Summary
Производные флавонола имеет решающее значение для его применения в здравоохранении и пищевой промышленности. Здесь мы предоставляем подробный протокол для биосинтеза флавона из флаванона и обсуждаем важнейшие шаги и его преимущества по сравнению с другими подходами.
Abstract
Флавонолы являются основным подклассом флавоноидов с различными биологическими и фармакологическими видами деятельности. Здесь мы предоставляем метод для ферментативного синтеза флавона. В этом методе, Atf3h и Atfls1, два ключевых гена в биосинтетических пути флавонол, клонируются и overexpressed в Escherichia coli. Рекомбинантные ферменты очищаются через столбец сродства, а затем в специфическом синтетическом буфере устанавливается двухэнзимный каскад. Два флавонала синтезируются в этой системе в качестве примеров и определяются tLC и HPLC/LC/MS анализами. Метод отображает очевидные преимущества в произветворении флавонолов по сравнению с другими подходами. Это экономия времени и труда и высокорентабельно. Реакция легко контролироваться и, таким образом, масштабируется для массового производства. Целевой продукт может быть легко очищен из-за простых компонентов в системе. Однако эта система обычно ограничивается производством флавонала из флаванона.
Introduction
Флавонол являются основным подклассом растительных флавоноидов иучаствуют в разработке растений и пигментации 1,2,3. Что еще более важно, эти соединения обладают широким спектромполезных для здоровья видов деятельности, таких как противорак 4,5,антиоксидантные6,противовоспалительные7,антиожирение8, антигипертензивные9 , и память вспомнить свойства10, что приводит к большому количеству исследований на этих растений полученных вторичных метаболитов. Традиционно, эти соединения главным образом выведены от экстракции завода используя органические растворители. Однако, из-за их очень низкого содержания на заводах11,12,13, себестоимость производства для большинства флавонол остается высокой, что накладывает большие ограничения на их применение в здравоохранении и продовольствии Промышленности.
За последние десятилетия ученые разработали целый ряд методов получения флавоноидов14,15. Однако химический синтез этих сложных молекул обладает различными недостатками16. Для этого требуются не только токсичные реагенты и экстремальные условия реакции, но и множество шагов для получения целевого флавоноидного соединения14,17. Кроме того, еще одной важной проблемой в этой стратегии является хиральный синтез активных молекул флавоноидов. Таким образом, это не идеальная стратегия для производства флавоноидов в коммерческом масштабе с помощью химического синтеза16,17.
Недавно ученые разработали перспективную альтернативную стратегию для производства этих сложных природных соединений инженерных микробов с пути для флавоноидного биосинтеза18,19,20, 21 год , 22, который был успешно расшифрочен в растениях23. Например, Duan et al. ввели биосинтетический путь в начинающие дрожжи Saccharomyces cerevisiae для производства kaempferol (KMF)24. Malla et al. производится астрагалин, гликозилированный флавонол, путем введенияфлаванона 3-гидроксилаза (f3h),флавонол синтаза(fls1), и UDP-глюкоза:флавоноид 3-O-glucosyltransferasa UGT78K1 генов в гены Escherichia coliBL21 (DE3)17. Несмотря на то, что существует довольно много парадигм, не все генетически модифицированные микробы производят продукты, представляющие интерес из-за сложности клеточной платформы, несовместимость между искусственно синтезированными генетическими элементами и хостами, ингибирующими влияние целевых продуктов против клеток-хозяев, и нестабильность инженерии клеточной системы себя16.
Еще одной перспективной альтернативной стратегией производства флавоноидов является создание мультиэнзимного каскада in vitro. Cheng et al. сообщили, что энтероциновые поликетиды могут быть успешно синтезированы путем сборки полного ферментативного пути в одном горшке25. Эта бесклеточная синтетическая стратегия обходит ограничения завода по производству микробов и, таким образом, осуществима для производства некоторых флавоноидов в большом количестве16.
Недавно мы успешно разработали биэнзим синтетическую систему для преобразования нарингенина (NRN) в KMF в одном горшке16. Здесь мы подробно описываем эту систему и методы, связанные с анализом продуктов. Мы также представляем два примера, которые используют эту систему для производства KMF из NRN и кверцетина (КРК) от эриодицита (ERD). Кроме того, мы обсуждаем важнейшие шаги этого метода и направления будущих исследований в биосинтезе флавоноидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изолировать общую РНК из тканей растений26,27
- Гомогенизировать ткани растений.
- Соберите 100 мг свежей растительной ткани (например, 4-недельные саженцы из Arabidopsis thaliana). Заморозить ткани и пестик и раствор с жидким азотом, а затем шлифовальные ткани в порошок.
- Добавьте 1 мл реагента изоляции РНК (см. таблицуматериалов) в ступку. Реагент будет немедленно заморожен. Гомогенизировать образец ткани с пестиком, когда замороженный реагент тает.
- Перенесите гоменат в трубку 1,5 мл, центрифугируйте образец при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия, а затем перенесите очищенный одноразовой раствор в другую свежую трубку размером 1,5 мл.
- Инкубировать гомогенизированный образец при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Изолировать общую РНК.
- Добавьте 0,2 мл хлороформа в гомогенат, надежно закрепите трубку, энергично встряхните трубку вручную в течение 15 с и инкубируют образец при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Centrifuge образец на 12000 х г в течение 15 минут при 4 c и передать бесцветную верхнюю ваквистую фазу на свежий 1,5-мл трубки. Образец разделяется на три фазы после центрифугации.
- Добавьте 0,5 мл изопропилового спирта в водной фазе, энергично пожмите трубку вручную и инкубацию смеси при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Centrifuge смесь на 12000 х г в течение 10 мин при 4 кв и удалить супернатант.
- Вымойте РНК гранулы один раз с 1 мл 75% этанола путем вихря, а затем центрифугирование на 7500 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Повторите шаг 1.2.5.
- Воздух сушит гранулы в течение 5-10 минут и растворяет РНК в диэтилпирокарбонат (DEPC) обработанной водой путем трубопитания вверх и вниз, а затем измерения общей концентрации РНК с микро-спектрофотометр (см. Таблица материалов).
2. Синтезировать комплементарную ДНК (cDNA)28
- Синтезировать первую нить кДНК с помощью комплекта (см. Таблицаматериалов). Настройте 20-л реакционную систему, как показано в таблице 1, и инкубировать реакционную трубку в инструменте ПЦР в течение 50 мин при 42 градусах По Цельсию, а затем прервать реакцию при 85 градусах По Цельсию в течение 5 мин. Храните продукт реакции при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего усиления генов.
| Реагентов | Объем |
| dNTP Mix, 2,5 мм каждый | 4,0 л л |
| Праймер Микс | 2,0 л л |
| Шаблон РНК | 1,0 мкг |
| Обратный транскриптаза буфера, 5 " | 4,0 л л |
| Обратная транскриптаза, 200 U/L | 1,0 л |
| RNase-free H2O | до 20,0 л |
Таблица 1: Обратная транскрипция общей РНК в кДНК
3. Построить рекомбинантные плазмиды29
- Дизайн ПЦР праймеры.
- Дизайн ПЦР праймеры с использованием программного обеспечения (см. Таблица материалов) на основе последовательностей ключевых генов ферментов, полученных из базы данных GenBank и синтезировать праймеры компанией (см. Таблица материалов). В 5' конце грунтовки, добавить место фермента ограничения (например, БамHI или EcoRI в этом протоколе).
ПРИМЕЧАНИЕ: праймеры, используемые в этом исследовании, показаны в таблице 2.
- Дизайн ПЦР праймеры с использованием программного обеспечения (см. Таблица материалов) на основе последовательностей ключевых генов ферментов, полученных из базы данных GenBank и синтезировать праймеры компанией (см. Таблица материалов). В 5' конце грунтовки, добавить место фермента ограничения (например, БамHI или EcoRI в этом протоколе).
| Последовательность, 5' и 3' | Цель |
| А.А. ГЯТККТГГКЦАГАКТТГАКТ | Передняя грунтовка для усиления ПЦР гена Atf3h от Arabidopsis thaliana. Бам HI сайт курсивом и прилагается для клонирования в pET32a (кв). |
| ААГААТТКТААГГАГАТТГГТКГГА | Обратный грунт для pcR усиления гена Atf3h от A. thaliana. Эко Сайт RI курсивом и прилагается для клонирования в pET32a (кв. м). |
| ААGGATCCATGGAGGTCGAAGagTCCA | Передняя грунтовка для усиления ПЦР гена Atfls1 от A. thaliana. Бам HI сайт курсивом и прилагается для клонирования в pET32a (кв). |
| ААГААТТЦТКААТКАГАГАГАТТТАТ | Обратная грунтовка для усиления ПЦР гена Atfls1 от A. thaliana. Эко Сайт RI курсивом и прилагается для клонирования в pET32a (кв. м). |
Таблица 2: Олигонуклеотид праймеры, используемые в текущем исследовании
- Клонгенов в вектор прокариотического выражения.
- Усиль гены из первой нити синтезированной кДНК с помощью полимеразы высокой точности ДНК (см. Таблицаматериалов). Навлажь систему реакции ПЦР размером 100 градусов, как показано в таблице 3, и запустите следующий цикл ПЦР: 94 кВ в течение 2 минут для первоначальной денатурации; затем 35 циклов по 94 градуса по Цельсию на 30 с для денатурации, 55 градусов по Цельсию в течение 2 мин для аннулирования и 72 кв. м в течение 1 мин для расширения; затем окончательное удлинение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Охладите реакционную смесь до 12 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время расширения является переменной и определяется длиной гена с полимеризацией около 1000 оснований на мин для большинства полимераз ДНК. - Визуализируйте продукты ПЦР (чаще всего 5 л) на 1% геля агарозы и очистите специфический фрагмент ДНК от остальных продуктов с помощью комплекта для очистки ДНК (см. Таблицаматериалов).
- Переварить очищенный фрагмент ДНК и вектор (например, pET-32a (я)) с ферментами ограничения (например, BamHI или EcoRI в этом протоколе). Настройте 50-л системы реакции в 0,2 мл ПЦР трубки, как показано в таблице 4 и инкубировать смесь при 37 кв с для 3 ч. Отделите переваренной ДНК на 1% агарозного геля.
- Восстановить ДНК-группы с помощью комплекта извлечения геля (см. Таблицаматериалов). Дальнейшее очищение ДНК с помощью комплекта для очистки ДНК (см. ТаблицаМатериалов), а затем измерения концентрации ДНК с помощью микроспектрофотометра (см. Таблицаматериалов).
- Свагите фрагмент гена в линейную векторной ДНК с помощью лигазы Днк T4 (см. Таблицаматериалов). Настройте реакцию перевязки в трубке 1,5 мл, как показано в таблице 5, и инкубация трубки при комнатной температуре для 2 - 3 h.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение моляровки вставки к вектору является переменным и колеблется от 3:1 до 10:1. - Добавьте 2,5 л перевязочной смеси в 50 л химически компетентных клеток кишечной палочки (например, TOP10 или DH5), аккуратно перемешайте и держите трубку на льду в течение 30 мин. Тепло шокирует клетки при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 90 с и немедленно помещайте трубку на лед в течение 2 минут.
- Добавьте 200 qL жидкой среды LB без антибиотиков в трубку и инкубировать трубку в шейкере 37 градусов по Цельсию при 220 об/мин при 1 ч. Распространение 50 - 100 л клеток на пластине LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировать при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
- Усиль гены из первой нити синтезированной кДНК с помощью полимеразы высокой точности ДНК (см. Таблицаматериалов). Навлажь систему реакции ПЦР размером 100 градусов, как показано в таблице 3, и запустите следующий цикл ПЦР: 94 кВ в течение 2 минут для первоначальной денатурации; затем 35 циклов по 94 градуса по Цельсию на 30 с для денатурации, 55 градусов по Цельсию в течение 2 мин для аннулирования и 72 кв. м в течение 1 мин для расширения; затем окончательное удлинение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Охладите реакционную смесь до 12 градусов по Цельсию.
| Реагентов | Объем |
| Пфу Мастер Микс, 2 " | 50,0 л |
| Форвард Праймер, 10 мкм | 4,0 л л |
| Обратный праймер, 10 мкм | 4,0 л л |
| cDNA | 2,0 л л |
| H2O | 40,0 л |
Таблица 3: Настройка системы реакции ПЦР
| Реагентов | Объем |
| Фрагмент ДНК/Вектор | 3,0 мкг |
| Бам Привет | 1,0 л |
| Эко Ри | 1,0 л |
| Cutsmart Буфер, 10 " | 5,0 л |
| H2O | до 50,0 л л |
Таблица 4: Двойное переваривание фрагмента/вектора ДНК
| Реагентов | Объем |
| Вставить | X ЗЛ (0,09 пм. |
| Вектор | Y ЗЛ (0,03 пм. |
| Лигационный буфер, 10 | 1,0 л |
| T4 ДНК Лигаза, 400 U / Л | 1,0 л |
| H2O | до 10,0 л |
Таблица 5: Лигация фрагмента гена в линейный вектор
- Экран положительных колоний.
- Привить одну колонию из пластины LB в 200 л л кл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллин, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 250 об/мин при 2 - 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, выбрать 4 - 8 колоний для скрининга положительных колоний. - Навлажив актом пЦР-реакцию 10-л колонии, аналогичную той, которая была в шаге 3.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1 зл культуры LB вместо 1 юл шаблона cDNA. - Визуализируйте продукты ПЦР на 1% агарозный гель. Привить оставшуюся культуру с положительным результатом в 3 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллин и инкубировать в шейкере 37 градусов по Цельсию при 250 об/мин при 14 - 16 л.с.
- Изолировать плазмид ДНК из рекомбинантных культур кишечной палочки с помощью плазмидного мини-комплекта (см. Таблицаматериалов).
- Определите очищенные рекомбинантные плазмиды с помощью анализа ферментов двойного ограничения (например, BamHI и EcoRI в данном протоколе). Навешите систему реакции на 10 л, аналогичную той, что в шаге 3.2.3, а затем инкубации при 37 кв. м на 3 ч. Визуализируйте конкретную полосу, выпущенную из рекомбинантной плазмиды на 1% агарозного геля.
- Привить одну колонию из пластины LB в 200 л л кл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллин, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 250 об/мин при 2 - 3 ч.
- Проверить последовательности положительных рекомбинантных плазмидов.
- Отправить плазмиды в компанию для секвенирования. Проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения анализа последовательности ДНК (см. ТаблицаМатериалов), сравнив последовательность, полученную от компании по секвенированию, с референтной последовательностью, полученной из базы данных GenBank.
4. Экспресс рекомбинантные ферментные белки30
- Преобразуйте правильную рекомбинантную плазмиду в компетентную E. coli BL21 (DE3).
- Добавьте 0,1 л плазмиды до 10 зл компетентных E. coli BL21 (DE3) в трубке 1,5 мл на льду и держите трубку на льду в течение 5 мин.
- Тепло шокирует клетки в водяной бане 42 градусов по Цельсию в течение 90 с и поместите его на лед снова в течение 2 мин.
- Добавьте 200 л жидкой среды LB без антибиотиков и инкубировать в шейкере 37 градусов по Цельсию при 220 об/мин в течение 5 мин.
- Распространение 50 qL преобразования на LB агар пластины, содержащей 100 мкг /мл ампициллин и инкубировать пластину на ночь в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
- Индуцировать экспрессию генов.
- Прививать 3 - 5 колоний из пластины в трубку, содержащую 3 мл жидкой среды LB с 100 мкг/мл ампициллин и инкубировать при 250 об/мин в шейкере 37 градусов по Цельсию на ночь.
- Перенесите всю ночную культуру в 300 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллин, и инкубировать при 250 об/мин в шейкере 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока оптическая плотность культуры не будет на уровне 600 Нм составляет от 0,4 до 0,6.
- Добавьте изопропил-Д-тиогалактозид (IPTG) в культуру с конечной концентрацией 0,2 мМ и нависли экспрессию генов при 250 об/мин, 20 - 22 градуса по Цельсию на 3 ч.
5. Очищать рекомбинантные ферментные белки31
- Урожай бактерий центрифугированием культуры при 4 градусах По Цельсию, 12 000 х г в течение 10 мин.
- Приостановить гранулы в 15 мл бактериального лисиса буфера, содержащего 0,1% Тритон X-100, 1 мМ EDTA, 10% глицерол, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF, 1 мкг/мл апротинин, 1 мкг/мл леупептина и 1 мкг/м пепстатин в 50 мМ Трис-Кл (pH 8.0).
- Сноукейт бактериальной суспензии, чтобы освободить рекомбинантных белков фермента, а затем центрифугации на 13000 х г, 4 КК в течение 10 мин.
- Урожай и aliquot супернатант в 1,5-мл труб на 1 мл / трубки и хранить их на -70 градусов по Цельсию для использования в будущем.
- Примените 500 зЛ очистной погоды Его тегов (см. ТаблицаМатериалов) к многоразовому столбце пустого сродства. Вымойте с мелисомсс 5 объемов кровати деионизированной воды, чтобы отказаться от этанола в бульонном растворе. Сбалансируйте массу с 10 объемами кроватей связывающего буфера, состоящего из Tris-Cl (20 мм, рН 7,9), имидазола (10 мм) и NaCl (0,5 м).
- Нанесите 4 мл супернатанта от шага 5.4 к суспензии вышеуказанной мизины и заблокируйте два конца колонны пробками.
- Инкубировать смесь при 4 градусах Цельсия на ротаторе на низкой скорости в течение 2 ч.
- Вымойте синтез белка связаны мелиссы с 15 объемов кровати связывающего буфера на 4 КК при скорости потока 1 мл / мин до elution.
- Добавьте в колонку 500 кЛ элютионного буфера (содержащего 20 мм Tris-Cl (pH 7.9), 500 мМ имидазола, 0,5 М NaCl) и инкубировать суспензию при 4 кВ на ротаторе на низкой скорости в течение 10 мин.
- Повторите шаг еще 5,5 четыре раза.
- Вымойте ресину последовательно с 10 объемов кровати деионизированной воды и 3 кровати объемов 20% этанола. Замочите смущей сяму в 20% этанола. Заблокируйте столбец пробками и храните ее при 4 градусах Цельсия.
- Измерьте концентрацию очищенных протеинов анализом протеина Bradford. Определите чистоту белков на 10% SDS-PAGE гель и визуализировать полосы Coomassie синий анализ окрашивания.
- Добавьте глицерол в очищенный белковый раствор до конечной концентрации 10%, чтобы стабилизировать активность фермента. Aliquot и хранить его при -80 градусах По Цельсию.
6. Производить флавонол из флаванона в синтетической системе in vitro bienzyme 16
- Подготовка буферов.
- Сделать 2x синтетический буфер без сульфата железа, состоящий из 200 мм Tris-HCl (pH 7.2), 16,4 мм кетоглутариевой кислоты, 0,8% аскорбат натрия и 20% глицерола. Растворите 1,938 г основания Трис, 0,640 г аскорбата натрия, 0,250 г кетоглутаровой кислоты и 16 мл глицерола до 64 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 7,2 на соляной кислоте (HCl) и добавьте деионизированную воду до 80 мл. Храните буфер при 4 градусах по Цельсию для будущего использования.
- Сделать 100x запас решение 2 мМ ферросплавных сульфата. Растворите 55,6 мг ферросплавного сульфата гептагидрата в 50 мл деионированной воды, перемешайте и добавьте воду до 100 мл.
- Сделать запас раствор 25 мМ флавоноид. Растворите флавоноид в метаноле тщательно и хранится при -20 градусов по Цельсию.
- Настройка синтетической системы для производства флавонала из флаванона.
- Подготовьте синтетическую систему, как показано в таблице 6.
- Инкубировать реакцию при температуре 40 градусов по Цельсию в открытой трубке 2,0 мл при 600 об/мин (в трясущемся теплоблоке) в течение 40 мин.
- Упраздните реакцию, добавив 10 кл/л уксусной кислоты и 100 л этилового ацетата.
- Через два часа перенесите органические фазы на 1,5 мл труб для высыхания воздуха в капоте при комнатной температуре.
| Реагентов | Объем |
| 2' Синтетический буфер без сульфата железа | 50,0 л |
| 25 мМ флавонол | 2,0 л л |
| 2 мМ ферросплавный сульфат | 0,5 л л |
| 1 мг/мл AtF3H | 2,5 л л |
| 1 мг/мл AtFLS1 | 2,5 л л |
| 25 мМ флаванон | 2,0 л л |
| H2O | до 100,0 л |
Таблица 6: Синтетическая система, используемая в этом протоколе.
7. Проанализируйте реакционные продукты
- Анализ хроматографии тонкого слоя (TLC).
- Бассейн 5 трубок флавоноидов образцов от шага 6.2.4 и вынуть 300 qL для сушки воздуха. Вырежесли флавоноидный порошок в 160 зл метанола. Подготовьте подлинные образцы флавоноидов с серийными концентрациями 12,5, 25, 50, 100 и 200 нг/Л в метаноле. Загрузите 1 Зл образца реакции и подлинные образцы флавоноидов на полиамид 6 пластин.
- Запустите нагруженные образцами пластины в системе растворителей, включающей хлороформ/метанол/этил-ацетат/формическую кислоту в соотношении 5,0:1,5:1.0:0,5.
- Воздух высушивает тарелки при комнатной температуре. Спрей пластин с 1% этанолилового раствора хлорида алюминия (AlCl3), а затем сушки воздуха снова при комнатной температуре.
- Тридцать минут спустя, визуализировать пятна на пластинах под ультрафиолетовым светом на 254 нм и принимать изображения.
- Проанализируйте серое значение каждого пятна на изображениях с помощью программного обеспечения для обработки изображений (например, ImageJ v1.51j8 в этом протоколе).
- Откройте программное обеспечение ImageJ. Нажмите файл (ru) открыть для анализа изображение.
- Нажмите на левую самую Rэктангуular Selection Tool в пользовательском интерфейсе ImageJ. Очертите интересующую область (ROI) в
изображении с помощью мыши и нажмите на первую рентабельность инвестиций. - Переместите прямоугольный выделение с помощью
мыши прямо на следующий ROI и нажмите, чтобы пометить вторую рентабельность инвестиций. - Повторите предыдущий шаг, чтобы обозначить все другие ROIs.
- Нажмите
для генерации участков профиля для всех ROIs во всплывающем окне.
ПРИМЕЧАНИЕ: В это время автоматически активируется инструмент выбора прямой линии в пользовательском интерфейсе ImageJ. - Используйте инструмент выбора прямой линии, чтобы нарисовать базовые линии, чтобы определить закрытую область для каждого пика интереса.
- Активируйте инструмент wand, нажав на соответствующую иконку в пользовательском интерфейсе ImageJ. Нажмите внутри пика, чтобы отобразить результаты для всех пиков во всплывающем окне.
- Сделайте стандартную кривую аутентичного флавоноида на основе TLC, построив серые значения со ступени 7.1.5.7 против соответствующих концентраций флавоноидов со ступени 7.1.1. Затем рассчитайте доходность флавоноида интереса, произведенного в этом протоколе по полученной формуле.
- Высокопроизводительные жидкие хроматографии (HPLC) и жидкой хроматографии / масс-спектрометрии (LC/MS) анализы
- Обработка образцов от шага 7.1.1 последовательно через 0.45 мкм и 0.22 мкм фильтры.
- Загрузите образцы в систему HPLC/LC/MS (см. ТаблицуМатериалов) и разделите образцы на 30 градусов по Цельсию, используя столбец C18 (4,6 и 150 мм; т.д., 5 мкм) столбец. Выявите колонну на 1,0 м/мин градиентом 10 - 85% (v/v) ацетонитрила (ACN) в воде (0 - 10 мин, 10 - 25% ACN; 10 - 35 мин, 25 - 50% ACN; 35 - 45 мин, 50 - 85% ACN; 45 - 50 мин, 85 - 10% ACN; 50 - 60 мин , 10% ACN) и контролировать поглощение eluate от 200 до 800 нм. Выполните анализ LC/MS в отрицательном режиме иона с потоком азота сушки 10 л/мин при 300 градусах Цельсия и потоком газа оболочки 7 л/мин при 250 градусах Цельсия и собирайте данные с помощью встроенного программного обеспечения (см. ТаблицаМатериалов).
- Извлеките хроматографы одной волны для расчета пиковых областей образцов реакции и подлинных флавоноидных соединений с помощью программного обеспечения (см. ТаблицаМатериалов).
- Откройте программу квалификационный анализ и нажмите файл (ru) открытый файл данных. Выберите файл (ы), который будет проанализирован в окне файла открытых данных, и нажмите Open, чтобы открыть файл(ы).
- Нажмите на мышь в окне Chromatogram Results, а затемhromatograms Extract Cво всплывающем меню.
- Откройте поле для диагностики в областигроматограммы Extract C. В списке Тип, нажмите Другие хроматограммы. В комбо-коробке детектора выберите DAD1. Затем нажмите OK для отображения результатов HPLC в окне результатовhromatogram C.
- Нажмите на Mежегодный integration значок пристыкован в верхней части окнаHromatogram Результаты C. Нарисуйте базовую линию для пика, необходимого для ручного анализа интеграции с помощью мыши.
- Нажмите Посмотреть на исчисляйте: интеграция Пик Список для отображения результатов.
- Сделайте стандартную кривую аутентичного флавоноида на основе HPLC, построив пиковые области со ступени 7.2.3.5 против соответствующих концентраций флавоноидов со ступени 7.2.1. Затем рассчитайте доходность флавоноида интереса, произведенного в этом протоколе по полученной формуле.
- Проанализируйте данные MS для точной массы флавоноидных соединений с помощью программного обеспечения (см. ТаблицуМатериалов).
- Повторите шаги 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
- Нажмите значок Range Select на панели инструментов для результатов результатов Hromatogram.
- Выберите пик интереса. Нажмите на мышь в выбранном диапазоне и нажмите на Extract MS Spectrum во всплывающем меню, чтобы отобразить результаты в окне результатов MS Spectrum.
изображении с помощью мыши и нажмите на первую рентабельность инвестиций.
мыши прямо на следующий ROI и нажмите, чтобы пометить вторую рентабельность инвестиций.
для генерации участков профиля для всех ROIs во всплывающем окне.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H и FLS1 являются двумя важными ключевыми ферментами в преобразовании флаванона в флавонол в растениях, как показано на рисунке 1. Для разработки биосинтетической системы in vitro для производства флавонана из флаванона, Atf3h (Присоединение GenBank нет. NM-114983.3) и Atfls1 (Присоединение GenBank нет. Гены NM-120951.3 были клонированы из саженцев 4-недельного A. thaliana в прокариотическое выражение вектора pET-32a (я). Рекомбинантные плазмиды были преобразованы в E. coli BL21 (DE3), а белки синтеза были выражены после индукции IPTG, после чего последовало очищение с использованием агарозных осиniов Ni-IDA. Как показано на рисунке 2, очищенные белки синтеза показали высокую чистоту более 95% на 10% SDS-PAGE гель, которые были достаточно чистыми для создания в пробирке двухэнзимный каскад.
Рисунок 1: Схематическое представление для биосинтеза флавонала из флаванонаin vitro. F3H, флаванон 3-гидроксилаза; FLS1, флавонол синтаза 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Очистка рекомбинантных белков AtF3H и AtFLS1. Гены Atf3h и Atfls1 были клонированы из 4-недельных саженцев Arabidopsis thaliana в прокариотическое выражение вектора pET-32a (я) и выражены в Escherichia coli BL21 (DE3). Рекомбинантные белки были очищены через столбец хроматографии сродства, наполненный ранами агарозы Ни-МАР. Чистота была определена на 10% SDS-PAGE гель. M, белковые маркеры; 1, рекомбинантный белок AtF3H; 2, рекомбинантный белок AtFLS1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для создания двухэнзимного каскада с использованием очищенных рекомбинантных белков была подготовлена синтетическая система, как показано в таблице6. Чтобы определить, может ли эта система быть использована для преобразования флаванона в флавонол, NRN был добавлен в систему, и биосинтез KMF был обнаружен TLC и HPLC/LC/MS анализов. Как показано на рисунке 3A, на полиамидной пластине TLC появились два новых пятна. В одном месте было показано расстояние миграции, аналогичное дигидрокаэмферолу (ДХК), а в другом - к расстоянию КМФ. Дальнейший анализ HPLC и LC/MS показал, что новые химические вещества показали время удержания 11,91 мин и 20,16 мин, соответственно(рисунок 3B) и квазимолекулярный ионный пик «МЗЗ»- на м/з 287.0500 и 285.0500, соответственно (рисунок 3C ), которые были идентичны DHK и KMF, соответственно. Данные показывают, что KMF был произведен из NRN в этой системе и выход был выше, чем 34,94 мг / л.
Рисунок 3: Синтез КМФ от NRN в двухэнзимом каскаде. (A) Анализ продуктов реакции одного горшка полиамидT TLC. 1, стандарт NRN; 2, стандарт DHK; 3, стандарт KMF; 4, реакционная смесь. (B) HPLC анализ профилей реакции продуктов. NRN, DHK и KMF показали время удержания 18,74 мин, 11,91 мин и 20,16 мин, соответственно. (C) MS анализ профилей флавоноидов соединений в реакционных смесях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для дальнейшего определения того, может ли эта система in vitro быть использована для преобразования других флавонононов в соответствующие флавонол, эриодицитиол (ERD) был добавлен в систему, чтобы определить, может ли ERD быть преобразован в кверцетин (КРК). Как показано на рисунке 4A, два новых пятна на полиамидной пластине TLC отображаются расстояние миграции похож на дигидрокерцетин (DH) и КРК, соответственно. Анализы HPLC и LC/MS показали, что эти новые химические вещества выявили время удержания 10,03 мин и 16,23 мин, соответственно(рисунок 4B) и квазимолекулярный ионный пик (МЗЗ)- на уровне м/з 303.1000 и 301.1000, соответственно (Рисунок 4C) , что точно соответствовало тем, которые DH' и RC, соответственно. Данные показывают, что эта система может преобразовать ERD в КРк и выход был 25,55 мг/ л.
Рисунок 4: Производство ЗРК из ERD в синтетической системе биэнзимов. (A) Анализ реакционных продуктов полиамидНым ТЛК. 1, стандарт ERD; 2, стандарт ДГЗ; 3, стандарт КРК; 4, реакционная смесь. (B) HPLC анализ профилей реакции продуктов. ERD, ДХЗ и КРК показали время удержания 15,45 мин, 10,03 мин и 16,23 мин, соответственно. (C) MS анализ профилей соединений в реакционных смесях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целый ряд исследований сосредоточены на произвлечения флавонолов в связи с их потенциальным применением в здравоохранении и пищевой промышленности. Однако традиционная добыча растений с использованием органических растворителей и химического синтеза обладает недоношениями, которые ограничивают их использование в производстве флавонолов. Здесь мы сообщаем подробный метод для производства флавонана из флаванона в одном горшке путем создания в пробирке биензиматический каскад. Критические шаги в этом протоколе: 1) получение чистых рекомбинантных ферментов с высокой активностью и 2) создание одного горшка двухэнзиматической реакции каскада. Вообще говоря, экспрессия растительных генов в бактериях предпочитает формировать включение тела, что приведет к потере ферментной активности. Как мы знаем, некоторые пептиды, такие как TrxA и SUMO, помогают повысить экспрессию и растворимость рекомбинантных белков, выраженных в бактериях16. Поэтому будет полезно клонировать гены-мишени в плазмиды, содержащие эти теги выражения, такие как pET-32a (я) и pET SUMO (Шаг 3.2.3). Хорошо известно, что концентрация IPTG и температура индукции являются еще двумя ключевыми параметрами, влияющими на растворимость прокариотически выраженных белков16. Для дальнейшего снижения образования инклюзивного тела следует оптимизировать концентрацию IPTG и температуру индукции. Оптимальная концентрация IPTG и температура индукции в основном зависит от типа плазмидов и штаммов бактерий. В этом протоколе концентрация и индукция IPTG оптимизированы на уровне 0,2 мМ и 20 - 22 градусов соответственно (шаг 4.2.3). Кроме того, температура и глицерол являются двумя важными параметрами для поддержания стабильности и активности при очистке и хранении рекомбинантных ферментов. В этом протоколе крайне важно очистить рекомбинантные белки при 4 градусах по Цельсию (шаги 5,5 - 5,12), добавить 10% глицерола в раствор очищенных ферментов (Шаг 5.13), а также немедленно аликот и хранить раствор при -80 градусов по Цельсию (шаг 5.13). При создании каскада реакции в один горшок, рН и температура являются двумя жизненно важными параметрами. Очевидно, что слишком высокий рН вреден для преобразования, потому что ионы железа (Fe2 "),необходимый компонент для ферментной активности рекомбинантных F3H и FLS116,32,33, осаждаются формирование навоз феррообразного гидроксида при таком состоянии. Несмотря на то, что относительно более высокая температура способствует прогрессу ферментно-катализированной реакции, слишком высокая температура инактивирует фермент. Поэтому для преобразования крайне важно стабилизировать рН и температуру реакции. Наша предыдущая публикация устанавливает оптимальный рН и температуру на уровне 7,2 и 40 градусов по Цельсию, соответственно (Шаг 6)16.
Этот протокол может быть удобно изменен для биосинтеза ряда флавонолов из различных флавононов с использованием различных субстратов. В этом протоколе приводятся два примера. Как показано на рисунке 3, при добавлении NRN в качестве субстрата в эту систему, новые химические вещества были произведены. Анализы TLC и HPLC/LC/MS показывают, что новые химические вещества были DHK и KMF, и NRN был преобразован в КМФ в этой системе. Для дальнейшего укрепления уверенности в результатах спектральная характеристика 1H NMR (водород-1 ядерный магнитный резонанс), 13C NMR (углерод-13 ядерного магнитного резонанса), NOESY (Ядерный эффект воздействия Overhauser SpectroscopY), XRD (рентген порошковой дифракции), CHN анализатор и т.п. может потребоваться, чтобы засвидетельствовать наличие химических веществ в новой сущности. Аналогичным образом, ERD может быть успешно преобразован в КРк в этом двухэнзимомкаскадном каскаде(рисунок 4).
Существует важное ограничение для этого метода. Согласно известному биосинтетическому пути флавоноидов, флавонол может быть произведен этой системой из ароматической аминокислоты или ее производных вниз по течению. Например, KMF может быть произведен из p-coumaric кислоты серией ключевых ферментов, в том числе 4-кумаройлом:CoA-ligase (4CL), синкон синтаз (CHS), иомеразы изомеразы (CHI), F3H и FLS23. Аналогичным образом, КРК может быть произведенизна из кофеиновой кислоты с использованием той же панели ключевых ферментов (неопубликованные данные). Тем не менее, коэнзим A (CoA), АТФ и манонил-КоА должны быть включены в систему для преобразования р-кумаровой кислоты в KMF, что значительно увеличит себестоимость продукции. Таким образом, эта система, как правило, ограничивается конвертировать флаванон в дигидрофлавонол или флавонол. Кроме того, полная конверсия исходных материалов является еще одной проблемой. Для дальнейшего повышения эффективности этой системы, будущие исследования должны быть сосредоточены на скрининге ключевых ферментов с высокой активностью других растений, мутации генов, кодирующих ключевые ферменты, иммобилизации высокоактивных ферментов для инертных носителей, и создание лучшей буферной системы.
Эта одногоршковая синтетическая система биэнзима обладает очевидными преимуществами по сравнению с другими подходами к производству флавонала, такими как химический синтез, фабрика микробных клеток и экстракция растений с использованием органических растворителей16. Во-первых, время реакции очень короткое и требует всего 40 мин, поэтому эта производственная система экономит рабочую и рабочую силу. Во-вторых, в этой системе нет сложной физиологической регуляции, как это произошло на заводе микробных клеток и, кроме того, все компоненты чисты. Поэтому легко контролировать реакцию точно и, таким образом, удобно делать дальнейшую оптимизацию в будущем. В-третьих, поскольку эта система реакции содержит только простые химические вещества и очищенные рекомбинантные ферменты и генерирует только один крупный промежуточный, как показано на рисунке 3 и рисунке 4, ожидается, что легче очистить молекулы-мишени в этой системе, чем с клеточных заводов и заводов. В-четвертых, основными компонентами системы являются общие и дешевые химические вещества и прокариотически выраженные рекомбинантные ферменты, поэтому это очень экономически эффективно для этого метода для получения желаемых флавоноидов. В-пятых, благодаря простоте компонентов этой системы, легко масштабироваться для массового производства целевых флавоноидов, что свидетельствует об огромном потенциале индустриализации. Кроме того, эта система служит ориентиром для экономичного производства других вторичных метаболитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана Университетом Яночжоу специально назначенным профессором стартовых фондов, Jiangsu специально назначенный профессор стартап фонды, шесть талантов Пики проекта в провинции Цзянсу (Грант No 2014-SWYY-016), и проект, финансируемый Приоритетная академическая программа развития высших учебных заведений Цзянсу (ветеринарная медицина). Мы благодарим Центр тестирования Университета Яночжоу для HPLC и MS анализы флавоноидов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T.
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S.
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
