Summary
黄酮醇的衍生对于其在医疗保健和食品工业中的应用至关重要。在这里,我们为黄酮中黄酮的生物合成提供详细的方案,并讨论与其他方法不同的关键步骤及其优势。
Abstract
黄酮类是黄酮类的主要亚类,具有多种生物和药理活性。在这里,我们提供了一种体外酶合成黄酮醇的方法。在这种方法中,Atf3h和Atfls1是黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因,在大肠杆菌中被克隆和过度表达。重组酶通过亲和柱进行纯化,然后在特定的合成缓冲液中建立双酶级联。本系统中合成了两种黄酮醇,并通过TLC和HPLC/LC/MS分析确定。该方法在黄酮醇的衍生中表现出明显的优势。既省时又省力,而且极具成本效益。反应易于精确控制,从而达到批量生产的规模。由于系统中的组件简单,目标产品易于纯化。然而,这个系统通常仅限于生产黄酮黄酮黄酮。
Introduction
黄酮类是植物类黄酮的主要亚类,涉及植物发育和色素沉着1,2,3。更重要的是,这些化合物具有广泛的有益健康活性,如抗癌4、5、抗氧化6、抗炎7、抗肥胖8、抗高血压9,和记忆回忆属性10,导致大量研究这些植物衍生的二次代谢物。传统上,这些化合物主要来自使用有机溶剂的植物萃取物。然而,由于在植物11、12、13中含量极低,大多数黄酮醇的生产成本仍然很高,这限制了其在医疗保健和食品中的应用。行业。
在过去的几十年里,科学家们已经开发出许多方法来衍生黄酮类化合物14,15。然而,这些复杂分子的化学合成具有各种内在缺点16。它不仅需要毒试剂和极端反应条件,还需要许多步骤来产生靶向黄酮类化合物14、17。此外,这一策略的另一个重要挑战是活性类黄酮分子的手性合成。因此,通过化学合成16、17,在商业规模上生产类黄酮不是理想的策略。
最近,科学家已经开发出一种有前途的替代策略,通过工程微生物生产这些复杂的天然化合物,为黄酮类生物合成途径18,19,20,21,22,这已被成功破译在植物23。例如,Duan等人将一种生物合成途径引入萌芽的酵母糖精,以产生kaempferol(KMF)24。马拉等人通过引入黄烷3-羟基酶(f3h)、黄酮合成酶(fls1)和UDP葡萄糖:黄酮3-O-葡萄糖转移酶UGTT78K1基因,生产出一种甘基化黄酮黄酮。大肠杆菌BL21(DE3)17 .尽管有相当多的模式,但并非所有基因工程微生物都生产感兴趣的产品,因为细胞平台的复杂性,人工合成的基因元素和宿主之间的不兼容,抑制目标产品对宿主细胞的影响,以及工程细胞系统本身的不稳定性16。
黄酮类化合物生产的另一个有前途的替代策略是在体外建立多酶级联。程等人曾报告说,肠多基肽可以通过在一锅25中组装一个完整的酶通路而成功合成。这种无细胞合成策略规避了微生物生产工厂的限制,因此可以大量生产一些类黄酮。
最近,我们成功地开发了一种双酶合成系统,将纳林金(NRN)在一罐16中转化为KMF。在这里,我们将详细介绍此系统以及分析产品所涉及的方法。我们还提供了两个示例,使用该系统从 NRN 和曲霉素 (QRC) 从二恶极醇 (ERD) 生成 KMF。此外,我们还讨论了该方法的关键步骤以及黄酮类化合物生物合成的未来研究方向。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 从植物组织中分离总RNA26,27
- 使植物组织同质化。
- 收集100毫克的新鲜植物组织(例如,4周大的幼苗从阿拉伯拟南芥)。用液氮冷冻组织和虫子和砂浆,然后将组织研磨成粉末。
- 将1mL的RNA分离试剂(见材料表)加入砂浆中。试剂将立即冷冻。当冷冻试剂熔化时,将组织样品与虫子同质化。
- 将均质转移到1.5-mL管中,在4°C下以12,000 x g将样品离心5分钟,然后将清除的均质溶液转移到另一个新鲜的1.5mL管中。
- 在室温下孵育均质样品5分钟。
- 分离总RNA。
- 向均质中加入0.2 mL的氯仿,牢固地盖住管,用手用力摇动管15秒,并在室温下孵育样品5分钟。
- 在 4°C 下在 12,000 x g下将样品离心 15 分钟,并将无色上水相转移到新鲜的 1.5-mL 管中。离心后,样品分为三个阶段。
- 将0.5 mL异丙醇加入水相,用剧烈的方式用手摇动管,并在室温下孵育混合物10分钟。
- 在 4°C 下在 12,000 x g下将混合物离心 10 分钟,然后去除上清液。
- 用1mL的75%乙醇涡旋清洗RNA颗粒一次,随后在7,500 x g下在4°C下离心5分钟。
- 重复步骤 1.2.5。
- 空气干燥颗粒5-10分钟,通过上下移液,将RNA在二乙酰丙胺(DEPC)处理的水中溶解,然后用微分光光度计测量RNA总浓度(见材料表)。
2. 合成互补DNA (cDNA)28
- 使用试剂盒合成第一链的cDNA(参见材料表)。如表1所示,建立20μL反应系统,在PCR仪器中孵育反应管50分钟,在42°C下,在85°C下终止反应5分钟。
| 试剂 | 体积 |
| dNTP 混合,每个 2.5mM | 4.0 μL |
| 底漆混合 | 2.0 μL |
| RNA模板 | 1.0 μg |
| 反向转录酶缓冲液,5° | 4.0 μL |
| 逆转录酶,200 U/μL | 1.0 μL |
| 无RNase H2O | 高达 20.0 μL |
表1:总RNA逆转录到cDNA
3. 构造重组质粒29
- 设计 PCR 引引。
- 根据从GenBank数据库获得的关键酶基因序列,使用软件设计PCR引物(见材料表),并合成公司引物(见材料表)。在引基器的5'端,添加一个限制性酶位点(例如,本协议中的Bam HI或Eco RI)。
注:本研究中使用的引注如表2所示。
- 根据从GenBank数据库获得的关键酶基因序列,使用软件设计PCR引物(见材料表),并合成公司引物(见材料表)。在引基器的5'端,添加一个限制性酶位点(例如,本协议中的Bam HI或Eco RI)。
| 序列,5' = 3' | 目的 |
| AAGGATCCATGGCTCAAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT | 从阿拉伯拉比多普西斯·塔利亚纳扩增Atf3h基因的PCR扩增的前进引源。 巴姆HI 站点是斜体并附加成 pET32a(+) 的。 |
| AAGAATTCCTAAGCA加特格加特加格加特加 | 从A.thaliana扩增Atf3h基因的PCR逆转引基。生态型RI 站点是斜体并附加的,用于克隆到 pET32a(*)。 |
| AAGGATCCATGGGAAAAAGAGTCCA | Atfls1基因从A.thaliana扩增的PCR扩增的正向引源。巴姆HI 站点是斜体并附加成 pET32a(+) 的。 |
| AAGAATTCTCAATCCAGAAATATAT | 用于从A. thaliana中扩增Atfls1基因的 PCR 逆转引基。生态型RI 站点是斜体并附加的,用于克隆到 pET32a(*)。 |
表2:当前研究中使用的寡核苷酸引物
- 将基因克隆成原核表达载体。
- 使用高保真DNA聚合酶从合成的cDNA的第一链中扩增基因(见材料表)。如表3所示,设置100μL PCR反应系统,并运行以下PCR周期:94°C2分钟,用于初始变性;然后35个周期94°C用于30秒的变性,55°C为2分钟为退火,72°C为1分钟延长;随后在72°C下最终伸长10分钟,将反应混合物冷却至12°C。
注:延长时间是可变的,由大多数DNA聚合体每分钟约1000个碱基的基因长度决定。 - 在1%的糖凝胶上可视化PCR产物(最常见的5μL),并使用DNA清理试剂盒从剩余产品中纯化特定的DNA片段(见材料表)。
- 用限制性酶(例如,本协议中的BamHI或Eco RI)消化纯化的DNA片段和载体(例如,pET-32a(+))。 如表4所示,在0.2 mL PCR管中设置50μL反应系统,并在37°C孵育混合物3小时。在1%的糖凝胶上分离消化的DNA。
- 使用凝胶提取试剂盒恢复DNA带(见材料表)。使用DNA清理试剂盒进一步纯化DNA(参见材料表),然后用微分光光度计测量DNA的浓度(见材料表)。
- 使用T4DNA联成将基因片段插入线性载体DNA(见材料表)。如表5所示,在1.5mL管中设置结扎反应,并在室温下孵育该管2-3小时。
注: 插入与矢量的摩尔比是可变的,范围为 3:1 到 10:1。 - 将2.5μL的结扎混合物加入50μL的化学能力大肠杆菌细胞(例如TOP10或DH5+),轻轻混合,将管在冰上保持30分钟。 热电冲击细胞在42°C下90秒,并立即将管置于冰上2分钟。
- 将200 μL的液体LB培养基加入管中,在37°C的摇床中,在220rpm下孵育该管1小时。 在含有100微克/mL安西林的LB板上传播50-100μL的细胞,并在37°C孵育过夜。
- 使用高保真DNA聚合酶从合成的cDNA的第一链中扩增基因(见材料表)。如表3所示,设置100μL PCR反应系统,并运行以下PCR周期:94°C2分钟,用于初始变性;然后35个周期94°C用于30秒的变性,55°C为2分钟为退火,72°C为1分钟延长;随后在72°C下最终伸长10分钟,将反应混合物冷却至12°C。
| 试剂 | 体积 |
| Pfu 主混合,2° | 50.0 μL |
| 正向底漆,10 μM | 4.0 μL |
| 反向底漆,10 μM | 4.0 μL |
| Cdna | 2.0 μL |
| H2O | 40.0 μL |
表3:PCR反应系统的设置
| 试剂 | 体积 |
| DNA片段/载体 | 3.0 μg |
| 巴姆你好 | 1.0 μL |
| 生态型日 | 1.0 μL |
| 切割智能缓冲器,10° | 5.0 μL |
| H2O | 高达 50.0 μL |
表4:DNA片段/载体的双重消化
| 试剂 | 体积 |
| 插入 | X μL (0.09 pmol) |
| 向量 | Y μL (0.03 pmol) |
| 结扎缓冲液,10° | 1.0 μL |
| T4 DNA 利加塞,400 U/μL | 1.0 μL |
| H2O | 高达 10.0 μL |
表5:将基因片段分割成线性化载体
- 屏幕正殖民地。
- 将单个菌落从 LB 板接种到含有 100 μg/mL 阿霉素的液体 LB 介质中,并在 37°C、250 rpm 下孵育 2 - 3 小时。
注:一般来说,选择4 -8个菌落来筛选阳性菌落。 - 设置类似于步骤 3.2.1 中的 10 μL 位聚居 PCR 反应。
注:使用 1 μL 的 LB 培养,而不是 1 μL 的 cDNA 模板。 - 在 1% 甘蔗凝胶上可视化 PCR 产品。将剩余培养基与阳性结果注入含有100μg/mL阿霉素的3 mL液体LB培养基中,并在250 rpm的37°C摇床中孵育14-16小时。
- 使用质粒小试剂盒从重组大肠杆菌培养物中分离质粒DNA(见材料表)。
- 通过双限制性酶分析(例如,本协议中的BamHI 和EcoRI)识别纯化重组质粒。建立一个类似于步骤3.2.3中的10μL反应系统,随后在37°C孵育3小时。
- 将单个菌落从 LB 板接种到含有 100 μg/mL 阿霉素的液体 LB 介质中,并在 37°C、250 rpm 下孵育 2 - 3 小时。
- 验证正重组质粒的序列。
- 将质粒发送到公司进行测序。使用DNA序列分析软件(见材料表)分析结果,将从测序公司获得的序列与从GenBank数据库获得的参考序列进行比较。
4. 快成酶蛋白30
- 将正确的重组质粒转化为合格的大肠杆菌BL21(DE3)。
- 在冰上1.5mL管中加入0.1 μL的质粒至10μL的合格大肠杆菌BL21(DE3),并将管在冰上保存5分钟。
- 热冲击细胞在42°C水浴90s,并将其再次放在冰上2分钟。
- 加入200 μL的LB液体介质,不含抗生素,并在37°C摇床中孵育,在220rpm下孵育5分钟。
- 在含有100μg/mL阿霉素的LB琼脂板上传播50μL的转化,并在37°C培养箱中孵育板过夜。
- 诱导基因的表达。
- 将 3 - 5 个菌落从板中注入含有 3 mL LB 液体介质的管中,含有 100 μg/mL 阿霉素,并在 250 rpm 的转速下在 37 °C 摇床中孵育过夜。
- 将所有隔夜培养液转移到含有100μg/mL阿霉素的300 mL LB液体介质中,在37°C摇床中以250rpm的速度孵育,直到600nm培养基的光学密度在0.4-0.6之间。
- 在最终浓度为0.2 mM的培养物中加入等丙基β-D-硫拉酮(IPTG),并在250rpm、20-22°C诱导基因表达3小时。
5. 纯化重组酶蛋白31
- 通过在4°C、12,000 x g下角培养菌10分钟采集细菌。
- 在含有0.1%Triton X-100的细菌莱沙缓冲液15 mL中重新悬浮颗粒, 1 mM EDTA, 10% 甘油, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 μg/mL 丙氨酸, 1 μg/mL 白蛋白, 和 1 μg/mL 肽素在 50 mM Tris-Cl (pH 8.0).
- 声波细菌悬浮液释放重组酶蛋白,随后在13,000 x g下离心,4°C10分钟。
- 在 1 mL/管的 1.5-mL 管中采集和等分上清液,并将其储存在 -70°C,以供将来使用。
- 将 500 μL 的 He-L 纯化树脂(参见材料表)涂抹到可重复使用的空亲和柱上。用5床脱离子水清洗树脂,将乙醇丢弃在原料溶液中。平衡树脂与10床体积的结合缓冲液,包括Tris-Cl(20 mM,pH 7.9),imidazole(10 mM)和NaCl(0.5 M)。
- 将步骤 5.4 中上清液的 4 mL 涂抹到上述树脂的浆料上,用塞子块堵住柱的两端。
- 在4°C的转速器上低速孵育混合物2小时。
- 在洗脱前以1 mL/min的流速在4°C下用15床结合缓冲液清洗融合蛋白结合树脂。
- 向柱中加入500 μL洗脱缓冲液(含有20 mM Tris-Cl(pH 7.9)、500 mM imidazole、0.5 M NaCl),并在4°C的旋转器上以低速孵育浆料10分钟。
- 重复步骤 5.5 四次。
- 用10床的去离子水和3床20%乙醇的床卷依次清洗树脂。将树脂浸泡在 20% 乙醇中。用塞子堵住柱子,并将其储存在 4°C。
- 通过布拉德福德蛋白测定测量纯化蛋白质的浓度。确定 10% SDS-PAGE 凝胶上蛋白质的纯度,并通过 Coomassie 蓝色染色测定来可视化条带。
- 将甘油加入纯化蛋白溶液中,最终浓度为10%,以稳定酶活性。等量并储存在-80°C。
6.在体外双酶合成系统中从黄酮中生产黄酮醇 16
- 准备缓冲区。
- 使2倍合成缓冲液不含硫酸铁,包括200 mM Tris-HCl (pH 7.2)、16.4 mM +-酮谷酸、0.8%抗坏血酸钠和 20% 甘油。溶解1.938克Tris碱,0.640克抗坏血酸钠,0.250克β-酮谷酸,16 mL甘油至64 mL脱离子水。通过盐酸 (HCl) 将 pHH 调节到 7.2,并添加高达 80 mL 的去离子水。将缓冲区存储在 4°C,以供将来使用。
- 制作 2 mM 硫酸铁的 100 倍库存溶液。将55.6毫克硫酸三分水合物溶解在50 mL的去离子水中,搅拌并加入高达100 mL的水。
- 制作 25 mM 黄酮类化合物的库存溶液。将黄酮类化合物彻底溶解在甲醇中,并储存在-20°C。
- 建立一个合成系统,从黄酮中生产黄酮。
- 如表 6所示,准备合成系统。
- 在600rpm(在摇动热块中)的开放式2.0-mL管中孵育40°C反应40分钟。
- 通过加入10μL的醋酸和100μL的乙酸乙酸来终止反应。
- 两小时后,将有机相转移到1.5mL管中,在室温下在抽油烟机中进行空气干燥。
| 试剂 | 体积 |
| 2、 不含硫酸盐的合成缓冲液 | 50.0 μL |
| 25 mM 黄酮醇 | 2.0 μL |
| 2 mM 硫酸铁 | 0.5 μL |
| 1毫克/升 | 2.5 μL |
| 1毫克/升 | 2.5 μL |
| 25 mM 黄酮 | 2.0 μL |
| H2O | 高达 100.0 μL |
表6:该协议中使用的综合系统。
7. 分析反应产物
- 薄层色谱 (TLC) 分析。
- 步骤 6.2.4 中的黄酮类样品池 5 管,并拿出 300 μL 进行空气干燥。在160μL甲醇中重新溶解黄酮类粉末。在甲醇中制备序列浓度为12.5、25、50、100和200纳克/μL的正宗类黄酮样品。将反应样品和正宗类黄酮样品加载1μL到聚酰胺6板上。
- 以5.0:1.5:1.0:0.5的比例在含有氯仿/甲醇/乙酸乙酯/甲酸的溶剂系统中运行样品装载板。
- 在室温下空气干燥板。用氯化铝(AlCl 3)的1%乙醇溶液喷洒板材,随后在室温下再次进行空气干燥。
- 30分钟后,在254nm的紫外光下,将板上的斑点可视化并拍摄图像。
- 使用图像处理软件(例如,此协议中的 ImageJ v1.51j8)分析图像上每个点的灰值。
- 打开软件 ImageJ。单击"文件 >打开"以打开要分析的图像。
- 单击 ImageJ 用户界面中最左侧的Rectang最大面选择工具。使用鼠标勾勒图像中感兴趣的区域 (ROI),然后按以
标记第一个 ROI。 - 将鼠标右侧的矩形选择移到下一个 ROI 上,然后按
以标记第二个 ROI。 - 重复上一步以标记所有其他 ROIs。
- 按
以在弹出窗口中生成所有 ROIs 的配置文件图。
注: 此时,ImageJ 用户界面中的直线选择工具将自动激活。 - 使用直线选择工具绘制基准线,以便为每个感兴趣的峰值定义一个闭合区域。
- 单击 ImageJ 用户界面中的相应图标,激活魔杖工具。单击峰值内部,在弹出窗口中显示所有峰值的结果。
- 通过绘制步骤 7.1.5.7 中的灰色值与步骤 7.1.1 中的相应黄酮类化合物浓度,创建基于 TLC 的正宗黄酮标准曲线。然后,根据生成的公式计算本协议中产生的感兴趣的黄酮类化合物的收率。
- 高性能液相色谱 (HPLC) 和液相色谱/质谱 (LC/MS) 分析
- 按顺序将步骤 7.1.1 中的样品处理到 0.45 μm 和 0.22 μm 滤波器。
- 将样品加载到HPLC/LC/MS系统中(参见材料表),并使用C18(4.6 × 150 mm;即5 μm)列在30°C下分离样品。在水中以 1.0 mL/min 的梯度(10 - 85% (v/v) 醋酸酯 (ACN) 的梯度(0 - 10 分钟,10 - 25% ACN;10 - 35 分钟,25 - 50% ACN;35 - 45 分钟,50 - 85% ACN;45 - 50 分钟, 85 - 10% ACN,10% ACN),并监测 200 至 800 nm 的埃鲁特的吸光度。在负电子模式下执行LC/MS分析,在300°C下干燥氮流量为10 L/min,在250°C时为7 L/min,并使用内置软件收集数据(参见材料表)。
- 提取单波长色谱仪,使用软件计算反应样品和正宗类黄酮化合物的峰值区域(见材料表)。
- 打开定性分析程序,然后单击"文件>打开数据文件"。选择要在"打开数据文件"窗口中分析的文件,然后单击"打开"以打开文件。
- 右键单击"色谱图 Results"窗口中的鼠标,然后在弹出式菜单中单击Extract Chromatogram。
- 打开Extract Chromatogram的对话框。在"类型"列表中,单击"其他色度图"。在"检测器组合"框中,选择 DAD1。然后单击"确定",在Chromatogram 结果窗口中显示 HPLC 结果。
- 单击停靠在Chromatogram 结果窗口顶部的M年度 I不角化图标。为使用鼠标进行手动集成分析所需的峰值绘制一条基准线。
- 单击"查看 > 集成峰值列表"以显示结果。
- 通过绘制步骤 7.2.3.5 中的峰值区域与步骤 7.2.1 中的相应黄酮类化合物浓度绘制基于 HPLC 的标准曲线。然后,根据生成的公式计算本协议中产生的感兴趣的黄酮类化合物的收率。
- 使用软件分析 MS 数据,了解黄酮类化合物的确切质量(参见材料表)。
- 重复步骤 7.2.3.1 - 7.2.3.3。
- 单击Chromatogram 结果结果工具栏上的"范围选择"图标。
- 选择感兴趣的峰值。右键单击所选范围内的鼠标,然后单击弹出式菜单中的"提取 MS频谱"以在"MS频谱结果"窗口中显示结果。
标记第一个 ROI。
以标记第二个 ROI。
以在弹出窗口中生成所有 ROIs 的配置文件图。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H和FLS1是植物中黄酮转化为黄酮醇的两种重要关键酶,如图1所示。开发一种体外生物合成系统,用于从黄酮Atf3h(GenBank加入号)中生产黄酮醇。NM_114983.3)和Atfls1(根银行加入号NM_120951.3)基因从4周大的A.thaliana幼苗中克隆成原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒转化为大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导后表达融合蛋白,然后用Ni-IDA抗氧化树脂进行纯化。 如图2所示,纯化融合蛋白在10%SDS-PAGE凝胶上表现出95%以上的高纯度,纯度足以建立体外双酶级联。
图1:体外黄酮中黄酮生物合成的原理表。F3H,黄酮3-羟基酶;FLS1,黄酮醇合成酶1。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:重组AtF3H和AtFLS1蛋白的纯化。Atf3h和Atfls1基因从4周大幼苗中克隆成原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。 重组蛋白通过含有Ni-IDA抗氧化树脂的亲和色谱柱进行纯化。纯度在10%SDS-PAGE凝胶上测定。M,蛋白质标记物;1、重组AtF3H蛋白;2、重组AtFLS1蛋白。请点击此处查看此图的较大版本。
为了使用纯化重组蛋白建立双酶级联,制备了一个合成系统,如表6所示。为了确定该系统是否可用于将黄酮转化为黄酮醇,将NRN添加到系统中,并通过TLC和HPLC/LC/MS分析检测了KMF的生物合成。如图3A所示,聚酰胺TLC板上出现了两个新点。一个点显示了与二氢开苯酚(DHK)相似的迁移距离,另一个点显示了与KMF相似的迁移距离。HPLC和LC/MS的进一步分析表明,新化学品的保留时间分别为11.91分钟和20.16分钟(图3B),准分子子峰值[M+H]分别为m/z 287.0500和285.0500(图3C)),分别与DHK和KMF相同。数据表明,KMF是本系统中由NRN生产的,产量高达34.94毫克/升。
图3:在双酶级联中从NRN合成KMF。(A) 聚酰胺TLC对单罐反应产物的分析.1、NRN标准;2、DHK标准;3、KMF标准;4、反应混合物。(B) 反应产物的HPLC分析配置文件.NRN、DHK 和 KMF 的保留时间分别为 18.74 分钟、11.91 分钟和 20.16 分钟。(C) 反应混合物中黄酮类化合物的MS分析谱。请点击此处查看此图的较大版本。
为了进一步确定这个体外系统是否可用于将其他黄酮转化为相应的黄酮醇,在系统中添加了依瑞迪醇(ERD),以确定ERD是否可以转化为克西汀(QRC)。如图4A所示,聚酰胺TLC板上的两个新点显示了与二氢奎质素(DHQ)和QRC相似的迁移距离。HPLC和LC/MS分析表明,这些新化学品的保留时间分别为10.03分钟和16.23分钟(图4B),准分子组子峰值[M+H]分别为m/z 303.1000和301.1000(图4C),分别与 DHQ 和 QRC 完全对应。数据表明,该系统可将ERD转化为QRC,产量为25.55mg/L。
图4:双酶合成系统中ERD的QRC生产。(A) 聚酰胺TLC对反应产物的分析.1、ERD标准;2、DHQ标准;3、QRC标准;4、反应混合物。(B) 反应产物的HPLC分析配置文件.ERD、DHQ 和 QRC 的保留时间分别为 15.45 分钟、10.03 分钟和 16.23 分钟。(C) 反应混合物中化合物的MS分析配置文件.请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
相当多的研究侧重于黄酮醇的衍生,因为它们在保健和食品工业中具有潜在的应用。然而,传统的植物提取使用有机溶剂和化学合成具有内在的缺点,限制了其在黄酮醇的生产中使用。在这里,我们报告一种通过建立体外双酶级联从一个锅中从黄酮中产生黄酮的详细方法。该协议的关键步骤是:1)获得具有高活性的纯重组酶,2)建立一锅双酶反应级联。一般来说,植物源基因在细菌中的表达倾向于形成内含体,从而导致酶活性的丧失。正如我们所知,一些肽,如TrxA和SUMO,有助于增强细菌16中表达的重组蛋白的表达和溶解度。因此,将目标基因克隆到包含这些表达标记的质粒中,如pET-32a(+)和pET SUMO(步骤3.2.3)将是有益的。众所周知,IPTG浓度和诱导温度是影响原核表达蛋白16溶解度的另外两个关键参数。为进一步降低内含物的形成,应优化IPTG浓度和诱导温度。最佳IPTG浓度和诱导温度主要取决于质粒和细菌菌株的类型。在此协议中,IPTG 浓度和感应温度分别在 0.2 mM 和 20 - 22 °C 下进行了优化(步骤 4.2.3)。此外,温度和甘油是净化和储存重组酶时保持稳定性和活性的两个重要参数。在本协议中,在4°C(步骤5.5-5.12)下纯化重组蛋白至关重要,在纯化酶溶液中加入10%的甘油(步骤5.13),并立即在-80°C(步骤5.13)处与溶液并重并储存。在建立单罐反应级联时,pH和温度是两个重要的参数。很明显,过高的pH对转化有害,因为铁离子(Fe2+)是重组F3H和FLS1 16、32、33酶活性的必要成分。在这种情况下形成氢氧化铁的泥浆。即使相对较高的温度有助于酶催化反应的进展,过高的温度也会使酶失去活性。因此,稳定pH和反应温度对转换至关重要。我们以前的出版物将最佳pH值和温度分别设定在7.2和40°C(步骤6)16。
该协议可以方便地修改,用不同的基质将各种黄酮中的各种黄酮合成成一些黄酮醇。在此协议中,提供了两个示例。如图3所示,当将NRN作为基质添加到该系统时,会产生新的化学物质。TLC和HPLC/LC/MS分析表明,新化学品为DHK和KMF,在此系统中,NRN被转换成KMF。为了进一步增强对结果的信心,1个HNMR(氢-1核磁共振)、13 C NMR(碳-13核磁共振)、NOESY(核超声效应光谱)的光谱表征(X射线)可能需要粉末衍射、CHN 分析仪等来证明新实体中是否存在化学品。同样,ERD可以成功地转换成QRC在这个双酶级联(图4)。
此方法有一个重要限制。根据已知的黄酮类化合物的生物合成途径,该系统可以从芳香氨基酸或其下游衍生物中产生黄酮醇。例如,KMF可以通过一系列关键酶从p-coumric酸中产生,包括4-coa-胶质(4CL)、沙酮合成酶(CHS)、胆碱非色酶(CHI)、F3H和FLS23。同样,QRC也可以使用同一块关键酶(未公布的数据)用咖啡酸生产。然而,辅酶A(CoA)、ATP和马酮-CoA需要包含在系统中,以便将p-coumric酸转化为KMF,这将大大增加生产成本。因此,这个系统通常被限制将黄酮转化为二氢丙酮醇或黄酮醇。此外,完全转换起始材料是另一个挑战。为了进一步提高该系统的效率,未来的研究应侧重于筛选来自其他植物的高活性的关键酶,编码关键酶的基因突变,高活性酶固定到惰性载体,以及开发更好的缓冲系统。
这种单罐双酶合成系统具有明显的内在优势,比其他方法生产黄酮醇,如化学合成,微生物细胞工厂,植物提取使用有机溶剂16。首先,反应时间很短,只需要40分钟,所以这种生产系统是省时省力的。其次,该系统没有微生物细胞工厂中那样复杂的生理调节,而且所有成分都清晰。因此,可以容易地准确控制反应,便于将来进一步优化。第三,由于该反应系统只含有简单的化学物质和纯化重组酶,只产生一个主要的中间体,如图3和图4所示,预计更容易净化目标分子与细胞工厂和工厂相比,这个系统产生。第四,该系统的主要成分是普通和廉价的化学品和原发性表达重组酶,因此这种方法获得所需的黄酮类化合物具有很高的成本效益。第五,由于该系统组件的简单性,很容易扩大目标类黄酮的大规模生产,显示出巨大的产业化潜力。此外,该系统为其他二次代谢物的经济生产提供了指南。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作由扬州大学特聘教授创业基金、江苏省特聘教授创业基金、江苏省六大人才高峰项目(授权2014-SWYY-016)和江苏省资助项目资助。江苏省高等学校(兽医)重点学术项目发展。感谢扬州大学黄酮类化合物的HPLC和MS分析测试中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T.
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S.
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
