Avledning av en flavonol er avgjørende for sin anvendelse i helse og næringsmiddelindustrien. Her gir vi en detaljert protokoll for biosyntesen av en flavonol fra en flavanone og diskuterer de avgjørende trinnene og dens fordeler i forhold til andre tilnærminger.
Flavonols er en viktig underklasse av flavonoider med en rekke biologiske og farmakologiske aktiviteter. Her gir vi en metode for in vitro enzymatisk syntese av en flavonol. I denne metoden er Atf3h og Atfls1, to viktige gener i den biosyntetiske veien til flavonols, klonet og overexpressed i Escherichia coli. Rekombinant enzymer er renset via en affinitet kolonne og deretter en bienzymatic kaskade er etablert i en bestemt syntetisk buffer. To flavonols er syntetisert i dette systemet som eksempler og bestemmes av TLC og HPLC/LC/MS analyser. Metoden viser åpenbare fordeler i avledning av flavonols over andre tilnærminger. Det er tid-og arbeidsbesparende og svært kostnadseffektiv. Reaksjonen er lett å bli nøyaktig kontrollert og dermed skaleres opp for masseproduksjon. Målet produktet kan renses lett på grunn av de enkle komponentene i systemet. Dette systemet er imidlertid vanligvis begrenset til produksjon av en flavonol fra en flavanone.
Flavonols er en viktig underklasse av plante flavonoider og er involvert i plante utvikling og pigmentering1,2,3. Enda viktigere, disse forbindelsene har et bredt spekter av helse-fordelaktig aktiviteter, slik som anti-kreft4,5, anti-oksidativt6, anti-inflammatorisk7, antiobesity8, anti-hypertensive9 , og hukommelse tilbakekalling egenskaper10, som fører til et stort antall studier på disse plante-avledet sekundære metabolitter. Tradisjonelt disse forbindelsene er i hovedsak avledet fra plante utvinning ved hjelp av organiske løsemidler. På grunn av deres svært lave innholdet i planter11,12,13, er produksjonskostnaden for de fleste flavonols fortsatt høy, noe som pålegger store restriksjoner på deres anvendelse i helsevesenet og maten Industrien.
I løpet av de siste ti årene har forskere utviklet ganske mange metoder for å utlede flavonoider14,15. Men, kjemisk syntese av disse kompliserte molekyler besitter en rekke indre ulemper16. Det krever ikke bare giftige reagenser og ekstreme reaksjonsbetingelser, men også mange tiltak for å produsere et mål flavonoid sammensatte14,17. Videre er en annen viktig utfordring i denne strategien den chiral syntesen av aktive flavonoid molekyler. Derfor er det ikke en ideell strategi for å produsere flavonoider i en kommersiell skala via kjemisk syntese16,17.
Nylig har forskere utviklet en lovende alternativ strategi for å produsere disse kompliserte naturlige forbindelser ved tekniske mikrober med en sti for flavonoid biosyntesen18,19,20, 21 priser og , 22, som har vært vellykket tydet i planter23. For eksempel har Duan et al. innført en biosyntetiske vei inn i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae å produsere KAEMPFEROL (KMF)24. Malla et al. produsert astragalin, en glykosylert flavonol, ved å innføreflavanone 3-hydroksylase (F3H), flavonol syntase (fls1), og UDP-glukose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gener i Escherichia coliBL21 (DE3)17. Selv om det er ganske mange paradigmer, ikke alle genetisk konstruerte mikrober produserer produkter av interesse på grunn av kompleksiteten i en mobil plattform, den uforlikelighet mellom kunstig syntetisert genetiske elementer og verter, den hemmende effekten av mål produkter mot verts celler, og ustabilitet av en konstruert mobilnettet systemet selv16.
En annen lovende alternativ strategi for flavonoid produksjon er å etablere en multienzymatic Cascade in vitro. Cheng et al. har rapportert at enterocin polyketides kan med hell syntetisert ved å samle en komplett enzymatisk vei i en pott25. Denne celle-fri syntetisk strategi omgår restriksjonene av en mikrobiell produksjon fabrikken og dermed er gjennomførbart for å produsere noen flavonoider i store mengder16.
Nylig har vi med hell utviklet en bienzyme syntetisk system for å konvertere naringenin (NRN) til KMF i en pott16. Her beskriver vi dette systemet i flotte detaljer og metoder involvert i å analysere produktene. Vi presenterer også to eksempler som bruker dette systemet til å produsere KMF fra NRN og quercetin (QRC) fra eriodictyol (ERD). I tillegg diskuterer vi avgjørende skritt av denne metoden og fremtidige forsknings retninger i biosyntesen av flavonoider.
Ganske mange studier er fokusert på avledning av flavonols på grunn av deres potensielle anvendelse i helsevesenet og næringsmiddelindustrien. Men, tradisjonelle plante utvinning ved hjelp av organiske løsemidler og kjemisk syntese besitter indre ulemper, som begrenser deres bruk i produksjon av flavonols. Her rapporterer vi en detaljert metode for å produsere en flavonol fra en flavanone i en pott ved å etablere en in vitro bienzymatic kaskade. De kritiske trinnene i denne protokollen er: 1) å få rene rekombinan…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Yangzhou University spesial-utnevnt professor oppstart Funds, Jiangsu spesiallaget professor start-up midler, Six talent Peaks Project i Jiangsu Province (Grant no. 2014-SWYY-016), og et prosjekt finansiert av den prioriterte akademiske program utvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner (Veterinary Medicine). Vi takker testing Center of Yangzhou University for HPLC og MS analyser av flavonoider.
2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |