.
- Ta bort 3 96-brunnen plattor av NSCs från inkubator, Pipettera 15 μL av varje utspädd förening med bänk pipetten och fördela en 5 μL alikvot av substansen i var och en av de tre plattorna.
Anmärkning: denna 1:20 utspädning av förening i cellerna i kombination med den ursprungliga 1:50 utspädning i steg 2.1.3 ger en 1:1000 utspädning så att den slutliga koncentrationen av föreningarna på NSCs kommer att vara 10 μM med en DMSO koncentration av 0,1% och den slutliga koncentrationen av DMSO-kontrollerna kommer att vara 0,1%. - Inkubera celler med substans för 72 h och fortsätt med cytotoxicitetsanalyser. Kortare intervaller kan användas, men en 72-timmars inkubationstid bör maximera de potentiella cytotoxiska effekterna av testade föreningar.
- Aliquot 50 − 100 mL av upp till 57 test föreningar (kompletterande tabell 1) med en koncentration av 10 mM i 100% dimetylsulfoxid (DMSO) in i interiören 60 brunnar av en U-bottnad, V-bottnat eller rundbottnad 96-brunn platta med tre DMSO brunnar som kontroll (se Bild 1 för en plattkarta). Detta kommer att fungera som befälhavaren sammansatta plattan med 25 μL av förening som kan frysas och tinade flera gånger.
-
Dosresponsanalys
Obs: set-up för 96-brunn som används för dos-responsen visas i figur 2.- Använd kolumn 2 för sex DMSO kontroll replikat och test tripletter upp till tre olika föreningar vid två gånger seriella utspädningar vid sex doser som börjar med en hög dos av 10 μm.
- Späd ut 4 μL av DMSO eller testsubstansen i DMSO till 196 μL av NSC-mediet i ett 1,5 mL microcentrifugerör. Tillsätt 25 μl av DMSO till kolonnen med brunnar från B2-G2 och 50 μl av test föreningarna till raden från B3-B11 med de tre testade föreningarna i 10 mm tripletter i raderna B3-B5, B6-B8 och B9-B11.
- Pipettera 25 μL av NSC-mediet till de återstående tomma kolumnerna i den invändiga delen av plattan 96-well. Ta bort 25 μL av substansen från brunnar B3-B11 med en flerkanalspipitor, tillsätt i brunnarna C3-C11 och blanda minst fem gånger. Upprepa processen för de återstående raderna för att generera tre gånger vid tvåfaldigt spädningar för sammanlagt sex doser för varje föreningar.
- Generera NSCs för dosresponsen exakt enligt beskrivningen för den primära skärmen i avsnitt 2,1. Föreningarna för dosresponsen tillsätts och inkuberas på cellerna exakt enligt beskrivningen i steg 2.1.5 och 2.1.6.
Anmärkning: tre biologiska replikat av dosresponsanalysen utförs genom att man upprepar analysen på NSCs vid olika passager på separata dagar.
3. bildceller på en Plattläsare
- Efter celler har inkuberats med föreningar för den tilldelade tiden, bildceller på en Plattläsare för att bestämma pre-behandling cell nummer per brunn.
Anmärkning: instruktioner för bildceller är läsarspecifika men följer i allmänhet en liknande strategi. Anvisningarna nedan gäller för den läsare som används i denna demonstration (tabell över material). - Ta bort plattan från inkubatorn och placera den i plattläsaren. Öppna Imager-programvaran för att ställa in protokoll och experimentera filer för studien. Gå till Imager manuellt läge i Aktivitetshanteraren och klicka på Capture Now....
- Välj 96-väl skylt som fartygstyp, Välj 10X för förstoring, och rött fluorescerande protein (RFP) 531 och 593 för avbildning tdTomato. Välj en brunn och klicka sedan på autofokus för att fokusera bilden, och Auto exponera för korrekt exponeringstid. Justera fokus och exponering manuellt om det behövs.
- När korrekt fokus och exponering har erhållits, klicka på kameraikonen för att fånga bilden. Klicka sedan på process/ANALZYE bilden ovan för att fortsätta bygga protokollet och välj fliken analys.
- Klicka på cell analys i Lägg till analys steg till höger om bilden och klicka på Start. Bilden visar markerade celler för att indikera varje enskild cell. Val av alternativ kan klickas för att ändra parametrar för att bättre välja celler baserat på fluorescenströskeln eller cellstorleken. Om kameran räknar cellerna korrekt och klicka sedan på Lägg till steg längst ned på skärmen.
- Klicka på ikonen längst upp på skärmen för att Skapa experiment från bilduppsättning, som kommer att öppna ett fönster med experimentet. När öppen, klicka på procedur under fliken protokoll och i det nya fönstret som öppnas Välj läsa, sedan i det nya fönstret Klicka full plate att välja endast 60 brunnar som innehåller cellerna (B2... G11). Klicka på OK för att spara ändringarna och klicka sedan på OK i procedur fönstret.
- Plattan kan nu avbildas med detta protokoll och den experimentella filen kan sparas. Klicka på uppspelningsikonen för att köra plattan. När den första plattan har avbildats, bild de andra två plattorna. När bilden har slutförts hämtar du data för cell räkningen till ett kalkylblad för analys. Ta alla bilder med 10X förstoring.
4. Terminal MTT cytotoxicitetstest
Obs: börja MTT-analysen inom två timmar efter avslutad tdTomato Imaging.
- Gör en 5 mg/mL MTT stamlösning genom att väga ut 25 mg MTT och rekyl den i 5 mL NSC medium. Virvel lösningen tills det inte finns några synliga utfällningar av MTT, som kan ta flera minuter.
- Ta bort cell odlings plattorna från inkubatorn och aspirera på cell odlingsmediet. Späd MTT 1:10 i cellodlingsmedium och tillsätt 100 μL MTT till varje brunn av celler.
- Inkubera cellerna vid 37 ° c i 2 timmar. En lila fällate bör vara synlig ungefär i proportion till antalet celler i brunnen. Antingen aspirera MTT-lösningen på plattorna eller vänd plattan snabbt för att snärta lösningen ur plattan.
- Tillsätt 50 μL av 100% DMSO till varje brunn och skaka plattorna i rumstemperatur under 10 min vid 400 rpm. Läs absorbansen för varje brunn vid 595 nm i en Plattläsare och exportera data till ett kalkylblad för analys.
5. analys av data
- Utför en analys av tdTomato cell räkningar och absorbanserna med lämplig programvara (kommersiella kalkylblad, R). Beräkna medelvärden för absorbans eller cellräkning av de tre DMSO replikat på varje tallrik för normalisering ändamål, sedan dividera värdet för antalet celler eller absorbanserna för varje brunn på plattan med detta genomsnitt och konvertera till en procentsats. Detta ger normaliserade cellantal eller absorbans i förhållande till DMSO kontroll för varje tallrik.
- Beräkna medelvärdet av normaliserade antal eller absorbans och standardavvikelse för replikbrunnar på de tre plattorna.
Anmärkning: på denna punkt bör det finnas fyra olika uppsättningar av normaliserade värden: en för varje plattor och ett medelvärde för de tre replikatorplattorna. - Var konservativ och Använd ett normaliserat värde vid eller under 25% för genomsnittet i de tre replikplattorna för att klassificera en förening som giftig. Dessutom, eftersom endast en enda behandling per förening utförs på varje platta, endast etikett föreningar som faller under denna tröskel på alla tre replikat plattor som giftiga. Undersök fluorescerande bilder av alla föreningar som denna analys filtrerar som giftigt för att visuellt bekräfta toxicitet.
Anmärkning: identifieringen av föreningar med en tillväxthämmande eller tillväxtförstärkande effekt är svårare att bedöma i en undersökande analys av denna typ på grund av avsaknaden av replikat på varje tallrik. Emellertid, följande är ett snabbt sätt att identifiera föreningar som antingen kan bromsa eller förbättra cellulära tillväxt. - Beräkna standardavvikelsen för de tre replikerar DMSO-kontrollerna på varje platta och filtrera sedan efter alla föreningar som har medelvärden med minst två standardavvikelser över eller under DMSO-kontrollen. Föreningar som faller ur detta filter på var och en av de tre plattorna kan motivera ytterligare utredning.
- Använd samma analys strategi för dosresponsen som den primära toxicitetsskärmen. Beräkna medelvärden för DMSO-kontrollerna för varje biologisk replikation och Använd dessa värden för att normalisera procent levande celler eller procent absorbanserna för varje kombination av sammansatta/doser. Beräkna medel och standardfel av medel för alla sammansatta/doskombinationer för de tre biologiska replikat.
- Omvandla koncentrationen till dess log värde, generera en dos responskurva för stocken av koncentration kontra normaliserad lönsamhet, och passa kurvan med en icke-linjär regressionsanalys (analys kan utföras i R eller olika kommersiella statistiska paket). Beräkna den dödliga dosen 50 (eller tekniskt i detta fall den livskraftiga dosen 50) eller koncentration av förening som resulterar i 50% toxicitet från ekvationen för denna kurva. Många mjukvarupaket kommer automatiskt att beräkna denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den automatiserade cell räknings data identifierade elva föreningar med mindre än 25% lönsamhet när normaliserade till DMSO kontroll medan MTT data identifierade dessa samma föreningar plus två ytterligare sådana (tabell 1 och tabell 2, skuggad röd). De två föreningar som befunnits vara giftiga endast i MTT-analysen (Wells F3 och G10) hade 31% och 39%, respektive, antalet tdTomato-positiva celler som kontroll och rangordning var de följande två giftigaste föreningarna i detta bibliotek efter de som bedöms vara giftiga. Standardavvikelse värdena för dessa två brunnar tydde inte på att det fanns en avvikare bland de tre plattorna som snedde genomsnitten, och vid granskningen av siffrorna för var och en av de tre replikplattorna föll varken substansen under tröskelvärdet på 25% på någon av plattorna (data visas inte). Representativa bilder av tdTomato fluorescens visas från flera brunnar i figur 3. Undersökning av bilder av de två brunnarna för toxicitet mellan MTT-och cell räknings analysen visade att föreningarna i F3 (figur 3B) och G10 (figur 3C) var båda giftiga, även om de i en av de tre replikerplattorna Det fanns några kvarvarande levande celler i väl G10 (data visas inte). Det verkar som om MTT-analysen i detta fall var bättre på att göra mål för cytotoxicitet, eftersom den Imager ' s cell Counting algoritm av misstag räknar döda/döende celler.
MTT-analysen är utformad för bestämning av toxicitet, men eftersom ett bibliotek kan innehålla föreningar som förstärker och hämmar celltillväxt skulle det vara informativt att bedöma hur väl analysen kvantifierar både de potentiella tillväxthämmande och proliferativa effekterna av testade föreningar. För att göra detta användes ett filter där föreningar klassificerades som tillväxthämning om deras normaliserade medelvärde absorbanserna eller cellantal var större än 25% och mindre än två standardavvikelser under kontroll hjälpmedlet på var och en av de tre replikplattorna (skuggade gul i tabell 1 och tabell 2). Elva föreningar uppfyllde detta kriterium för cell räknings analysen och endast två för MTT-analysen med endast en (E10) överlappning mellan de två analyserna, även om två av de elva för cell räknings analysen var de som tidigare nämnts vara giftiga i MTT-analysen (F3 , G10).
Föreningar vars normaliserade medel var två standardavvikelser över kontroll hjälpmedlet på var och en av de tre replikplattorna klassificerades som tillväxtfrämjande (skuggad grön i tabell 1 och tabell 2). Endast en förening passar detta kriterium för varje analys och föreningen överlappade inte mellan analyserna. Ytterligare undersökning av bilder av brunnar med avvikelser mellan MTT och cellantal analyser indikerade att i vissa fall brunnar där MTT överskattade cell antalet i förhållande till tdTomato analysen cellerna verkade vara större (figur 3C) , medan de brunnar där MTT underskattade antalet celler i förhållande till tdTomato verkade vara mindre (figur 3D). Sammanfattnings, tdTomato analysen klassificeras elva föreningar som giftiga, elva som tillväxthämmande, och en som tillväxt öka med 34 har ingen märkbar effekt på celltillväxt (tabell 1). MTT-analysen klassificerade tretton föreningar som giftiga, två som tillväxthämmande, och en som tillväxtförbättrande med 41 har ingen märkbar effekt på celltillväxt (tabell 2).
En sex-punkts dos Response assay utfördes på tre av de föreningar som identifierats som giftiga. Dessa tre föreningar var STAT3-hämmare WP1066 (B5) och stattic (E4) och epidermal tillväxtfaktorreceptor hämmare tyrphostin 9 (E11). Doserna var successiva tvåfaldigt spädningar med början vid en maximal koncentration av 10 μM och gå till en minsta koncentration av 312,5 nM. Grafen av stocken av koncentration kontra normaliserad procentandel av livskraftiga celler för både cellräkning och MTT analyser för en av dessa föreningar (WP1066) visas i figur 4. Kurvan är relativt platt utan toxicitet för de fyra lägsta koncentrationerna, sjunker snabbt vid dosen på 5 μM och sjunker till nästan full toxicitet vid 10 μM. Den dödliga dosen 50 (LD50) beräknades som 4,4 μm för tdTomato-analysen och 6,0 ΜM för MTT-analysen. Värdena för tdTomato och MTT LD50 för de andra två föreningarna var 3,4 μm respektive 4,7 μm för statiska och 0,8 μm respektive 1,6 μm för tryphostin 9.
Figur 1 : Plattkarta för huvud sammansatta plattan som används i den primära toxicitetsskärmen. Alla ytterbrunnar är skuggade i grått, vilket indikerar att de innehöll media utan celler. DMSO-kontroller (100%) är märkta med fetstil i Wells B2, D6 och G11. Alla brunnar märkta CMPD innehöll unika test föreningar vid 10 mM koncentration i 100% DMSO. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Plattkarta för den sammansatta plattan som används i dosresponsanalysen. Alla ytterbrunnar är skuggade i grått, vilket indikerar att de endast innehöll media utan celler. DMSO-kontrollerna var inhysta i kolumn 2. Alla kombinationer av sammansatta/doser anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Tdtomato fluorescerande bilder av utvalda brunnar 72 timmar efter behandling. (A) väl B2: DMSO-kontroll, (B) väl F3: cell räknings data föreslog ingen toxicitet utan MTT-data gjorde, (C) väl E6: överskattat cellantal i MTT i förhållande till Tdtomato antal, (D) väl G6 underskattat cellantal i MTT i förhållande till tdTomato. Alla bilder togs vid 10X förstoring med ett RFP-filter med 531/593 nm våglängd för excitation/emission. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kurva för log koncentration kontra lönsamhet procent DMSO för föreningen i brunn B5. Punkterna på kurvan representerar de genomsnittliga normaliserade livskraftiga cellerna vid sex doser ± standardfel av medelvärdet för tre biologiska replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: medel för tdTomato-cellräkningar normaliserade till procentuell DMSO-kontroll för tre replikerplattor ± standardavvikelse. Väl skuggning indikerar följande: röda, giftiga föreningar; gul, potentiellt tillväxthämmande; grön, potentiellt tillväxtförbättrande. Ingen skuggning indikerar att föreningar inte verkar påverka celltillväxt.
Tabell 2: medel för MTT-absorbans normaliserade till procentuell DMSO-kontroll för tre replikerplattor ± standardavvikelse. Väl skuggning indikerar följande: röda, giftiga föreningar; gul, potentiellt tillväxthämmande; grön, potentiellt tillväxtförbättrande. Ingen skuggning indikerar att föreningar inte verkar påverka celltillväxt.
| Väl | Sammansatta | Anteckningar |
| B2 | Dmso | Negativ kontroll |
| C2 | Camp | Proteinkinas en aktivator |
| D2 | FRACTALKINE | Chemokine |
| E2 | LDN212854 | Ben Morphogenetic Protein (BMP) receptor hämmare |
| F2 | AG370 | Trombocythämmande tillväxtfaktorreceptor (PDGFR) kinashämmare |
| G2 | DAPT | Gamma-secretase hämmare; neuronala differentiering positiv kontroll |
| B3 | AY9944 | 7-dehydrocholestrol reduktashämmare; Hedgehog väg inhibitor |
| C3 | STA-21 | Signal givare och aktivator för transkription 3 (STAT3)-hämmare |
| D3 | GM-CSF | Granulkocyte-makrofagkolonistimulerande faktor; Cytokin |
| E3 | TNP470 | Metionin aminipeptidas-2-hämmare |
| F3 | Bio | Glykogen syntas Kinas-3 hämmare; WNT Pathway aktivare |
| G3 | CNTF | Ciliär neurotrofiska faktorn; neuropeptid |
| B4 | SANT | Utjämnade receptor antagonist; Hedgehog väg inhibitor |
| C4 | AG825 | ERBB2-hämmare |
| D4 | M-CSF | Makrofagkolonistimulerande faktor; Cytokin |
| E4 | STATTIC | Signal givare och aktivator för transkription 3 (STAT3)-hämmare |
| F4 | SC79 | AKT (proteinkinas B) aktivator |
| G4 | DMH1 | Ben Morphogenetic Protein (BMP) receptor hämmare |
| B5 | WP1066 | Signal givare och aktivator för transkription 3 (STAT3)-hämmare |
| C5 | Insulin | |
| D5 | IL-3 | Interleukin-3; Cytokin |
| E5 | AG494 | Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) hämmare |
| F5 | LY294002 | Fosfoinosotid 3-kinashämmare |
| G5 | IGF2 | insulin tillväxtfaktor-2 |
| B6 | Sag | Utjämnade agonist; igelkotten Pathway Activator |
| C6 | AG370 | Trombocytderivat tillväxtfaktorreceptor kinashämmare |
| D6 | Dmso | Negativ kontroll |
| E6 | EC23 | Retinoic syra receptor agonist |
| F6 | TORIN2 | Mekanistiskt mål för rapamycin (MTOR)-hämmare |
| G6 | Y27362 | Rho-associerad, coiled-Coil innehållande proteinkinas (ROCK) inhibitor |
| B7 | CELECOXCIB | Cyklooxygenas-2 (COX-2) hämmare |
| C7 | SB525334 | Omvandla tillväxtfaktor beta-receptorn (TGBFR) hämmare |
| D7 | DAPT | Gamma-secretase hämmare; neuronala differentiering positiv kontroll |
| E7 | CHIR99021 | Glykogen syntas Kinas-3 hämmare; WNT Pathway aktivare |
| F7 | LDN 193189 | Ben Morphogenetic Protein (BMP) receptor hämmare |
| G7 | TARAZOTINE | Retinoic syra receptor agonist |
| B8 | AM580 | Retinoic syra receptor agonist |
| C8 | DHBP | Kalcium release hämmare |
| D8 | JSK | Kväveoxidgivare |
| E8 | DORSOMORPHIN | Bone morfogenetiska protein (BMP) receptor hämmare; 5 ' adenosinmonofosat-aktiverat proteinkinas (AMPK) hämmare |
| F8 | Imatinib | Tyrosinkinashämmare |
| G8 | BMS 493 | inverterad retinoinsyra syra receptor agonist |
| B9 | CYKLOPAMIN | Utjämnade receptor antagonist; Hedgehog väg inhibitor |
| C9 | SEMAGACESTAT | Gamma-sekretashämmare |
| D9 | BOSUTINIB | Tyrosinkinashämmare |
| E9 | PURMORPHAMIN | Utjämnade agonist; igelkotten Pathway Activator |
| F9 | Jaggan | Ojämna Notch-receptoragonist |
| G9 | SB431542 | Omvandla tillväxtfaktor beta-receptorn (TGBFR) hämmare |
| B10 | SC79 | AKT (proteinkinas B) aktivator |
| C10 | DANTROLEN | Ryanodinreceptorantagonist |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) hämmare |
| E10 | AM80 | Retinoic syra receptor agonist |
| F10 | IFN-Y | interferon-gamma; Cytokin |
| G10 | PQ401 | Insulin-like tillväxtfaktorreceptor (IGF1R) hämmare |
| B11 | DAPT | Gamma-secretase hämmare; neuronala differentiering positiv kontroll |
| C11 | A2M | Extracellulära glykoprotein; proteashämmare |
| D11 | AG490 | Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) hämmare |
| E11 | TYRPHOSTIN9 | Trombocythämmande tillväxtfaktorreceptor (PDGFR) kinashämmare |
| F11 | BMP-2 | Ben morfogenetiska protein-2 |
| G11 | Dmso | Negativ kontroll |
Tilläggstabell 1: förteckning över primära skärm föreningar. Väl plats, namn och anteckningar på var och en av de föreningar som användes i den primära skärmen tillhandahålls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det primära målet med denna artikel var att beskriva en strategi som effektivt och billigt kan identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en låg till måttlig-genomflöde screening. Två ortogonala tekniker utnyttjades för att bedöma cell nummer för att öka förtroendet för slutsatserna och erbjuda ytterligare insikter som inte skulle vara tillgängliga om bara en enda analys användes. En av de analyser som används en fluorescerande cell Imager att direkt räkna tdTomato-positiva celler och den andra var beroende av välkarakteriserad förmåga mitokona att klyva MTT till formazans därmed fungerar som en proxy för cell nummer10. Sammanlagt 57 testsubstanser bedömdes i denna demonstration även om den MTT-flygeln av analysen har använts för att testa ett bibliotek med så många som 2 000 förening14. Resultaten av skärmen påpekade hur de två analyserna skulle kunna förstärka varandra för att nå vissa slutsatser med större tillförsikt, och betonade scenarier där de två analyserna var kompletterande tillhandahålla ytterligare information som normalt skulle kräver att du utför minst två separata experiment.
Det mest kritiska steget i protokollet sker precis före plätering cellerna. Metabola förhållanden i cellkulturen kan bli mycket volatil, särskilt i fråga om glutamin och glukos konsumtion, om celler är seedade på för hög densitet17,18. Under dessa förhållanden kommer celldöd att bero på faktorer som är förknippade med cell odlingsförhållandena och som inte har något samband med toxiciteten hos testade föreningar. Resultatet kommer att bli en ökning i falska positiva identifieringar för cytotoxiska föreningar samt svårigheter att reproducera resultat18. Framgång i detta steg kräver att känna till lämplig celltäthet av cell linjen som används, noggrann bestämning av cell nummer före plätering, och fullständig resuspension av celler för att säkerställa homogen plätering distribution inom och över brunnarna i 96 -Bra tallrik. Det är också viktigt att visuellt bekräfta att cellerna är närvarande vid ungefär rätt densitet 2-3 h efter plätering genom att titta på dem under ett mikroskop.
När det gäller test analyserna är det mest kritiska steget för MTT-analysen att se till att MTT är helt upplöst i cell odlingsmediet. Kvarvarande fällning av MTT kan i sig resultera i akut cellulär toxicitet så det är viktigt att helt lösa MTT med kraftig vortexing. Den mest kritiska punkten för cell räknings analysen är att fastställa rätt exponeringstid för avbildning tdTomato. Exponeringstider som är för korta kan resultera i verkligt fluorescerande celler går oräknade av programvaran, och exponeringstider som är för långa kan göra signalen så stark att den blandar angränsande celler tillsammans så att programvaran räknar flera celler som en cell eftersom det inte kan lösa dem14. De flesta programpaket som levereras med avbildnings läsare tillåter ett förhandsgransknings steg som visar vilka celler som räknas. Det är viktigt att köra det här förhandsgranskningssteget vid flera exponeringstider och välja det som identifierar fluorescerande celler mest exakt.
Som med alla metoder finns det vissa begränsningar för dessa analyser. För att få högre genomströmning, den primära toxicitetsanalysen använder endast en enda behandling/enkeldos paradigm som kan komma på bekostnad av mer falska positiva och falska negativ. Dessutom, även om flera tidigare studier har visat att MTT korrelerar mycket väl med cell nummer när du använder antingen en koloni bildar analys19 eller en tymidin inkorporering asssay20, behandling med vissa föreningar kan antingen förbättra eller hämma mitokondriell aktivitet på ett sådant sätt att resultaten av MTT-analysen inte längre korrelerar med cell nummer21. Resultat från denna demonstration tyder på att medan MTT är utmärkt på att identifiera giftiga föreningar, dess förmåga att identifiera föreningar som antingen hämmar eller öka spridningen är begränsad kanske eftersom sådana föreningar förändra mitokondriell aktivitet i en sätt att det korrelerar mindre väl med cell nummer. Det finns också vissa begränsningar av tdTomato räkna analysen. En uppenbar begränsning är behovet av att ha en cellinjer som stabilt uttrycker ett fluorescerande protein. Senaste framstegen i genommanipulering har gjort det mycket lättare att utveckla sådana linjer, men det arbete som krävs för att generera dem kan vara bortom funktionerna i vissa laboratorier. Ur teknisk synvinkel, de största problemen med någon cell räknings analys som använder bildanalys är oförmågan hos dessa analyser att skilja mellan celler som är grupperade tillsammans resulterar i en under räkning14, därför är korrekt plätering kritisk för korrekta resultat. Ett annat potentiellt problem är att räkna döda eller döende celler som fluorescerar ljust. Ett sätt att undvika detta problem är att tvätta celler med PBS innan du räknar med att ta bort dessa bakgrunds celler. Detta kan inte vara lämpligt för vissa mindre väl följa celler linjer som levande celler kan lossna vid tvättning. En alternativ lösning på detta problem är att utnyttja flexibiliteten inneboende i många analysprogram för att anpassa parametrarna för cell identifiering inom ett smalt område så att endast levande, fluorescerande celler räknas.
Den strategi som beskrivs i denna artikel ger ett kraftfullt sätt att effektivt skärm upp till flera hundra föreningar. MTT-analysavläsning är det fysiologiska resultatet av mitokondriell aktivitet och kan ha cellinjer eller sammansatta specifika effekter som kan ge felaktiga resultat4,21. Genom att kombinera det med en cell räknings analys med hjälp av en fluorescerande reporter, dessa begränsningar kan kraftigt mildras. Som visad, jämföra resultaten av båda analyserna kan resultera i nära 100% noggrannhet i att identifiera giftiga föreningar. En tidigare studie har visat att i en HEK293T linje stabilt uttryckt tdTomato, det är hög IC50 KORRELATION mellan MTT och tdtomato för ett bibliotek av giftiga föreningar22. Även om denna studie inte kördes sekundära bekräftelser på tillräckligt träff föreningar för att utföra en liknande konkordans analys, de beräknade LD50 värden för de tre föreningarna som testades var likartade.
Förutom deras förmåga att förstärka slutsatserna om toxicitet, de två analyserna kan komplettera varandra när man tar itu med potentiella tillväxthämmande och proliferativa effekter av test föreningar. För flera testa sammansättningar divergerat datan mellan de två analyserna väsentligen. Vid undersökning av bilder av tdTomato fluorescens för vissa av dessa föreningar, det fanns märkbara morfologiska förändringar mellan behandling och kontroll. Detta tyder på att skillnaderna i normaliserade värden mellan de två analyserna kan baseras på fysiologiska förändringar som differentially påverkar MTT avläsning och tdTomato cellräkning. Möjligheten att förvärva sådana data med ett enda experiment ökar kraftigt robustheten i denna strategi vilket gör den mer allmänt tillämpbar. Som sådan har den kapacitet att inte bara identifiera giftiga föreningar med hög noggrannhet, men att påpeka föreningar med mer subtila effekter på celltillväxt/fysiologi som kan vara mer omfattande kännetecknas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NINDS intramural forsknings program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
