Summary
플라보놀의 유도는 의료 및 식품 산업에서의 응용에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 플라바논의 플라보놀의 생합성을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 그밖 접근에 비해 중요한 단계 및 그것의 이점에 토론합니다.
Abstract
플라보놀은 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가진 플라보노이드의 주요 하위 클래스입니다. 여기서, 우리는 플라보놀의 시험관 내 효소 합성을 위한 방법을 제공한다. 이 방법에서는 플라보놀의 생합성 경로에 있는 두 가지 주요 유전자인 Atf3h와 Atfls1이 대장균에서복제되고 과발화됩니다. 재조합 효소는 친화성 컬럼을 통해 정제되고 그 후 비엔자이매틱 캐스케이드가 특정 합성 완충제에 확립됩니다. 두 개의 플라보놀은 이 시스템에서 예로 합성되며 TLC 및 HPLC/LC/MS 분석에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다른 접근법에 비해 플라보놀의 유도에 명백한 이점을 표시합니다. 그것은 시간과 노동 을 절약하고 매우 비용 효율적입니다. 반응은 정확하게 제어하기 쉽고 따라서 대량 생산을 위해 확장됩니다. 대상 제품은 시스템의 간단한 구성 요소로 인해 쉽게 정제 될 수 있습니다. 그러나,이 시스템은 일반적으로 플라바네에서 플라보놀의 생산으로 제한됩니다.
Introduction
플라보놀은 식물 플라보노이드의 주요 하위 클래스이며 식물 개발 및색소 침착 1,2,3에관여합니다. 더 중요한 것은, 이 화합물은 항암제 4,5,산화6,항염증제 7, 항비만8,항고혈압 제 9와 같은 건강에 유익한 활동의 넓은 범위를 가지고 있습니다 , 및 메모리 리콜 속성10,이러한 식물 유래 보조 대사 산물에 대한 연구의 큰 숫자로 이어지는. 전통적으로, 이러한 화합물은 주로 유기 용매를 사용하여 식물 추출에서 파생됩니다. 그러나 식물11,12,13의함량이 매우 낮기 때문에 대부분의 플라보놀의 생산 비용은 여전히 높으며, 이는 의료 및 식품 분야에서의 적용에 큰 제한을 가합니다. 산업.
지난 수십 년 동안 과학자들은 플라보노이드14,15을파생하는 많은 방법을 개발했습니다. 그러나, 이러한 복잡한 분자의 화학적 합성은 다양한 본질적 단점을 가지고있다 16. 독성 시약 및 극단적인 반응 조건뿐만 아니라 표적 플라보노이드화합물(14,17)을생성하는 많은 단계도 필요하다. 더욱이, 이 전략에 있는 또 다른 중요한 도전은 액티브한 플라보노이드 분자의 키랄 종합입니다. 따라서 화학 합성16,17을통해 상업적 규모로 플라보노이드를 생산하는 것은 이상적인 전략이 아닙니다.
최근 과학자들은 플라보노이드 생합성 경로를 가진 미생물을 엔지니어링하여 이러한 복잡한 천연 화합물을 생산하는 유망한 대체 전략을 개발했습니다18,19,20, 21세 , 22,이는 성공적으로 식물23에서해독되었습니다. 예를 들어, Duan 등은 개화 효모 사카로미세세스 세레비시아에 생합성 경로를 도입하여 kaempferol(KMF)24를생산하였다. Malla et al. 아스트라갈린, 글리코실화 플라보놀,플라바노3-하이드록실라제(f3h),플라보놀 신타제(fls1), UDP-글루코골트랜스퍼라제:플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼랙타제 UGT78K1 유전자를 도입하여 대장균BL21 (DE3)17. 비록 꽤 많은 패러다임이 있지만, 모든 유전자 조작 미생물은 세포 플랫폼의 복잡성, 인위적으로 합성 된 유전 요소와 숙주 사이의 비호환성, 억제력으로 인해 관심있는 제품을 생산하지는 않습니다. 숙주 세포에 대한 표적 제품의 효과, 그리고 엔지니어링 된 세포 시스템 자체의 불안정성16.
플라보노이드 생산을 위한 또 다른 유망한 대안 전략은 시험관내에서 다중 효소 캐스케이드를 확립하는 것입니다. Cheng 외. 엔테로신 폴리케타이드는 하나의 냄비(25)에 완전한 효소 경로를 조립함으로써성공적으로 합성될 수 있다고 보고되었다. 이 무세포 합성 전략은 미생물 생산 공장의 제한을 우회하므로 일부 플라보노이드를 대량으로 생산할 수 있습니다16.
최근에는 나린게닌(NRN)을 한 냄비에 KMF로 변환하는 이효소합성 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 여기에서는 이 시스템을 자세히 설명하고 제품 분석과 관련된 방법을 설명합니다. 우리는 또한 NRN에서 KMF를 생산하기 위해이 시스템을 사용하는 두 가지 예를 제시하고 eriodictyol에서 케르세틴 (QRC)(ERD). 또한, 우리는 플라보노이드의 생합성에 있는 이 방법의 중요한 단계 및 미래 연구 방향을 토론합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 식물 조직에서 총 RNA를 분리26,27
- 식물 조직을 균질화하십시오.
- 신선한 식물 조직 100 mg을 수집하십시오 (예를 들어, 애기장대에서4 주 된 모종). 액체 질소로 조직과 유봉과 박격포를 동결한 다음 조직을 분말로 분쇄합니다.
- RNA 분리 시약 1mL를 첨가합니다(재료 표참조). 시약은 즉시 동결됩니다. 냉동 시약이 녹으면 유봉으로 조직 샘플을 균질화합니다.
- 1.5 mL 튜브로 균질화를 전달하고, 4°C에서 5분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심분리한 다음, 제거된 균질성 용액을 다른 신선한 1.5-mL 튜브로 옮긴다.
- 실온에서 균질화된 샘플을 5분 동안 배양합니다.
- 총 RNA를 분리합니다.
- 0.2 mL의 클로로포름을 균질화에 넣고 튜브를 단단히 덮고, 튜브를 15초 동안 힘차게 흔들고, 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
- 샘플을 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리하고 무색 상부 수성 상을 신선한 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 샘플은 원심분리 후 3단계로 나뉩습니다.
- 수성 상에 0.5 mL의 이소프로필 알코올을 추가하고, 활발하게 손으로 튜브를 흔들고, 10 분 동안 실온에서 혼합물을 배양하십시오.
- 혼합물을 4°C에서 10분 동안 12,000 x g에서 원심분리하고 상류를 제거한다.
- RNA 펠릿을 1 mL의 75% 에탄올로 한 번 세척한 다음 4°C에서 5분 동안 7,500 x g에서 원심분리를 합니다.
- 1.2.5단계를 반복합니다.
- 펠렛을 5-10분 동안 건조시키고 디에틸피로카보네이트(DEPC)에서 RNA를 분해하여 위아래로 파이프팅한 다음, 마이크로 분광광도계로 총 RNA 농도를 측정하였다(재료 표참조).
2. 상보DNA (cDNA)28합성
- 키트를 사용하여 cDNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다(재료 표참조). 표 1에 나타낸 바와 같이 20 μL 반응 시스템을 설정하고 42°C에서 50분 동안 PCR 계측기에서 반응 튜브를 인큐베이션한 다음, 5분 동안 85°C에서 반응을 종료한 다음, 향후 유전자 증폭을 위해 -20°C에서 반응 생성물저장한다.
| 시약 | 볼륨 |
| dNTP 믹스, 2.5mM 각 | 4.0 μL |
| 프라이머 믹스 | 2.0 μL |
| RNA 템플릿 | 1.0 μg |
| 역전사 버퍼, 5× | 4.0 μL |
| 역전사, 200 U/μL | 1.0 μL |
| RNase 프리 H2O | 최대 20.0 μL |
표 1: 총 RNA를 cDNA로 역전사
3. 재조합 플라스미드생성 29
- 디자인 PCR 프라이머.
- GenBank 데이터베이스에서 얻은 주요 효소 유전자의 서열을 기반으로 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 PCR 프라이머를 설계하고 회사에서 프라이머를 합성합니다(재료 표참조). 프라이머의 5' 말단에서, 제한 효소 부위(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 또는 EcoRI)를 추가한다.
참고: 이 연구에 사용된 프라이머는 표2에 나와 있습니다.
- GenBank 데이터베이스에서 얻은 주요 효소 유전자의 서열을 기반으로 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 PCR 프라이머를 설계하고 회사에서 프라이머를 합성합니다(재료 표참조). 프라이머의 5' 말단에서, 제한 효소 부위(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 또는 EcoRI)를 추가한다.
| 시퀀스, 5' → 3' | 목적 |
| AA개치크ATGGCTCCAGGAACTTTGACT | 애기장대에서 Atf3h 유전자의 PCR 증폭을 위한 전방 프라이머탈리아나. 밤 (것)밤 HI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착됩니다. |
| AA가트CCTAAGCGAAGATTTCGA | A. 탈리아나로부터 Atf3h 유전자의 PCR 증폭을 위한 역프라이머. 에코 (것)에 RI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착된다. |
| AAGGATCCATGGAGGTCGAAGAGTCC | A. 탈리아나로부터 Atfls1 유전자의 PCR 증폭을 위한 전진 프라이머. 밤 (것)밤 HI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착됩니다. |
| AA가트CTCAATCCAGAGGAGTTTAT | A. 탈리아나로부터 Atfls1 유전자의 PCR 증폭을 위한 역프라이머. 에코 (것)에 RI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착된다. |
표 2: 현재 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머
- 유전자를 원핵발현 벡터로 복제한다.
- 고충실도 DNA 폴리머라제(물질 표참조)를 사용하여 합성된 cDNA의 첫 번째 가닥으로부터 유전자를 증폭시다. 표 3에 나타낸 바와 같이 100 μL PCR 반응 시스템을 설정하고 다음 PCR 주기를 실행한다: 초기 변성동안 2분 동안 94°C; 그런 다음 변성용 30s에 대해 94°C의 35 사이클, 어닐링을 위한 2분 동안 55°C, 연장을 위한 1분 동안 72°C; 이어서 72°C에서 10분간 최종 연신후. 반응 혼합물을 12°C로 냉각시.
참고: 연장 시간은 가변적이며 대부분의 DNA 폴리머라제에 대해 분당 약 1000염의 중합을 가진 유전자 길이에 의해 결정된다. - 1% 아가로즈 겔상에 PCR 제품(가장 일반적으로 5 μL)을 시각화하고 DNA 정화 키트를 사용하여 나머지 제품으로부터 특정 DNA 단편을 정화합니다(재료 표참조).
- 정제된 DNA 단편 및 벡터(예를 들어, pET-32a(+))를 제한 효소(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 또는 EcoRI)로 소화한다. 표 4에 나타낸 바와 같이 0.2 mL PCR 튜브에 50 μL 반응 시스템을 설치하고 37°C에서 37°C에서 3시간 동안 혼합물을 배양하였다.
- 겔 추출 키트를 사용하여 DNA 밴드를 회수합니다(재료 표참조). DNA 정화 키트(재료 표참조)를 사용하여 DNA를 정화한 다음 미세 분광광도계로 DNA 농도를 측정합니다(재료 표참조).
- T4 DNA 리가아제(물질 표참조)를 사용하여 유전자 단편을 선형화된 벡터 DNA로 리게이트한다. 표 5에 나타낸 바와 같이 1.5 mL 튜브에 결찰 반응을 설정하고 2-3시간 동안 실온에서 튜브를 인큐베이션한다.
참고: 벡터에 대한 인서트가 있는 몰 비율은 가변적이며 3:1에서 10:1 사이입니다. - 2.5 μL의 결찰 혼합물을 화학적으로 유능한 대장균 세포 (예 : TOP10 또는 DH5α)의 50 μL에 넣고 부드럽게 혼합하고 30 분 동안 얼음에 튜브를 유지하십시오.
- 항생제없이 액체 LB 배지 200 μL을 튜브에 넣고 1 시간 동안 220 rpm에서 37 °C 셰이커에서 튜브를 배양하십시오.
- 고충실도 DNA 폴리머라제(물질 표참조)를 사용하여 합성된 cDNA의 첫 번째 가닥으로부터 유전자를 증폭시다. 표 3에 나타낸 바와 같이 100 μL PCR 반응 시스템을 설정하고 다음 PCR 주기를 실행한다: 초기 변성동안 2분 동안 94°C; 그런 다음 변성용 30s에 대해 94°C의 35 사이클, 어닐링을 위한 2분 동안 55°C, 연장을 위한 1분 동안 72°C; 이어서 72°C에서 10분간 최종 연신후. 반응 혼합물을 12°C로 냉각시.
| 시약 | 볼륨 |
| 퍼 마스터 믹스, 2× | 50.0 μL |
| 포워드 프라이머, 10 μM | 4.0 μL |
| 리버스 프라이머, 10 μM | 4.0 μL |
| Cdna | 2.0 μL |
| H2O | 40.0 μL |
표 3: PCR 반응 시스템 설정
| 시약 | 볼륨 |
| DNA 조각/벡터 | 3.0 μg |
| 밤 (것)밤 안녕 | 1.0 μL |
| 에코 (것)에 Ri | 1.0 μL |
| 컷스마트 버퍼, 10× | 5.0 μL |
| H2O | 최대 50.0 μL |
표 4: DNA 단편/벡터의 이중 소화
| 시약 | 볼륨 |
| 삽입 | X μL (0.09 pmol) |
| 벡터 | Y μL (0.03 pmol) |
| 결찰 버퍼, 10× | 1.0 μL |
| T4 DNA 리가제, 400 U/μL | 1.0 μL |
| H2O | 최대 10.0 μL |
표 5: 유전자 단편을 선형화된 벡터로 결찰
- 화면 긍정적 인 식민지.
- LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지의 200 μL로 접종하고 37°C에서 배양하고, 2-3시간 동안 250 rpm에서 배양한다.
참고 : 일반적으로 긍정적 인 식민지를 선별하기 위해 4 - 8 개의 식민지를 선택하십시오. - 3.2.1단계에서와 유사한 10 μL 콜로니 PCR 반응을 설정한다.
참고: cDNA 템플릿 1 μL 대신 LB 배양 1 μL을 사용하십시오. - 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 시각화합니다. 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 3 mL의 액체 LB 배지로 양수 결과를 내고 14-16시간 동안 250 rpm에서 37°C 셰이커로 인큐베이션한다.
- 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 재조합 대장균 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다(재료표 참조).
- 이중 제한 효소 분석(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 및 EcoRI)에 의해 정제된 재조합 플라스미드를 식별한다. 3.2.3단계에서와 유사한 10 μL 반응 시스템을 설정하고, 이어서 37°C에서 37°C에서 3시간 동안 배양한 후, 1% 아가로즈 겔상에서 재조합 플라스미드로부터 방출된 특정 밴드를 시각화한다.
- LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지의 200 μL로 접종하고 37°C에서 배양하고, 2-3시간 동안 250 rpm에서 배양한다.
- 양성 재조합 플라스미드의 서열을 확인합니다.
- 시퀀싱을 위해 플라스미드를 회사에 보냅니다. DNA 서열 분석 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 시퀀싱 회사에서 얻은 서열과 GenBank 데이터베이스로부터 얻은 기준 서열을 비교하여 결과를 분석합니다.
4. 재조합 효소 단백질30분 분급
- 올바른 재조합 플라스미드를 유능한 대장균 BL21(DE3)으로 변환합니다.
- 얼음에 1.5 mL 튜브에 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 10 μL에 플라스미드의 0.1 μL을 추가하고 5 분 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 세포를 42°C 수조에서 90초 동안 가열하고 다시 얼음위에 2분 동안 놓습니다.
- 항생제 없이 LB 액상 배지 200 μL을 넣고 220 rpm에서 37°C 셰이커에 5분 동안 배양합니다.
- 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에 50 μL의 변형을 확산시키고 37°C 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양하였다.
- 유전자의 발현을 유도한다.
- 플레이트에서 3-5개의 콜로니를 100 μg/mL 의 증폭기와 함께 LB 액상 배지 3 mL를 함유하는 튜브로 접종하고 37°C 셰이커에서 밤새 250 rpm에서 배양합니다.
- 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 액상 배지의 300 mL로 밤새 배양된 모든 배양을 37°C 쉐이커에서 250 rpm에서 배양하여 600 nm에서 배양물의 광학 밀도가 0.4-0.6 사이가 될 때까지 배양한다.
- 이소프로필 β-D-티오갈라크토사이드(IPTG)를 0.2 mM의 최종 농도로 배양내로 넣고 3시간 동안 250 rpm, 20-22°C에서 유전자의 발현을 유도한다.
5. 재조합 효소 단백질 을 정화31
- 4°C, 12,000 x g에서 배양된 배양물의 원심분리에 의해 박테리아를 10분 동안 수확한다.
- 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 세균용 용해 완충액 15 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 μg/mL 아프로틴, 1 μg/mL leupeptin, 및 50 mM Tris-Cl (pH 8.0)에서 1 μg/mL 펩스타틴.
- 세균 현탁액을 초음파 처리하여 재조합 효소 단백질을 방출하고, 이어서 10분 동안 13,000 x g, 4°C에서 원심분리를 실시한다.
- 1.5 mL 튜브에서 1.5 mL 튜브에서 상류를 수확하고 알리쿼트하여 향후 사용을 위해 -70 °C에 보관하십시오.
- 재사용 가능한 빈 친화열에 500 μL의 태그 정화 수지(재료 표참조)를 적용합니다. 수지5 베드 볼륨의 탈이온수로 수지세척하여 스톡 용액에 에탄올을 폐기한다. 트리스-Cl(20 mM, pH 7.9), 이미다졸(10 mM), 및 NaCl(0.5 M)을 포함하는 결합 완충제의 10개의 베드 부피와 수지의 균형을 조정한다.
- 5.4단계에서 상급물의 4 mL를 상기 수지의 슬러리에 적용하고 스토퍼로 컬럼의 2단을 차단한다.
- 혼합물을 2 시간 동안 저속으로 회전자상에서 4 °C에서 배양합니다.
- 용출 전에 1 mL/min의 유량으로 4°C에서 결합 완충액의 15베드 부피로 융합 단백질 결합 수지세척.
- 용출 완충액 500 μL(20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 500 mM imidazole, 0.5 M NaCl 포함)을 컬럼에 넣고 10 분 동안 낮은 속도로 로터에 4 °C에서 슬러리를 배양합니다.
- 5.5단계를 4번 더 반복합니다.
- 수지의 탈이온수 10개, 침대 부피 20% 에탄올 3개로 순차적으로 세척합니다. 수지 20% 에탄올에 담그세요. 스토퍼로 컬럼을 차단하고 4°C에 보관하십시오.
- 브래드포드 단백질 분석에 의해 정제된 단백질의 농도를 측정합니다. 10% SDS-PAGE 겔상에서 단백질의 순도를 결정하고 쿠마시 블루 염색 분석으로 밴드를 시각화하였다.
- 정제된 단백질 용액에 글리세롤을 10%의 최종 농도로 첨가하여 효소 활성을 안정화시다. 알리쿼트 및 -80 °C에 저장합니다.
6. 시험관 내 이효소 합성 계통16에서 플라바놀에서 플라보놀 을 생성
- 버퍼를 준비합니다.
- 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16.4 mM α-케토 글루타릭 산, 0.8 % 아스코르브 산 및 20 % 글리세롤로 구성된 황산 철없이 2 x 합성 버퍼를 만듭니다. 트리스 베이스 1.938 g, 아스코르바테 나트륨 0.640 g, α-케토글루타산 0.250 g, 글리세롤 16 mL을 탈이온수 64 mL에 용해하십시오. 산(HCl)으로 pH를 7.2로 조정하고 최대 80 mL의 탈이온수를 추가합니다. 버퍼를 4°C에 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
- 2 mM 황산염의 100x 재고 솔루션을 확인합니다. 탈이온수 50 mL에 55.6 mg의 황산염 헵타하이드레이트를 녹이고 저어서 최대 100 mL까지 물을 추가하십시오.
- 25mM 플라보노이드의 재고 솔루션을 만드십시오. 메탄올에 플라보노이드를 완전히 녹여 -20 °C에서 보관하십시오.
- 플라바네에서 플라보놀을 생산하는 합성 시스템을 설정합니다.
- 표6에 나타낸 바와 같이 합성 시스템을 준비한다.
- 600 rpm (흔들리는 열 블록에서)에서 열린 2.0 mL 튜브에서 40 °C에서 40 분 동안 반응을 배양합니다.
- 아세트산 10 μL과 에틸 아세테이트 100 μL을 첨가하여 반응을 종료합니다.
- 2시간 후, 유기상을 1.5mL 튜브로 옮겨 실온에서 후드에서 공기 건조를 한다.
| 시약 | 볼륨 |
| 2 × 철 황산염없는 합성 버퍼 | 50.0 μL |
| 25 mM 플라보놀 | 2.0 μL |
| 황산철 2m | 0.5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2.5 μL |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2.5 μL |
| 25 mM 플라바네 | 2.0 μL |
| H2O | 최대 100.0 μL |
표 6: 이 프로토콜에 사용되는 합성 시스템입니다.
7. 반응 제품 분석
- 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석.
- 6.2.4단계에서 플라보노이드 샘플의 5튜브를 풀하고 공기 건조를 위해 300 μL을 꺼냅니다. 메탄올 160 μL에서 플라보노이드 분말을 다시 용해시. 메탄올에 12.5, 25, 50, 100 및 200 ng/μL의 직렬 농도로 정통 플라보노이드 샘플을 준비합니다. 반응 샘플과 정통 플라보노이드 샘플의 1 μL을 폴리아미드 6 플레이트에 로드합니다.
- 5.0:1.5:1.0:0.0.5의 비율로 클로로폼/메탄올/에틸 아세테이트/포름산을 포함하는 용매 시스템에서 시료 로드 플레이트를 실행합니다.
- 접시를 실온에서 건조시면 됩니다. 알루미늄 염화물 (AlCl 3)의 1 % 에타놀릭 용액으로 플레이트를 스프레이 한 다음 실온에서 다시 공기 건조하십시오.
- 30 분 후, 254 nm에서 UV 빛 아래 판의 반점을 시각화하고 이미지를.
- 이미지 처리 소프트웨어(예: 이 프로토콜의 ImageJ v1.51j8)를 사용하여 이미지의 각 지점의 회색 값을 분석합니다.
- 소프트웨어 ImageJ를 엽니다. 파일 > 열림을 클릭하여 분석할 이미지를 엽니다.
- ImageJ 사용자 인터페이스에서 왼쪽에 있는 대부분의 Rectang형 선택 도구를 클릭합니다. 마우스로 이미지의 관심 영역(ROI)을 간략하게 설명하고 눌러
첫 번째 ROI에 레이블을 지정합니다. - 마우스로 직사각형 선택을 다음 ROI로 바로 이동하고
눌러 두 번째 ROI에 레이블을 지정합니다. - 이전 단계를 반복하여 다른 모든 ROI에 레이블을 지정합니다.
- 팝업
창에서 모든 ROI에 대한 프로파일 플롯을 생성하려면 누릅니다.
참고: 현재 ImageJ 사용자 인터페이스의 직선 선택 도구가 자동으로 활성화됩니다. - 직선 선택 도구를 사용하여 관심 있는 각 피크에 대해 닫힌 영역을 정의할 수 있도록 기준선을 그립니다.
- ImageJ 사용자 인터페이스에서 해당 아이콘을 클릭하여 지팡이 도구를 활성화합니다. 피크 내부를 클릭하여 팝업 창의 모든 피크에 대한 결과를 표시합니다.
- 7.1.1.1 단계에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 7.1.5.7 단계에서 회색 값을 플로팅하여 정통 플라보노이드의 TLC 기반 표준 곡선을 만듭니다. 이어서, 생성된 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심의 플라보노이드의 수율을 계산한다.
- 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 분석
- 7.1.1 단계에서 0.45 μm 및 0.22 μm 필터를 통해 순차적으로 샘플을 처리합니다.
- 샘플을 HPLC/LC/MS 시스템에 로드하고(재료 표참조) C18(4.6 × 150 mm; 즉, 5 μm) 컬럼을 사용하여 샘플을 30°C에서 분리합니다. 물에서 10 - 85 % (v / v) 아세토니트릴 (ACN)의 그라데이션으로 1.0 mL / min에서 열을 엘라우트 (0 - 10 분, 10 - 25% ACN; 10 - 35분, 25 - 50% ACN; 35 - 45분, 50 - 85% ACN; 45 - 50분, 85- 10% ACN; 50 - 60분 , 10% ACN) 200~ 800 nm에서 용루액의 흡광도를 모니터링한다. 300°C에서 10L/min의 건조 질소 흐름과 250°C에서 7L/min의 시스 가스 흐름을 가진 음의 이온 모드에서 LC/MS 분석을 수행하고 내장 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다(재료 표참조).
- 단일 파장 크로마토그래프를 추출하여 소프트웨어를 사용하여 반응 샘플 및 정통 플라보노이드 화합물의 피크 영역을 계산합니다(재료 표참조).
- 정성적 분석 프로그램을 열고 파일 > 데이터 파일 열기를 클릭합니다. 데이터 파일 열기 창에서 분석할 파일을 선택하고 열기를 클릭하여 파일을 엽니다.
- 크로마토그램 R에서 마우스를 마우스오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 팝업 메뉴에서 Extract Chromatograms를 클릭합니다.
- E xtract Chromatogram대화 상자를 엽니다. 유형 목록에서 다른 크로마토그램을클릭합니다. 검출기 콤보 상자에서 DAD1을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 HPLC 결과를 Chromatogram 결과 창에 표시합니다.
- Chromatogram 결과 창 의 상단에 도킹 된 M연간 Integration 아이콘을 클릭합니다. 마우스와의 수동 통합 해석에 필요한 피크에 대한 기준선을 그립니다.
- [보기> 통합 피크 목록]을 클릭하여 결과를 표시합니다.
- 7.2.1 단계에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 7.2.3.5 단계에서 피크 영역을 플로팅하여 정통 플라보노이드의 HPLC 기반 표준 곡선을 만듭니다. 이어서, 생성된 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심의 플라보노이드의 수율을 계산한다.
- 소프트웨어를 사용하여 플라보노이드 화합물의 정확한 질량에 대한 MS 데이터를 분석합니다(재료 표참조).
- 7.2.3.1 - 7.2.3.3 단계를 반복합니다.
- Chromatogram 결과 도구 모음에서 범위 선택 아이콘을 클릭합니다.
- 관심 있는 피크를 선택합니다. 선택한 범위에서 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 팝업 메뉴에서 MS 스펙트럼 추출을 클릭하여 결과를 MS 스펙트럼 결과 창에 표시합니다.
첫 번째 ROI에 레이블을 지정합니다.
눌러 두 번째 ROI에 레이블을 지정합니다.
창에서 모든 ROI에 대한 프로파일 플롯을 생성하려면 누릅니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H 및 FLS1은 도1에 도시된 바와 같이 식물에서 플라바놀로 플라바놀을 변환하는 데 중요한 두 가지 중요한 효소이다. 플라바논으로부터 플라보놀을 제조하기 위한 생체외 생합성 시스템을 개발하기 위해, Atf3h(GenBank 수탁 없음. NM_114983.3) 및 Atfls1(GenBank 가입 없음) NM_120951.3) 유전자는 4주된 A. 탈리아나의 묘목으로부터 원핵발현 벡터 pET-32a(+)로 복제하였다. 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)으로 변형시키고 융합 단백질을 IPTG 유도 후 발현하고, Ni-IDA 아가로즈 수지를 사용하여 정제하였다. 도2에 도시된 바와 같이, 정제된 융합 단백질은 10% SDS-PAGE 겔상에 95% 이상의 고순도를 나타내었으며, 이는 시험관내 비엔자이체 캐스케이드의 확립에 충분히 순수한 것으로 나타났다.
그림 1:시험관내플라바놀로부터플라보놀의 생합성을 위한 개략적 표현. F3H, 플라바네 3-하이드록실라제; FLS1, 플라보놀 신타제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 재조합 AtF3H 및 AtFLS1 단백질의 정제. Atf3h 및 Atfls1 유전자는 4주 된 애기장대 모종에서 원핵발현 벡터 pET-32a(+)로 복제하고 대장균 BL21(DE3)으로 발현하였다. 재조합 단백질은 Ni-IDA 아가로즈 수지로 채워진 친화도 크로마토그래피 컬럼을 통해 정제되었다. 순도는 10% SDS-PAGE 겔로 결정하였다. M, 단백질 마커; 1, 재조합 AtF3H 단백질; 2, 재조합 AtFLS1 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정제된 재조합 단백질을 이용하여 비엔자이체캐스케이드를 확립하기 위해, 표6에 나타낸 바와 같이 합성 시스템을 제조하였다. 이 시스템이 플라보놀로 플라바논의 변환에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 NRN이 시스템에 추가되었으며 TLC 및 HPLC/LC/MS 분석에 의해 KMF의 생합성이 검출되었습니다. 도 3A에도시된 바와 같이, 폴리아미드 TLC 플레이트에 2개의 새로운 반점이 나타났다. 한 지점은 디하이드로카엠페롤(DHK)과 유사한 이동 거리를 보였고, 다른 한 곳은 KMF와 유사한 것으로 나타났다. HPLC와 LC/MS에 의한 추가 분석은 새로운 화학물질이 각각 11.91분과 20.16분의 유지 시간을 보였다는 것을 입증하였다(그림3B)및 준분자 이온 피크 [M−H]- m/z 287.0500 및 285.0500, 각각 (그림3C) )는 각각 DHK와 KMF의 것과 동일합니다. 이 데이터는 KMF가 이 시스템에서 NRN에서 생산되었으며 수율이 34.94 mg/L만큼 높았음을 나타냅니다.
그림 3: NRN에서 KMF의 합성은 비엔자이체 폭포에서. (A) 폴리아미드 TLC에 의한 원팟 반응 제품의 분석. 1, NRN 표준; 2, DHK 표준; 3, KMF 표준; 4, 반응 혼합물. (B) 반응 제품의 HPLC 분석 프로파일. NRN, DHK, KMF는 각각 18.74분, 11.91분, 20.16분의 유지 시간을 보였다. (C) 반응 혼합물에서 플라보노이드 화합물의 MS 분석 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 시험관내 시스템이 다른 플라바논의 해당 플라보놀로의 전환에 사용될 수 있는지 여부를 추가하기 위해, 에리오딕틸(ERD)을 시스템에 추가하여 ERD가 케르세틴(QRC)으로 전환될 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 4A에도시된 바와 같이, 폴리아미드 TLC 플레이트에 2개의 새로운 반점은 각각 디하이드로커세틴(DHQ) 및 QRC와 유사한 이동 거리를 나타냈다. HPLC 및 LC/MS 분석은 이러한 새로운 화학물질이 각각 10.03분 및 16.23분의 유지 시간을 밝혀냈다는 것을 입증했습니다(그림4B)및 준분자 이온 피크 [M−H]- m/z 303.1000 및 301.1000, (그림4C) DHQ와 QRC의 각각에 정확히 해당합니다. 데이터는 이 시스템이 ERD를 QRC로 변환할 수 있으며 수율은 25.55 mg/L임을 나타냅니다.
그림 4: 이효소 합성 시스템에서 ERD로부터의 QRC 생산. (A) 폴리아미드 TLC에 의한 반응 생성물의 분석. 1, ERD 표준; 2, DHQ 표준; 3, QRC 표준; 4, 반응 혼합물. (B) 반응 제품의 HPLC 분석 프로파일. ERD, DHQ 및 QRC는 각각 15.45분, 10.03분 및 16.23분의 유지 시간을 표시했습니다. (C) 반응 혼합물에서 화합물의 MS 분석 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
많은 연구가 건강 관리 및 식품 산업에서 잠재적 인 응용 프로그램으로 인해 플라보놀의 유도에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 유기 용매와 화학 합성을 사용하여 기존의 식물 추출은 플라보놀의 생산에 사용을 제한 본질적인 단점을 가지고. 여기서, 우리는 시험관 내 비엔자이체 캐스케이드를 확립하여 한 냄비에 플라바놀로부터 플라보놀을 제조하는 상세한 방법을 보고한다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 높은 활동과 순수한 재조합 효소를 얻고 2) 원 팟 비엔자이체 반응 캐스케이드를 확립. 일반적으로 말하자면, 박테리아에서 식물 유래 유전자의 발현은 효소 활성의 손실로 이어질 것이다 포함 몸을 형성하는 것을 선호합니다. 우리가 알다시피, TrxA 및 SUMO와 같은 몇몇 펩티드는 박테리아16에서발현되는 재조합 단백질의 발현 및 용해도를 향상시키는 데 도움이 됩니다. 따라서, pET-32a(+) 및 pET SUMO(단계 3.2.3)와 같은 이러한 발현 태그를 포함하는 플라스미드내로 표적 유전자를 복제하는 것이 도움이 될 것이다. IPTG 농도 및 유도 온도는 시핵구형 발현 단백질(16)의 용해도에 영향을미치는 또 다른 두 가지 중요한 파라미터라는 것은 잘 알려져 있다. 포함 체의 형성을 더욱 감소시키기 위해 IPTG 농도 및 유도 온도를 최적화해야 합니다. 최적의 IPTG 농도 및 유도 온도는 주로 플라스미드의 종류와 박테리아 균주에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서, IPTG 농도 및 유도 온도는 각각 0.2 mM 및 20-22°C에서 최적화된다(단계 4.2.3). 또한, 온도 및 글리세롤은 재조합 효소를 정제 및 저장할 때 안정성 및 활성을 유지하기 위한 두 가지 중요한 파라미터이다. 이 프로토콜에서는 재조합 단백질을 4 °C (단계 5.5 - 5.12)에서 정화하고, 정제 효소용액에 10 % 글리세롤을 추가하고 (단계 5.13) 즉시 알리쿼트하고 용액을 -80 °C (단계 5.13)에 저장하는 것이 중요합니다. 원 팟 반응 캐스케이드의 확립에서, pH와 온도는 두 가지 중요한 매개 변수이다. 재조합 F3H 및 FLS116,32,33의효소 활성에 필요한 성분인 철이온(Fe2+)이침전되기 때문에 pH가 너무 높음은 변환에 유해하다는 것이 명백하다. 이러한 조건하에서 수산화 철의 슬러리를 형성. 상대적으로 높은 온도가 효소 촉매 반응의 진행을 용이하게하더라도, 너무 높은 온도는 효소를 비활성화합니다. 따라서 pH 및 반응 온도를 안정화시키는 변환이 중요하다. 우리의 이전 간행물은 각각 7.2 및 40 °C에서 최적 pH 및 온도를 설정합니다 (단계 6)16.
이 프로토콜은 다른 기판을 사용하여 다양한 플라바톤으로부터 다수의 플라보놀을 생체합성하기 위해 편리하게 변형될 수 있다. 이 프로토콜에서는 두 가지 예제가 제공됩니다. 그림3에 나타낸 바와 같이, NRN을 이 시스템에 기판으로 첨가할 때, 새로운 화학물질이 생산되었다. TLC 및 HPLC/LC/MS 분석은 새로운 화학 물질이 DHK 및 KMF이고 NRN이 이 시스템에서 KMF로 변환되었음을 나타냅니다. 결과에 대한 신뢰를 더욱 강화하기 위해 1H NMR(수소-1 핵 자기 공명), 13CNMR(탄소-13 핵 자기 공명), NOESY(핵 과잉 측정 효과 분광), XRD(X선)의 스펙트럼 특성화 분말 회절), CHN 분석기 등은 새로운 엔티티에 화학물질의 존재를 증명하기 위해 요구될 수 있다. 마찬가지로 ERD는 이 비엔자이체 캐스케이드에서 QRC로 성공적으로 변환될 수 있습니다(그림 4).
이 메서드에는 중요한 제한 사항이 있습니다. 플라보노이드의 알려진 생합성 경로에 따르면, 플라보놀은 방향족 아미노산 또는 그 하류 유도체에서이 시스템에 의해 생성 될 수있다. 예를 들어, KMF는 4-쿠마로일:코아-리가제(4CL), 찰콘 신타제(CHS), 찰콘 이소마라아제(CHI), F3H 및 FLS23을포함하는 일련의 주요 효소에 의해 p-쿠마릭산으로부터 제조될 수 있다. 유사하게, QRC는 주요 효소의 동일한 패널을 사용하여 카페인 산으로부터 생성될 수 있다(미공개 데이터). 그러나 코엔자임 A(CoA), ATP 및 마노닐-CoA는 p-쿠마릭산을 KMF로 변환하기 위해 시스템에 포함되어야 하며, 이로 인해 생산 비용이 크게 증가합니다. 따라서,이 시스템은 일반적으로 디하이드로 플라보놀 또는 플라보놀로 플라바놀을 변환하도록 제한된다. 또한, 시작 재료의 완전한 변환은 또 다른 도전이다. 이 시스템의 효율성을 더욱 향상시키기 위해, 미래의 연구는 다른 식물에서 높은 활동과 주요 효소를 선별에 초점을 맞추어야한다, 주요 효소를 코딩 유전자의 돌연변이, 불활성 운반체에 고활성 효소의 고정, 더 나은 버퍼 시스템의 개발.
이 1-pot 바이엔자임 합성 시스템은 유기 용매(16)를 이용한 화학합성, 미생물 세포 공장 및 식물 추출과 같은플라보놀을 생산하는 다른 접근법에 비해 명백한 본질적인 이점을 갖는다. 첫째, 반응 시간이 매우 짧고 40 분밖에 필요하지 않으므로이 생산 시스템은 노동력과 시간을 절약 할 수 있습니다. 둘째, 미생물 세포 공장에서 발생한 바와 같이 이 시스템에는 복잡한 생리학적 조절이 없으며, 또한 모든 성분이 분명하다. 따라서, 반응을 정확하게 제어하기 쉽고, 따라서 미래에 더 최적화를 하는 것이 편리하다. 셋째, 이러한 반응 시스템은 단순한 화학물질과 정제된 재조합 효소만을 함유하고 있으며 도 3 및 도4에 나타낸 바와 같이 하나의 주요 중간체만 생성하기 때문에, 표적 분자를 정화하는 것이 더 용이할 것으로 기대된다. 이 시스템에서 는 세포 공장 및 공장의 시스템보다 생성됩니다. 넷째, 시스템의 주요 구성 요소는 일반적이고 저렴한 화학 물질이며 원핵 생물 체균 으로 표현 된 재조합 효소이므로 원하는 플라보노이드를 도출하는 이 방법이 매우 비용 효율적입니다. 다섯째, 이 시스템의 구성 요소의 단순성으로 인해 대상 플라보노이드의 대량 생산을 위해 확장하기가 용이하여 거대한 산업화 잠재력을 나타냅니다. 또한, 이 시스템은 다른 이차 대사산물의 경제적인 생산을 위한 가이드를 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 사업은 양주대학교 특별임명교수 창업기금, 장쑤특별교수 창업기금, 장쑤성 6대 인재피크 프로젝트(Grant No. 2014-SWYY-016) 및 기금 지원 사업으로 재정적으로 지원되었다. 강수 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발 (수의학). 우리는 HPLC및 플라보노이드의 MS 분석을 위한 양저우 대학의 시험 센터에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T.
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S.
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
