Summary
フラボノールの誘導は、ヘルスケアおよび食品産業におけるその応用に不可欠です。ここでは、フラバノンからのフラボノールの生合成のための詳細なプロトコルを提供し、他のアプローチに対する重要なステップとその利点について議論する。
Abstract
フラボノールは、様々な生物学的および薬理学的活動を伴うフラボノイドの主要なサブクラスである。ここでは、フラボノールのインビトロ酵素合成の方法を提供する。この方法では、Atf3hおよびAtfls1は、フラボノールの生合成経路における2つの主要遺伝子を、エシェリヒア大腸菌においてクローニングおよび過剰発現する。組換え酵素は、アフィニティカラムを介して精製され、その後、特定の合成バッファーにビエンザイマティックカスケードが確立されます。2つのフラボノールは、例としてこのシステムで合成され、TLCおよびHPLC/LC/MS分析によって決定される。この方法は、他のアプローチよりもフラボノールの誘導に明らかな利点を表示します。それは時間と省力化および非常に費用効果が大きい。反応は正確に制御され易く、従って大量生産のためにスケールアップされる。対象製品は、システム内の単純なコンポーネントにより、簡単に精製できます。しかし, このシステムは、通常、フラバノンからフラボノールの生産に制限されます。.
Introduction
フラボノールは、植物フラボノイドの主要なサブクラスであり、植物の開発と色素沈着1、2、3に関与しています。さらに重要なことに、これらの化合物は、抗癌4、5、抗酸化6、抗炎症7、抗肥満8、抗高血圧症などの健康に有益な活動の広い範囲を有する、および記憶リコール特性10は、これらの植物由来二次代謝産物に関する多数の研究につながる。伝統的に、これらの化合物は、主に有機溶媒を用いた植物抽出に由来する。しかし、植物11、12、13の中身が非常に低いため、ほとんどのフラボノールの生産コストは高いままで、ヘルスケアや食品への応用に大きな制限を課しています。業界。
過去数十年の間に、科学者はフラボノイド14、15を導き出す方法のかなりの数を開発しました。しかしながら、これらの複雑な分子の化学合成は、種々の固有の欠点を有する16.それは有毒な試薬および極度な反応条件だけでなく、標的フラボノイド化合物14、17を産生するための多くのステップを必要とする。さらに、この戦略のもう一つの重要な課題は、活性フラボノイド分子のキラル合成です。したがって、化学合成16、17を介して商業規模でフラボノイドを生産することは理想的な戦略ではありません。
最近、科学者は、フラボノイド生合成18、19、20のための経路を持つ微生物を工学的にすることによって、これらの複雑な天然化合物を生成するための有望な代替戦略を開発しました。21歳,22は、植物23で正常に解読された。例えば、Duanらは、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエに生合成経路を導入し、カエンフェロール(KMF)24を産生した。Mallaららは、グリコシル化フラボノールであるアストラガリンを産生し、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ(f3h)、フラボノール合成酵素(fls1)、およびUDP-グルコース:フラボノイド3-O-グルコシルトランスフェラーゼUGT78K1遺伝子を導入した。エシェリヒア大腸菌BL21(DE3)17.かなりの数のパラダイムがあるにもかかわらず、すべての遺伝子組み換え微生物が細胞プラットフォームの複雑さ、人工的に合成された遺伝元素と宿主との間の非互換性のために関心のある製品を生成するわけではない。宿主細胞に対する標的産物の影響、および工学的細胞系自体の不安定性 16.
フラボノイド生産のためのもう一つの有望な代替戦略は、インビトロで多酵素カスケードを確立することです.Chengらは、エンテロシンポリケチドが1ポット25に完全な酵素経路を組み立てることによって正常に合成することができると報告している。この無細胞合成戦略は、微生物生産工場の制限を回避し、したがって、大量16でいくつかのフラボノイドを生産するために実現可能である。
最近では、ナリンゲニン(NRN)を1ポット16でKMFに変換するバイザイム合成システムの開発に成功しました。ここでは、このシステムについて詳しく説明し、製品の分析に関わる方法について説明します。また、このシステムを用いてNRNからKMFを生成し、エリオジチオール(ERD)からケルセチン(QRC)を生成する2つの例を示す。また、この方法の重要なステップと、フラボノイドの生合成における今後の研究の方向性についても議論する。
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Protocol
1. 植物組織から総RNAを分離26,27
- 植物組織を均質化する。
- 新鮮な植物組織の100 mgを収集します(例えば、アラビドプシスタリアナから4週齢の苗)。液体窒素で組織と害虫とモルタルを凍結し、続いて組織を粉末に粉砕する。
- モルタルにRNA単離試薬の1 mL(材料の表を参照)を追加します。試薬はすぐに凍結されます。冷凍試薬が溶けたら、組織サンプルを害虫で均質化します。
- 同質素質を1.5mLチューブに移し、4°Cで5分間12,000xgでサンプルを遠心分離し、クリアされたホモジネート溶液を別の新鮮な1.5mLチューブに移します。
- 均質化したサンプルを室温で5分間インキュベートします。
- 総RNAを単離する。
- ホモジネートに0.2mLのクロロホルムを加え、チューブをしっかりとキャップし、15秒間手で激しく振り、5分間室温でサンプルをインキュベートします。
- 4°Cで15分間12,000 x gでサンプルを遠心分離し、無色の上部水相を新鮮な1.5mLチューブに移します。サンプルは遠心分離に続く3つの段階に分ける。
- 水相に0.5mLのイソプロピルアルコールを加え、激しく手でチューブを振り、室温で10分間インキュベートする。
- 4°Cで10分間12,000 x gで混合物を遠心分離し、上清を除去する。
- RNAペレットを1mLの75%エタノールで1mLでボルテックスで洗浄し、続いて7,500 x gで遠心分離を4°Cで5分間洗浄します。
- 手順 1.2.5 を繰り返します。
- 空気はペレットを5〜10分間乾燥させ、上下にピペッティングしてジエチルピロ炭酸塩(DEPC)処理水でRNAをリダイシズし、続いてマイクロ分光光度計で総RNA濃度を測定する(材料の表を参照)。
2. 相補DNA(cDNA)の合成28
- キットを使用してcDNAの最初のストランドを合成します(材料の表を参照)。表1に示すように20μL反応系をセットアップし、42°Cで50分間PCR器具で反応管をインキュベートし、その後、反応物を85°Cで5分間終了し、反応生成物を-20°Cで保存して、将来の遺伝子の増幅を行います。
| 試薬 | ボリューム |
| dNTP ミックス,各2.5mM | 4.0 μL |
| プライマーミックス | 2.0 μL |
| RNA テンプレート | 1.0 μg |
| 逆転トランスクリプトスバッファ、5× | 4.0 μL |
| 逆転写酵素, 200 U/μL | 1.0 μL |
| ルナスフリーH2O | 20.0 μLまで |
表1:全RNAをcDNAに転写する逆転
3. 組換えプラスミドの構築29
- PCR プライマーを設計します。
- GenBankデータベースから得られた主要な酵素遺伝子の配列に基づいてソフトウェア(材料の表を参照)を使用してPCRプライマーを設計し、企業によってプライマーを合成します(材料の表を参照)。プライマーの5'末端に、制限酵素部位(例えば、このプロトコルにおけるBam HIまたはEco RI)を加える。
注: このスタディで使用するプライマーを表 2に示します。
- GenBankデータベースから得られた主要な酵素遺伝子の配列に基づいてソフトウェア(材料の表を参照)を使用してPCRプライマーを設計し、企業によってプライマーを合成します(材料の表を参照)。プライマーの5'末端に、制限酵素部位(例えば、このプロトコルにおけるBam HIまたはEco RI)を加える。
| シーケンス、 5' → 3' | 目的 |
| AAGGATCCATGGCCAGGAACT | アラビドプシスタリアナからのAtf3h遺伝子のPCR増幅のためのフォワードプライマー。バムHI部位は斜体化され、pET32a(+)にクローニング用に接続される。 |
| AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTTTTCGA | A.タリアナからのAtf3h遺伝子のPCR増幅のための逆プライマー。エコRI部位は斜体化され、pET32a(+)にクローニング用に接続される。 |
| AAGGATCCアッガッグCGAAAGAGTCCA | A.タリアナ由来のAtfls1遺伝子のPCR増幅のためのフォワードプライマー。バムHI部位は斜体化され、pET32a(+)にクローニング用に接続される。 |
| AAGAATTCTCAATCアガガアガグッタット | A.タリアナからのAtfls1遺伝子のPCR増幅のための逆プライマー。エコRI部位は斜体化され、pET32a(+)にクローニング用に接続される。 |
表2:現在の研究で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー
- 遺伝子を原核発現ベクターにクローンします。
- 高忠実度のDNAポリメラーゼを用いて、合成されたcDNAの最初の鎖から遺伝子を増幅する(材料の表を参照)。表 3に示すように 100 μL PCR 反応システムをセットアップし、次の PCR サイクルを実行します: 初期退化の 2 分間 94 °C。その後、30sの30sのための94 °Cの35サイクル、アニーリングのための2分のための55 °C、および延長のための1分のための72 °C;その後、72°Cで10分間最終伸長を行い、反応混合物を12°Cに冷却する。
注:延長時間は可変であり、ほとんどのDNAポリメラーゼンに対して毎分約1000塩基の重合を有する遺伝子長によって決定される。 - 1%のアガロースゲル上のPCR製品(最も一般的には5μL)を可視化し、DNAクリーンアップキットを使用して残りの製品から特定のDNA断片を精製します(材料の表を参照)。
- 精製されたDNA断片およびベクター(例えば、pET-32a(+)))を制限酵素(例えば、このプロトコルでBam HIまたはEco RI)で消化する。表4に示すように0.2 mL PCRチューブに50μL反応システムを設置し、37°Cで3時間インキュベートし、消化したDNAを1%のアガロースゲルで分離します。
- ゲル抽出キットを使用してDNAバンドを回収する(材料の表を参照)。さらに、DNAクリーンアップキット(材料の表を参照)を使用してDNAを精製し、その後、マイクロ分光光度計でDNAの濃度を測定します(材料の表を参照)。
- T4 DNAリゲスを用いて遺伝子断片を線形ベクターDNAにライゲートする(材料の表を参照)。表5に示すように1.5mLチューブにライゲーション反応を設定し、2~3時間室温でチューブをインキュベートします。
注: ベクトルに対するインサートのモル比は可変であり、3:1 から 10:1 の範囲です。 - 化学的に有能な大腸菌細胞(例えば、TOP10またはDH5α)の50 μLにライゲーション混合物の2.5 μLを加え、穏やかに混合し、30分間氷の上にチューブを保ち、90sの42°Cで細胞を熱衝撃させ、すぐに2分間氷の上にチューブを置きます。
- 抗生物質を含まない液体LB培地を200μLをチューブに加え、1時間220rpmで37°Cシェーカーでチューブをインキュベートし、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート上の細胞を50~100μLに広げ、一晩37°Cでインキュベートします。
- 高忠実度のDNAポリメラーゼを用いて、合成されたcDNAの最初の鎖から遺伝子を増幅する(材料の表を参照)。表 3に示すように 100 μL PCR 反応システムをセットアップし、次の PCR サイクルを実行します: 初期退化の 2 分間 94 °C。その後、30sの30sのための94 °Cの35サイクル、アニーリングのための2分のための55 °C、および延長のための1分のための72 °C;その後、72°Cで10分間最終伸長を行い、反応混合物を12°Cに冷却する。
| 試薬 | ボリューム |
| Pfuマスターミックス、2× | 50.0 μL |
| フォワードプライマー、10 μM | 4.0 μL |
| リバースプライマー、10 μM | 4.0 μL |
| Cdna | 2.0 μL |
| H2O | 40.0 μL |
表3:PCR反応システムの設定
| 試薬 | ボリューム |
| DNAフラグメント/ベクター | 3.0 μg |
| バムこんにちは | 1.0 μL |
| エコRi | 1.0 μL |
| カットスマートバッファ、10× | 5.0 μL |
| H2O | 最大 50.0 μL |
表4:DNA断片/ベクターの二重消化
| 試薬 | ボリューム |
| 挿入 | X μL (0.09 pmol) |
| ベクトル | Y μL (0.03 pmol) |
| ライゲーションバッファー、10× | 1.0 μL |
| T4 DNA リガサーゼ, 400 U/μL | 1.0 μL |
| H2O | 10.0 μLまで |
表5:遺伝子断片を線形ベクターに導く
- 画面正のコロニー。
- LBプレートから100μg/mLアンピシリンを含む液体LB培地の200 μLに単一のコロニーを接種し、37°C、2-3hでインキュベートします。
注:一般的に、陽性コロニーをスクリーニングするために4 - 8コロニーを選択します。 - ステップ 3.2.1 と同様の 10 μL コロニー PCR 反応をセットアップします。
注: cDNA テンプレートの 1 μL の代わりに、LB 培養の 1 μL を使用します。 - 1%のアガロースゲル上のPCR製品を視覚化します。残りの培養液を100μg/mLアンピシリンを含む液体LB培地の3mLに接種し、14~16時間250rpmで37°Cシェーカーでインキュベートします。
- プラスミドミニプレップキットを用いて、組換え大腸菌培養物からプラスミドDNAを分離する(「材料の表」を参照)。
- 二重制限酵素分析(例えば、このプロトコルにおけるBam HIおよびEco RI)によって精製組換えプラスミドを同定する。ステップ3.2.3と同様の10μL反応システムをセットアップし、続いて3時間37°Cでインキュベーションを行い、1%のアガロースゲル上の組換えプラスミドから放出される特定のバンドを可視化します。
- LBプレートから100μg/mLアンピシリンを含む液体LB培地の200 μLに単一のコロニーを接種し、37°C、2-3hでインキュベートします。
- 陽性組換えプラスミドの配列を確認します。
- プラスミドをシーケンシングのために会社に送ります。シーケンシング会社から得られた配列とGenBankデータベースから得られた基準配列を比較することにより、DNA配列解析ソフトウェア(材料の表を参照)を使用して結果を分析します。
4. 組換え酵素タンパク質の特急30
- 正しい組換えプラスミドを有能な大腸菌BL21(DE3)に変換します。
- プラスミドの0.1 μLを氷上の1.5 mLチューブに10 μLの大腸菌BL21(DE3)に加え、チューブを氷の上に5分間保管します。
- 42°Cの水浴で90sの熱衝撃を受け、再び氷の上に2分間置きます。
- 抗生物質を使用せずにLB液体培地を200μL加え、220rpmで37°Cシェーカーで5分間インキュベートします。
- 100 μg/mLアンピシリンを含むLB寒天プレート上に50 μLの形質転換を広げ、37°Cのインキュベーターで一晩プレートをインキュベートします。
- 遺伝子の発現を誘導する。
- プレートから3~5個のコロニーを100μg/mLアンピシリンで3mLのLB液媒体を含むチューブに接種し、一晩37°Cシェーカーで250rpmでインキュベートします。
- 100 μg/mLアンピシリンを含むLB液媒体の300 mLに全ての一晩培養を移し、600nmで培養する光学密度が0.4~0.6になるまで37°Cシェーカーで250rpmでインキュベートします。
- 0.2 mMの最終濃度で培養中のイソプロピルβ-D-チオガラクシド(IPTG)を加え、250rpm、20~22°Cで遺伝子の発現を3時間誘導する。
5. 組換え酵素タンパク質の精製31
- 4°C、12,000 x gで培養した遠心分離により細菌を10分間収穫する。
- 0.1%トリトンX-100を含む細菌性リシスバッファーの15 mLでペレットを再中断し、 1 mM EDTA, 10% グリセロール, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 μg/mL アプロチニン, 1 μg/mL ルペプチン, 50 mM トリスクル (pH 8.0).
- 組換え酵素タンパク質を放出するために細菌懸濁液を超音波処理し、続いて13,000 x g、4°Cで10分間遠心分離を行う。
- 1 mL/チューブで1.5mLチューブで上清を収穫し、アリコートし、将来の使用のために-70 °Cでそれらを保存します。
- 再利用可能な空のアフィニティカラムに500 μLのHisタグ精製樹脂(材料表を参照)を適用します。樹脂を5ベッドの脱イオン水で洗浄し、エタノールをストック溶液中に捨てます。トリス-Cl(20 mM、pH 7.9)、イミダゾール(10 mM)、およびNaCl(0.5M)を含む結合バッファーの10ベッド容積と樹脂のバランスをとります。
- ステップ5.4から上清の4 mLを上記の樹脂のスラリーに塗布し、ストッパーでカラムの両端をブロックします。
- 2時間低速で回転子上で4°Cで混合物をインキュベートします。
- 溶出前に1mL/minの流量で4°Cで結合バッファーの15ベッドボリュームで融合タンパク質結合樹脂を洗浄します。
- 500 μLの溶出バッファー(20 mMトリス-Cl(pH 7.9)、500 mMイミダゾール、0.5M NaClを含む)をカラムに追加し、10分間低速でローテーター上の4°Cでスラリーをインキュベートし、精製タンパク質サンプルとして溶出液を収集します。
- ステップ 5.5 をさらに 4 回繰り返します。
- 樹脂を10床の脱イオン水と20%エタノールの3ベッド容積で順番に洗います。樹脂を20%エタノールに浸します。ストッパーでカラムをブロックし、4 °Cに保管してください。
- ブラッドフォードタンパク質アッセイによる精製タンパク質の濃度を測定します。10%SDS-PAGEゲル上のタンパク質の純度を決定し、クーマッシーブルー染色アッセイによってバンドを可視化します。
- 精製タンパク質溶液にグリセロールを10%の最終濃度に加え、酵素活性を安定させます。アリコートを-80°Cで保管してください。
6. インビエンザイム合成システムでフラバノンからフラボノールを生成16
- バッファーを準備します。
- 200 mMトリス-HCl(pH 7.2)、16.4 mM α-ケトグルタル酸、0.8%のアスコルビン酸ナトリウム、および20%のグリセロールからなる鉄硫酸塩なしで2x合成バッファーを作ります。トリスベースの1.938g、アスコルビン酸ナトリウム0.640g、αケトグルタル酸0.250g、脱イオン水の64mLにグリセロールの16 mLを溶解します。塩酸(HCl)でpHを7.2に調整し、80 mLまで脱イオン水を加えます。将来の使用のために4 °Cでバッファを保管してください。
- 2 mM鉄硫酸の100倍のストック溶液を作ります。55.6mgの硫酸ヘプタヒドレートを50mLの脱イオン水に溶かし、攪拌し、100mLまで水を加えます。
- 25 mMフラボノイドのストックソリューションを作成します。フラボノイドをメタノールに完全に溶解し、-20°Cで保存します。
- フラバノンからフラボノールを生成する合成システムをセットアップします。.
- 表 6に示すように、合成システムを準備します。
- 40°Cで反応を600rpm(揺れる熱ブロック)で開いている2.0mLチューブで40分間インキュベートします。
- 酢酸10μLと酢酸エチル100μLを加えて反応を終了します。
- 2時間後、室温でフード内の空気乾燥のための1.5 mLチューブに有機相を転送します。
| 試薬 | ボリューム |
| 2×硫酸鉄のない合成バッファー | 50.0 μL |
| 25 mM フラボノール | 2.0 μL |
| 2 mM硫酸鉄 | 0.5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2.5 μL |
| 1 mg/mL アットフレス1 | 2.5 μL |
| 25 mM フラバノン | 2.0 μL |
| H2O | 100.0 μLまで |
表 6: このプロトコルで使用される合成システム。
7. 反応物の分析
- 薄層クロマトグラフィー(TLC)分析。
- ステップ6.2.4からフラボノイドサンプルのプール5チューブと空気乾燥のための300 μLを取り出します。フラボノイド粉末をメタノールの160μLでリディス溶解する。メタノールに12.5、25、50、100、および200 ng/μLのシリアル濃度を有する本物のフラボノイドサンプルを調調します。反応サンプルと本格的なフラボノイドサンプルをポリアミド6プレートに1μL積み込みます。
- クロロホルム/メタノール/酢酸エチル/ギ酸を含む溶媒系でサンプルロードプレートを5.0:1.5:1.0:0.5の比率で実行します。
- 空気は室温でプレートを乾燥させます。塩化アルミニウム(AlCl3)の1%エタノール溶液でプレートをスプレーし、続いて室温で再び空気乾燥を行います。
- 30分後、254nmの紫外線の下でプレート上のスポットを視覚化し、画像を撮ります。
- 画像処理ソフトウェア(このプロトコルのImageJ v1.51j8など)を使用して、画像上の各スポットの灰色の値を分析します。
- ソフトウェア ImageJ を開きます。[ファイル > 開く]をクリックして、分析する画像を開きます。
- ImageJ ユーザー インターフェイスで、最も左のRectangular 選択ツールをクリックします。画像内の対象領域 (ROI) のアウトラインをマウスで
行い、押して最初の ROI にラベルを付けます。 - マウスを右にして長方形の選択範囲を次の ROI に
移動し、2 番目の ROI にラベルを付けます。 - 前の手順を繰り返して、他のすべての ROA にラベルを付けます。
- を
押すと、ポップアップ ウィンドウ内のすべての ROI のプロファイル プロットが生成されます。
注: この時点で、ImageJ ユーザー インターフェイスの直線選択ツールが自動的にアクティブになります。 - [直線選択]ツールを使用して基準線を描画し、対象の各ピークに対して閉じた領域を定義します。
- ImageJ ユーザー インターフェイスで対応するアイコンをクリックして、ワンド ツールをアクティブにします。ピーク内をクリックすると、ポップアップ ウィンドウにすべてのピークの結果が表示されます。
- ステップ 7.1.5.7 からの灰色の値をステップ 7.1.1.1 からの対応するフラボノイド濃度に対してプロットすることにより、本物のフラボノイドの TLC ベースの標準曲線を作成します。次いで、得られた式に従ってこのプロトコルで生成される金利のフラボノイドの収率を計算する。
- 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)および液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)解析
- ステップ 7.1.1 から 0.45 μm および 0.22 μm フィルターを順次処理します。
- サンプルをHPLC/LC/MSシステム(材料の表を参照)にロードし、C18(4.6 ×150 mm;i.d.、5 μm)カラムを使用して30°Cでサンプルを分離します。水中のアセトニトリル(ACN)10-85%(v/v)の勾配で1.0 mL/minでカラムを溶出します(0 - 10分、 10 - 25% ACN; 10 - 35 分, 25 - 50% ACN; 35 - 45 分, 50 - 85% ACN; 45 - 50 分, 85 - 10% ACN; 50 - 60 分、10%ACN)および溶出物の吸光度を200から800nmまで監視する。LC/MS解析は、300°Cで10L/minの乾燥窒素流量と250°Cで7L/minのシースガス流を伴う負のイオンモードで行い、内蔵ソフトウェアを使用してデータを収集します(材料の表を参照)。
- 単一波長クロマトグラフを抽出し、ソフトウェアを使用して反応サンプルおよび本格的なフラボノイド化合物のピーク領域を計算します(「材料の表」を参照)。
- 定性分析プログラムを開き、[ファイル > データ ファイルを開く]をクリックします。[データ ファイルを開く]ウィンドウで分析するファイルを選択し、[開く]をクリックしてファイルを開きます。
- クロマトグラム Rエサルトウィンドウのマウスを右クリックし、ポップアップ メニューのExtract Cホロマトグラムをクリックします。
- E xtract Cホロマトグラムのダイアログ ボックスを開きます。タイプリストで、[その他のクロマトグラム]をクリックします。検出器コンボ ボックスで、[DAD1] を選択します。次に、[OK] をクリックして、HPLC 結果をCクロマトグラム結果ウィンドウに表示します。
- Cフロマトグラム結果ウィンドウの上部にドッキングされているM年次I ntegrationアイコンをクリックします。マウスでの手動統合解析に必要なピークの基線を描画します。
- [表示 > 統合ピーク リスト]をクリックして結果を表示します。
- ステップ 7.2.3.5 からのピーク領域をステップ 7.2.1 からの対応するフラボノイド濃度に対してプロットすることにより、本物のフラボノイドの HPLC ベースの標準曲線を作成します。次いで、得られた式に従ってこのプロトコルで生成される金利のフラボノイドの収率を計算する。
- ソフトウェアを使用してフラボノイド化合物の正確な質量のMSデータを分析します(材料の表を参照)。
- 手順 7.2.3.1 - 7.2.3.3 を繰り返します。
- Cフロマトグラム結果ツールバーの[範囲選択]アイコンをクリックします。
- 関心のあるピークを選択します。選択した範囲内のマウスを右クリックし、ポップアップ メニューの[MS スペクトルの抽出] をクリックすると、[MSスペクトル結果]ウィンドウに結果が表示されます。
行い、押して最初の ROI にラベルを付けます。
移動し、2 番目の ROI にラベルを付けます。
押すと、ポップアップ ウィンドウ内のすべての ROI のプロファイル プロットが生成されます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3HおよびFLS1は、図1に示すように、フラバノンを植物のフラボノールに変換する上で2つの重要な酵素である。フラバノンからフラボノールを製造するためのインビトロ生合成システムを開発するために、Atf3h(GenBank加盟No. NM_114983.3) とAtfls1 (GenBank アクセシビリティ No.NM_120951.3)遺伝子を4週齢のA.タリアナの苗から原核発現ベクターpET-32a(+)にクローン化した。組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に変換し、IPTG誘導後に融合タンパク質を発現し、続いてNi-IDAアガロース樹脂を用いて精製した。図2に示すように、精製された融合タンパク質は、10%SDS-PAGEゲルに95%以上の高純度を示し、これはインビエンジンザイマティックカスケードの確立に十分な純粋であった。
図1:インビトロのフラバノンからのフラボノールの生合成のための概略表現。F3H, フラバノン 3-ヒドロキシラーゼ;FLS1、フラボノール合成酵素1。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組換えAtF3HおよびAtFLS1タンパク質の精製Atf3hおよびAtfls1遺伝子を、アラビドプシス・タリアナの4週齢の苗から原核発現ベクターpET-32a(+)にクローニングし、エシェリヒア・コリBL21(DE3)で発現した。組換えタンパク質を、Ni-IDAアガロース樹脂で満たされた親和性クロマトグラフィーカラムを通して精製した。純度を10%SDS-PAGEゲルで決定した。M, タンパク質マーカー;1、組換えAtF3Hタンパク質;2、組換えAtFLS1タンパク質。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
精製組換えタンパク質を用いたビエンジンカスケードを確立するために、表6に示すように合成システムを調製した。このシステムをフラバノンをフラボノールに変換するために使用できるかどうかを判断するために、NRNをシステムに追加し、TLCおよびHPLC/LC/MS分析によりKMFの生合成を検出した。図3Aに示すように、ポリアミドTLCプレート上に2つの新しいスポットが出現した。一方のスポットはジヒドロカエンフェロール(DHK)と同様の移動距離を示し、もう一方はKMFと同様であった。HPLCとLC/MSによるさらなる分析により、新しい化学物質は、それぞれ11.91分と20.16分の保持時間を示し(図3B)、準分子イオンピーク[M−H]-m/z 287.0500および285.0500(図3C))は、それぞれDHKとKMFのものと同じであった。データは、KMFがこのシステムでNRNから生成され、収率が34.94 mg/Lと高かしたことを示しています.
図3:バイエンザイマルカスケードにおけるNRNからのKMFの合成(A) ポリアミドTLCによるワンポット反応物の分析1、NRN標準;2、DHK標準;3、KMF標準;4、反応混合物。(B) 反応産物のHPLC分析プロファイル。NRN、DHK、KMFは、それぞれ18.74分、11.91分、20.16分の保持時間を示した。(C)反応混合物中のフラボノイド化合物のMS分析プロファイル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
このインビトロシステムが対応するフラボノールへの他のフラバノンの変換に使用できるかどうかをさらに決定するために、Eriodictyol(ERD)をシステムに添加し、ERDをケルセチン(QRC)に変換できるかどうかを決定した。図4Aに示すように、ポリアミドTLCプレート上の2つの新しいスポットは、ジヒドロケルセチン(DHQ)およびQRCと同様の移動距離をそれぞれ示した。HPLCおよびLC/MSの分析は、これらの新しい化学物質がそれぞれ10.03分と16.23分の保持時間を明らかにしたことを示した(図4B)と準分子イオンピーク[M−H]-m/z 303.1000および301.1000で、それぞれ(図4C)。DHQ と QRC のそれらに正確に対応しています。データは、このシステムがQRCにERDを変換することができ、収率が25.55 mg/Lだったことを示しています.
図4:バイエンザイム合成系におけるERDからのQRCの生産(A) ポリアミドTLCによる反応物の分析1、ERD標準;2、DHQ標準;3、QRC規格;4、反応混合物。(B) 反応産物のHPLC分析プロファイル。ERD、DHQ、QRCは、それぞれ15.45分、10.03分、16.23分の保持時間を表示しました。(C)反応混合物中の化合物のMS分析プロファイル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
かなりの数の研究は、ヘルスケアや食品業界での潜在的なアプリケーションにフラボノールの誘導に焦点を当てています。しかし、有機溶剤を用いた従来の植物抽出や化学合成には固有の欠点があり、フラボノールの製造に対する使用が制限されています。ここでは、インビエンザイマティックカスケードを確立することにより、フラバノンからフラボノールを1ポットで製造する詳細な方法を報告する。このプロトコルの重要なステップは、1)高活性を有する純粋な組換え酵素を得ること、および2)ワンポットビエンザイマティック反応カスケードを確立することです。一般的に言えば、細菌における植物由来遺伝子の発現は、含有体を形成することを好み、酵素活性の喪失につながる。我々が知っているように、TrxAおよびSUMOのようないくつかのペプチドは、細菌16で発現される組換えタンパク質の発現および溶解性を高めるのに役立つ。したがって、pET-32a(+)およびpET SUMO(ステップ3.2.3)のようなこれらの発現タグを含むプラスミドに標的遺伝子をクローニングすると役立ちます。IPTG濃度および誘導温度は、原核発現タンパク質16の溶解性に影響を与える別の2つの重要なパラメータであることがよく知られている。封入体の形成をさらに減少させるためには、IPTG濃度と誘導温度を最適化する必要があります。最適なIPTG濃度および誘導温度は、主にプラスミドおよび細菌株の種類に依存する。このプロトコルでは、IPTG濃度と誘導温度はそれぞれ0.2mMと20~22°Cで最適化されています(ステップ4.2.3)。さらに、温度とグリセロールは、組換え酵素を精製および貯蔵する際の安定性および活性を維持するための2つの重要なパラメータである。このプロトコルでは、組換えタンパク質を4°C(ステップ5.5~5.12)で精製し、精製酵素の溶液に10%のグリセロールを加え(ステップ5.13)、直ちにアリコートして-80°C(ステップ5.13)で溶液を保存することが重要です。ワンポット反応カスケードの確立において、pHおよび温度は2つの重要なパラメータである。鉄イオン(Fe2+)は、組換えF3HおよびFLS116、32、33の酵素活性に必要な成分である鉄イオンが沈殿しているため、pHが高すぎると変換に有害であることは明らかです。このような条件下で鉄水酸化鉄のスラリーを形成する。温度が比較的高いと酵素触媒反応の進行が促進されますが、温度が高すぎると酵素が不活性化します。そのため、pHや反応温度を安定化させる変換が重要である。前回の出版物では、最適なpHと温度をそれぞれ7.2°Cと40°Cに設定しています(ステップ6)16.
このプロトコルは、異なる基質を用いて様々なフラバノンから多数のフラボノールをバイオシンセチ化するように便利に改変することができる。このプロトコルでは、2 つの例が示されています。図3に示すように、このシステムにNRNを基板として添加すると、新しい化学物質が生成された。TLCおよびHPLC/LC/MS分析は、新しい化学物質がDHKおよびKMFであり、NRNがこのシステムでKMFに変換されたことを示しています。結果に対する信頼をさらに強化するために、1H NMR(水素-1核磁気共鳴)、13C NMR(炭素-13核磁気共鳴)、NOESY(核オーバーハウザー効果分光)、XRD(X線) 粉末回折)、CHN分析装置等は、新しい実体における化学物質の存在を証明するために必要とされてもよい。同様に、ERD はこのビエンジーカスケードで QRC に正常に変換できます (図4)。
この方法には重要な制限があります。フラボノイドの既知の生合成経路によれば、フラボノールは芳香族アミノ酸またはその下流誘導体からこのシステムによって産生することができる。例えば、KMFは、4-クマロイル:CoA-リガザーゼ(4CL)、カルコンシンタゼ(CHS)、カルコンイセメラーゼ(CHI)、F3HおよびFLS23を含む一連の主要酵素によってp-couma3酸から製造することができる。同様に、QRCは、同じ主要酵素(未発表データ)を用いてカフェイン酸から製造することができる。しかし、コエンザイムA(CoA)、ATP、マノンニルCoAをシステムに含める必要があり、p-クーマ酸をKMFに変換し、生産コストを大幅に増加させる。 したがって、このシステムは、通常、フラバノンをジヒドロフラボノールまたはフラボノールに変換するように制限される。また、出発材料の完全な変換も課題です。このシステムの効率をさらに向上させるために、今後の研究は、他の植物からの高い活性を有する主要酵素のスクリーニング、主要酵素をコードする遺伝子の突然変異、不活性担体への高活性酵素の固定化、およびより良いバッファシステムの開発。
このワンポットビエンザイム合成システムは、化学合成、微生物細胞工場、有機溶媒16を用いた植物抽出などのフラボノールを製造する他のアプローチに比いで明らかな本質的な利点を有する。まず、反応時間が非常に短く、わずか40分しか必要とされないため、この生産システムは手間と時間の節約です。第二に、このシステムには微生物細胞工場で起こったように複雑な生理的調節はなく、しかも、すべての成分が明らかである。したがって、反応を正確に制御することが容易であり、将来的にさらなる最適化を行うのに便利です。第三に、この反応システムは、単純な化学物質と精製組換え酵素のみを含み、図3と図4に示すように1つの主要な中間体のみを生成するため、標的分子の精製が容易であると期待されます。セル工場や植物のものよりもこのシステムで生成されます。第四に、システムの主要なコンポーネントは、一般的で安価な化学物質であり、原核系組換え酵素を発現しているので、この方法は所望のフラボノイドを導き出すために非常に費用対効果が高いです。第五に、このシステムのコンポーネントのシンプルさのために、ターゲットフラボノイドの大量生産のためにスケールアップすることが容易であり、巨大な工業化の可能性を示しています。さらに、このシステムは、他の二次代謝産物の経済的生産のためのガイドを提供する。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この研究は、揚州大学特任教授スタートアップファンド、江蘇特別任教授スタートアップファンド、江蘇省6つのタレントピークプロジェクト(助成金第2014-SWYY-016)、およびプロジェクトが資金提供を受けて財政的に支援されました。江蘇省高等教育機関(獣医学)の優先学術プログラム開発我々は、フラボノイドのHPLCとMS分析のための陽州大学のテストセンターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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