Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

الذرية البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC-EPs) لديها القدرة على إحداث ثورة في علاجات أمراض القلب والأوعية الدموية وتمكين خلق نماذج أكثر إخلاصا لأمراض القلب والأوعية الدموية. هنا، يتم وصف تغليف iPSC-EPs في البيئات الدقيقة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (3D) وتحليل كمي للإمكانات الأوعية الدموية لهذه الخلايا.

Abstract

الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي مصدر خلايا التكاثري خاص بالمريض يمكن أن يفرق في أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد استمدت من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة الخلايا الجذعية المتعددة القوى، التي يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا اللازمة لتجميع الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تقييم هذه الخلايا بدقة في بيئات ثلاثية الأبعاد، ولا يزال المقياس الكمي لإمكاناتها الأوعية الدموية بعيد المنال. هنا، يتم أولاً تحديد توليد وعزل iPSC-EPs عن طريق فرز الخلايا الفلورية المنشطة، تليها وصف للتغليف وثقافة iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين. هذه المصفوفة خارج الخلية (ECM) -محاكاة البيئة الدقيقة تشجع على استجابة الأوعية الدموية قوية; شبكات الأوعية الدموية تشكل بعد أسبوع من الثقافة. ويتم تحديد إنشاء خط أنابيب حسابي يستخدم برمجيات مفتوحة المصدر لتحديد كمية هذه الاستجابة الأوعية الدموية. تم تصميم خط الأنابيب هذا خصيصًا للحفاظ على البنية ثلاثية الجوانب للشبكة الشعرية لتحديد عدد الفروع ونقاط التفرع وطول الشبكة الإجمالي مع الحد الأدنى من مدخلات المستخدم.

Introduction

وقد استخدمت الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) وأنواع الخلايا البطانية الأولية الأخرى لمدة عقدين لنمذجة الأوعية الدموية تنبت والتنمية في المختبر1. هذه المنصات الوعائية وعد لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية والأنسجة على مستوى أمراض القلب والأوعية الدموية، ويمكن أن تقدم نظرة فسيولوجية في تطوير شبكات الأوعية الدموية البدائية2،3. على الرغم من أن مجال النمذجة الوعائية قد شهد تقدما كبيرا، فإن اختبار "المعيار الذهبي" الذي يمكن أن نموذج كميا وتقييم تطور الأوعية الدموية الفسيولوجية لا يزال بعيد المنال. معظم البروتوكولات المنشورة لا تلخص بشكل كاف محراب الأوعية الدموية لتشجيع تشكيل الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية أو ليس لديها طريقة لمقارنة كمية الإمكانات الأوعية الدموية لأنواع الخلايا المقدرة في ثلاثة أبعاد ( 3D).

العديد من نماذج الأوعية الدموية الحالية محدودة في قدرتها على تقليد محراب الأوعية الدموية الفسيولوجية. واحدة من الأكثر شيوعا المستخدمة في منصات المختبر هو البروتين الجيلاتيني القائم على خليط أنبوب تشكيل الاختبار. باختصار، يتم بذر HUVECs كخلايا واحدة على طبقة رقيقة من هلام الذي يتكون من البروتينات التي يتم حصادها من مصفوفة ساركوما المورين خارج الخلية (ECM)؛ في غضون يوم واحد إلى يومين، وHUVECs تجميع الذاتي في أنابيب بدائية4. ومع ذلك، تحدث هذه العملية في بعدين (2D) والخلايا البطانية (ECs) المستخدمة في هذا الفحص لا تشكل المغلقة، لومن جوفاء، وبالتالي الحد من الأهمية الفسيولوجية لهذه الدراسات. في الآونة الأخيرة، تم زراعة الخلايا الجذعية الإلكترونية والخلايا الداعمة (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) وpericytes) في بيئات دقيقة ثلاثية المدة تحاكي الهندسة المعمارية الليفية لـ ECM الأصلي، مثل الكولاجين أو هيدروجيلات الفيبرين5. لنموذج تطوير الأوعية الدموية في هذه البيئة الدقيقة،وتستخدم عادة الخرز البوليمرالمغلفة مع ECs 6. إضافة عوامل النمو الخارجية و / أو عوامل النمو التي تفرزها الخلايا الأخرى جزءا لا يتجزأ من hydrogel يمكن أن تحفز ECs، طلاء الخرز البوليمري، لتنبت وتشكيل تجويف واحد؛ ويمكن بعد ذلك حساب عدد وقطر البراعم والأوعية. ومع ذلك، هذه البراعم هي فريدة من نوعها ولا تشكل شبكة مغلقة ومتصلة كما هو الحال في الظروف الفسيولوجية، وبالتالي هو أكثر تذكرنا نموذج الأوعية الدموية الورم. كما تم استخدام الأجهزة الميكروفلويدية لتقليد محراب الأوعية الدموية وتعزيز تشكيل الأوعية الدموية في هيدروجيلات محملة بالجماعة الأوروبية7،8. عادة، يتم تطبيق عامل نمو الأوعية والتدرج إلى وسط ثقافة الخلية المتداولة للحث على هجرة الجماعة الأوروبية وتنبت. الـ ECs التي تشكل تجويف الأوعية المتقدمة حساسة لإجهاد القص الناجم عن تطبيق تدفق السوائل من خلال الجهاز الميكروفلويديك؛ وبالتالي، فإن هذه الأجهزة microfluidic التقاط المعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي لا يمكن الوصول إليها في النماذج الثابتة. ومع ذلك، تتطلب هذه الأجهزة قدرات تصنيع دقيق مكلفة.

والأهم من ذلك، جميع نماذج الأوعية الدموية الثلاثة (2D، 3D، microfluidic) تستخدم بشكل ساحق ECs الأولية، فضلا عن أنواع الخلايا الداعمة الأولية. لا يمكن تطوير الخلايا الأولية إلى علاج فعال للقلب والأوعية الدموية لأن الخلايا من شأنها أن تولد استجابة مناعية عند الزرع. وعلاوة على ذلك، HUVECs وأنواع الخلايا الأولية المماثلة ليست خاصة بالمريض ولا تلتقط تشوهات الأوعية الدموية التي تحدث في المرضى الذين يعانون من التصرف الوراثي أو الظروف الصحية الموجودة من قبل، على سبيل المثال، مرض السكري. ظهرت الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) في العقد الماضي كمصدر للخلايا التكاثرية الخاصة بالمريض التي يمكن تمييزها في جميع الخلايا الجسدية في جسم الإنسان9. وعلى وجه الخصوص، نُشرت بروتوكولات تحدد توليد وعزل الذرية البطانية المستمدة من iPSC (iPSC-EPs)10و11؛ iPSC-EPs ثنائية القدرة، وبالتالي، يمكن تمييزها أكثر في الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء / pericytes، لبنات بناء الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. وقد فصلت دراسة واحدة فقط بشكل مقنع تطوير الضفيرة الشعرية الأولية من iPSC-EPs في بيئة دقيقة 3D12; على الرغم من أن هذه الدراسة أمر بالغ الأهمية لفهم الجمعية iPSC-EP والتمايز في هيدروجيلات الطبيعية والاصطناعية، فإنه لم يقارن كميا طبولوجيا الشبكة من الأوعية الدموية الناتجة. وقد استخدمت دراسة حديثة أخرى نموذج حبة البوليمر ية لمقارنة تنبت HUVECs وECs المستمدة من iPSC5. لذلك، هناك حاجة واضحة لمزيد من توضيح آليات الإشارات الفيزيائية والكيميائية التي تنظم الأوعية الدموية iPSC-EP في البيئات الدقيقة 3D وتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا مناسبة للعلاج الإقفاري وأمراض القلب والأوعية الدموية النمذجه.

وفي العقد الماضي، تم تطوير خطوط أنابيب حسابية مفتوحة المصدر وخوارزميات هيكل عظمي مختلفة لتحديد طول شبكة الأوعية الدموية وترابطها ومقارنتهما. على سبيل المثال، وضعت Charwat وآخرون خط أنابيب يستند إلى فوتوشوب لاستخراج مرشحة، صورة binarized من شبكات الأوعية الدموية المستمدة من ثقافة مشتركة من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وECs في مصفوفة الفيبرين13،14. ربما أداة مقارنة الطبولوجيا الأكثر استخداما هو AngioTool, برنامج نشر على الانترنت من قبل المعهد الوطني للسرطان15; على الرغم من اعتماد البرنامج على نطاق واسع والإخلاص موثقة جيدا، ويقتصر البرنامج على تحليل هياكل تشبه السفن في بعدين وبرامج أخرى، بما في ذلك أنجيوسيس وويماسيس، تشترك في نفس الحد من الأبعاد16. وقد تم تطوير أجنحة برامج قوية مثل Imaris, Lucis, وMetamorph لتحليل طبولوجيا الشبكة من microvasculature المهندسة; ومع ذلك، هذه الأجنحة باهظة التكلفة لمعظم المختبرات الأكاديمية وتحد من الوصول إلى التعليمات البرمجية المصدر، والتي قد تعوق قدرة المستخدم النهائي على تخصيص الخوارزمية لتطبيقها المحدد. 3D تقطيع اللحم، وهو مفتوح المصدر التصوير بالرنين المغناطيسي / الحوسبة التصوير المقطعي حزمة، يحتوي على مجموعة أدوات النمذجة الأوعية الدموية التي يمكن تحليل فعال طبولوجيا شبكات الأوعية الدموية 3D17؛ ومع ذلك، يعتمد التحليل على وضع المستخدم يدوياً النقاط النهائية للشبكة، والتي قد تصبح مملة عند تحليل مجموعة بيانات كبيرة ويمكن أن تتأثر بتحيزات المستخدم اللاشعورية. في هذه المخطوطة، يتم وصف خط أنابيب حسابي يمكن أن يحدد مقدار شبكات الأوعية الدموية ثلاثية المدة بالتفصيل. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، يستخدم خط الأنابيب الحسابي المفتوح المصدر هذا ImageJ إلى الصور البؤرية المكتسبة قبل العملية لتحميل وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد في محلل هيكل عظمي. محلل الهيكل العظمي يستخدم خوارزمية رقيق محور وسيط ة موازية، وقد تم تطويره في الأصل من قبل Kerschnitzki وآخرون لتحليل طول واتصال شبكات osteocyte18; يمكن تطبيق هذه الخوارزمية بشكل فعال لتوصيف طول واتصال microvasculature المهندسة.

وإجمالاً، يحدد هذا البروتوكول إنشاء شبكات الأوعية الدموية الدقيقة في البيئات الدقيقة ثلاثية الجوانب، ويوفر خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر وخال ٍ من تحيز المستخدم لمقارنة الإمكانات الأوعية الدموية للـ iPSC-EPs بسهولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية وحلول الطلاء

  1. لإعداد محلول طلاء فيترونيكستين، تمييع فيتروينشينسين 1:100 في المالحة السالينة المخزنة بالفوسفات (DPBS) في دولبيكو.
    تحذير: بمجرد تخفيفه، لا ينصح بتخزين هذا الحل للاستخدام في المستقبل.
  2. عند تلقي الفينول خالية من الأحمر، عامل النمو خفض خليط البروتين الجيلاتيني (انظر جدولالمواد) من الشركة المصنعة، ذوبان على الجليد في 4 درجة مئوية حتى الخليط شفاف ة والسائل. الحفاظ على الخليط على الجليد في غطاء تدفق اللامينار، ماصة 75 درجة مئوية من الخليط في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.8 مل وتجميد في -20 درجة مئوية على الفور. يمكن تخزين هذه aliquots لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    تحذير: يصبح خليط البروتين الجيلاتيني هذا لزجًا جدًا عند الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة، وسوف يترسخ في درجات حرارة أعلى. الحفاظ على هذا الحل الجليد الباردة.
  3. لإعداد هذا الخليط للطلاء، إذابة aliquot 75 ميكرولتر على الجليد وتمييع مع 6 مل من الجليد البارد دولبكو تعديل النسر المتوسط: خليط المغذيات F-12 (DMEM/F12). هذا الحجم المعدة يكفي لمعطف لوحة 12 جيدا.
  4. إعداد محلول مخزون 100 ملغ / مل من حمض الاسكوربيك المغنيسيوم-2-الفوسفات (مسحوق أبيض مُلَفِّد) في الماء النقي جداً بإضافة 500 ملغ من المسحوق إلى 5 مل من الماء في قارورة تألق زجاجية 10 مل. تحريك مع شريط ضجة حتى الحل شفافتماما (وهذا قد يستغرق ما يصل إلى ساعة). يمكن تخزين هذا الحل عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  5. إنشاء مخزون 10 m من CHIR99021 (CHIR) عن طريق حل 10 ملغ من مسحوق اللوفيل في 1.9928 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل ودافئة في 37 درجة مئوية حبة (أو ماء) حمام حتى الحل شفاف. Aliquot في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.8 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  6. إنشاء مخزون 10 m من Y-27632، مثبط روك (ROCKi)، عن طريق حل 10 ملغ من مسحوق اللوفيل في 3.1225 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل ودافئة في 37 درجة مئوية حبة (أو ماء) حمام حتى الحل شفاف. Aliquot في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.8 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  7. لإعداد الأساسية 8 (E8) المتوسطة، ذوبان المكملات الغذائية المجمدة، إضافة إلى زجاجة 500 مل من المتوسطة القاعدية، وتعقيم فلتر. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    تحذير: من المهم جدا عدم تسخين هذه الوسيلة عند 37 درجة مئوية، حيث أن البروتينات في التركيبة المتوسطة قد تتحلل مع الاستخدام لفترات طويلة. بدلا من ذلك، والحفاظ على هذه الوسيلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  8. لإعداد المخزن المؤقت الفرز، إضافة 1.33 مل من 7.5٪ الزلال المصل البقري (BSA) في DPBS و 200 ميكرولتر من 0.5 م إيثيلينديامينيتراسيتيك حمض (EDTA) إلى 48.5 مل من DPBS لخلق حل نهائي من 0.5٪ BSA و 2 MM EDTA.
  9. لإعداد لاسر القاعدية، إضافة 300 درجة مئوية من 100 ملغ / مل حمض الاسكوربيك المغنيسيوم-2-الفوسفات و 5 مل من الجلوتاماكس إلى 500 مل من DMEM المتقدم / F12. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  10. لإعداد نمو الخلايا البطانية المتوسطة-2 (EGM-2)، وذوبان المكملات الغذائية وإضافة إلى زجاجة 500 مل من المتوسطة القاعدية. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  11. لإعداد العازلة حجب، إضافة 500 ملغ من الزلال المصل البقري اللافي (BSA) و 50 درجة مئوية من كاشف استحلاب (انظر جدولالمواد) إلى 48 مل من DPBS. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل لضمان أن BSA لا تكتل وفصل في وقت لاحق عن الحل.

2- ذوبان الـ iPSCs وصيانتها وتمريرها

  1. قبل إذابة قارورة iPSC المحفوظة بالتبريد، قم بتغليف بئر واحد من طبق من 6 آبار مع 1 مل من محلول فيتروينشين (تم إعداده كما هو موضح في الخطوة 1.1). حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لا تدع هذا الطلاء الهواء الجاف قبل إضافة E8 المتوسطة إلى لوحة.
  2. وللذوبان في الحاويات الصغيرة والأمعاء، استرجع قارورة محفوظة بالتبريد من حاويات تخزين النيتروجين السائل وذوبانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية إلى أن يبقى بلورة صغيرة من الجليد. بعناية (إسقاط) نقل محتوى قارورة ذاب إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل تحتوي على 8 مل من الجليد الباردة DMEM /F12. اغسل القارورة المذابة بإضافة 1 مل من DMEM/F12 المثلج ة والباردة لتقليل فقدان الخلايا. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  3. في انتظار الطرد المركزي، يستنشق حل فيتوريكتين وإضافة 1 مل من E8 المتوسطة (أعدت كما هو موضح في الخطوة 1.6) إلى البئر. ثم قم بإزالة DMEM/F12 supernatant من الأنبوب المخروطي المُطارد بالطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من وسط E8. نقل الخلايا إلى لوحة المغلفة حديثا، ويجري على يقين من إثارة التعليق لمنع المستعمرات من التكتل عند البذر.
  4. عادة ما يكون هناك موت كبير في الخلايا بعد ذوبان الجليد. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة المتوسط واستبداله بوسط E8 طازج.
    ملاحظة: حتى في ظل الظروف المثلى، تميل الـ iPSCs إلى التعافي بشكل سيء من الحفظ بالتبريد. من المستحسن أن تُحفظ بالتبريد 6 آبار شبه مُتَرَكَّة للبذر في المستقبل في بئر واحد 6. وجود حطام الخلية أمر طبيعي لأول 2-3 أيام أثناء استعادة الخلية.
  5. استبدل E8 المتوسطة يوميًا حتى تصبح الخلايا جاهزة للتمرير (70%-80% من الملاءمة).
  6. للمرور، قم أولاً بإعداد الآبار المغلفة بالمختبر (كما هو موضح في الخطوة 2.1).
    1. مرة واحدة الآبار المغلفة فيتورينيكستين جاهزة (حوالي 1 ح)، يستنشق E8 المتوسطة من جيدا ليتم تمريرها وغسل هامرتين مع 1 مل من DPBS. حضانة مع 1 مل من 0.5 mM EDTA لمدة 5-7 دقيقة في 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة، قم بإزالة محلول الفيتوريكتين من البئر المطلي حديثًا واستبداله بـ 1-2 مل من وسط E8.
    2. إزالة الحل EDTA من الآبار ليتم تمريرها وفصل المستعمرات عن طريق غسل بلطف مرة أو مرتين مع 1 مل من E8. نقل 75-200 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى الآبار المغلفة حديثا E8 التي تحتوي على، وتحريك لوحة لضمان تغطية حتى، ووضعها في الحاضنة على الفور.
      تحذير: وقت الحضانة لمفرزة iPSC تعتمد على خط الخلية; من المستحسن أن يقوم مستخدم هذا البروتوكول باختبار نطاق من الأوقات عند توسيع خط iPSC المتلقاة/التي تم إنشاؤها بشكل كاف. 75 درجة مئوية من تعليق الخلية عموما النتائج في 4 أيام بين الممرات; 150 ميكرولتر أو أكثر يؤدي إلى 2-3 أيام بين الممرات.

3- توليد البطانة المشتقة من iPSC (الشكل1).

  1. عند الحفاظ على iPSCs، تأكد من أن المستعمرات مضغوطة بشكل جيد وأن هناك عدد قليل من الخلايا المتمايزة في الثقافة. إذا بدأت المستعمرات في الاتصال ببعضهم البعض، فإن الخلايا على الأرجح مُلمعة للغاية وتحتاج إلى المرور على الفور.
  2. عندما تكون iPSCs 70% - 80% مُمتلّقة، قم بطلاء طبق من 24 بئرًا بخليط البروتين الجيلاتيني (تم إعداده كما هو موضح في 1.2/1.3). ماصة 250 درجة مئوية من هذا الخليط في كل بئر والحفاظ على 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. أثناء الحضانة 1-h أعلاه، قم بإزالة المتوسطة E8 وY-27632 من الثلاجة والفريزر، على التوالي. مرة واحدة E8 المتوسطة وY-27632 تصل إلى درجة حرارة الغرفة، وإعداد E8 + ROCKi عن طريق إضافة 13 ميكرولتر من 10 μM Y-27632 إلى 13 مل من E8 في أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل.
  4. إزالة المتوسطة E8 من الآبار iPSC، وغسل مرتين مع 1 مل من DPBS، ومن ثم حضانة مع 0.5 mM EDTA لمدة 5-7 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد فترة الحضانة، قم بإزالة EDTA والقص بسرعة الخلايا في تعليق خلية واحدة مع طرف ماصة P1000 مع 1 مل من E8 + ROCKi المتوسطة.
  5. عد الخلايا مع مقياس الهيموكيتومات. للتعليق الذي قد يحتوي على الملايين من iPSCs، أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 180 درجة مئوية من الأزرق التريبان. تحديد عدد الخلايا الإجمالية في تعليق الخلية الواحدة.
  6. نقل 0.432 × 106 إلى 1.296 × 106 خلايا (104 إلى 3 × 104 خلايا / سم2)إلى المتوسطة E8 + ROCKi المتبقية. إزالة طلاء خليط الجيلاتين من لوحة 12 جيدا المغلفة حديثا وإضافة 500 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى كل بئر، وضمان أن الخلايا موزعة توزيعا جيدا ولا تشكل كتل صغيرة.
    ملاحظة: هذا النطاق من الكثافات الأمثل للتمايز من الخلايا الإيجابية CD34; ومع ذلك، هذه الكثافات البذر تعتمد على خط الخلية وقد تحتاج إلى أن تكون الأمثل من قبل مستخدم هذا البروتوكول.
  7. بعد 24 ساعة من الثقافة، استبدال المتوسطة مع 500 درجة مئوية من E8 المتوسطة الطازجة. حضانة لمدة 24 ساعة إضافية في ظل نفس الشروط.
  8. إزالة المتوسطة E8 واستبدالها مع لاسر باسال تستكمل مع 6-12 درجة مئوية من CHIR99021. يتم تعريف هذه النقطة الزمنية كـ D0 من التمايز. بعد 24 ساعة من الثقافة، استبدال مع نفس الخلية وسط الثقافة.
    ملاحظة: كما هو موضح سابقاً، يعتمد مقدار CHIR99021 المضافة إلى هذه الوسيلة على خط iPSC المستخدم. يرجى اختبار مجموعة من تركيزات CHIR99021 لضمان تحقيق أفضل النتائج.
  9. بعد 48 ساعة من الحضانة مع CHIR99021، يستعاض عنها بـ 1 مل من لاسر باسال.
  10. استبدل المتوسط يومياً بـ 2 مل من لاسر باسال لمدة 2-3 أيام إضافية. في هذه المرحلة (D5 من التمايز)، فإن نسبة كبيرة من هذه الخلايا سوف تعبر عن CD34 ويمكن وصفها بأنها ذرية بطانة. ويرد مخطط لهذا البروتوكول مع نتائج تمثيلية في الشكل 1 ووصفها بالكامل من قبل المحققين الذين نشروا لأول مرة هذا الأسلوب 11،19.
    ملاحظة: يمكن تمييز هذه الذرية البطانية بشكل أكبر على طول سلالة بطانة الرحم (35٪-99٪) أو سلالة العضلات الملساء (1٪-65٪). تختلف كفاءة التمايز حسب نوع طلاء ECM ووسيط زراعة الخلايا المستخدم أثناء التمايز 20.

4. FACS من الذرية البطانية

  1. قبل فصل الخلايا المتمايزة D5/D6، قم بإعداد المخزن المؤقت للفرز كما هو موضح في الخطوة 1.8 واحتفظ بالثلج.
  2. احتضان الخلايا المتمايزة مع 250 درجة مئوية من حل مفرزة الخلية لكل بئر (انظر جدولالمواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. فصل الخلايا مع طرف ماصة P1000 في تعليق خلية واحدة في حل مفرزة الخلية. دمج خليط حل مفرزة الخلية في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  4. إزالة supernatant وإعادة تعليق في 200 μL من الجليد الباردة فرز العازلة (أعدت كما هو موضح في الخطوة 1.7. أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد CD34-PE المركز إلى تعليق المخزن المؤقت لفرز الخلايا والحضانة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  5. إعادة تعليق في 5 مل من الجليد الباردة فرز العازلة. قم بتصفية هذا التعليق من خلال مصفاة الخلية مع غطاء 40 درجة مئوية قبل وضعه على فارز.
  6. على قناة الفلورسنت المناسبة، فرز 10،000 الخلايا التي لم يتم تسمية مع جسم مضاد الفلورسنت. بوابة منطقة بكثافة الفلورسنت عالية التي لا تحتوي على أي من هذه الخلايا 10،000 (الشكل1D). وهذا سيكون بمثابة سيطرة سلبية.
  7. تشغيل النموذج الذي يحتوي على iPSC-EPs المسمى مع حل الفلورسنت والبدء في الفرز. يتم التعبير عن CD34 بشكل كبير في هذه الذرية البطانية ويتم فصلها بسهولة عن السكان الرئيسيين. بعد الفرز، نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. إزالة supernatant.
    ملاحظة: إذا كان الحل في أنبوب أكبر من أنبوب الطرد المركزي الصغير (على سبيل المثال، أنبوب البوليسترين 5 مل المستخدمة عادة في العديد من بروتوكولات FACs)، إعادة تعليق بيليه الخلية فرزها في 1 مل من المخزن المؤقت ونقل هذا الحل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
    1. اختياري: إذا كان من المرغوب فيه مزيد من توصيف iPSC-EP، أضف أجسام مضادة أساسية أخرى (على سبيل المثال، CD31-APC) في وقت واحد مع CD34-PE. تأكد من تقليل التحدث المتبادل بين قنوات الفلورسنت المختلفة.

5. تغليف وثقافة طويلة الأجل من هيدروجيلات الكولاجين المحملة iPSC-EP

  1. إعداد وسيط البذر عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من 10X المتوسطة 199 إلى 400 ميكرولتر من متوسط النمو البطانية (EGM-2) تستكمل مع 10 μM Y-27632 في 1.8 مل الطاردة الدقيقة ووضع أنبوب على الجليد.
    ملاحظة: في حين يتم تثبيط استخدام المضادات الحيوية لثقافة الخلايا الجذعية والحفاظ على الخلايا المتمايزة، ينصح الجرعة مع القلم / العقدية بعد الفرز لأنه من الصعب ضمان العقم في بيئة الفرز (وهذا هو أكثر حتمية إذا تم تقاسم فارز بين العديد من المختبرات).
  2. إزالة جميع supernatant من تعليق الخلية وإضافة 200 ميكرولتر من EGM-2 تستكمل مع 10 μM Y-27632. نقل تعليق الخلية إلى البذر المتوسطة ومزيج بقوة.
  3. أضف 350 ميكرو لتر من الكولاجين إلى الحل المعد في الخطوة 5.2 واخلطه جيداً. وسوف يصبح الحل أصفر شاحب.
    ملاحظة: التركيز النهائي للكولاجين يمكن أن يكون لها تأثير كبير على تشكيل الضفيرة الشعرية. ويفترض هذا البروتوكول أن الكولاجين قد تم توفيره عند 10 ملغم/مل وأن الهيدروجيلات لها تركيز نهائي قدره 3.5 ملغم/مل. ضبط هذه الأحجام لتحقيق تركيز الكولاجين النهائي. من المستحسن تقييد تركيز الكولاجين النهائي من 2 ملغ / مل إلى 4 ملغ / مل.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1M إلى الحل المعد في 5.3 ومزيج جيدا، وتجنب إدخال فقاعات الهواء. وسوف يصبح الحل الوردي مشرق.
  5. ماصة 56 ميكرولتر من محلول خلية الكولاجين تحييد أعدت في 5.4 في الآبار الفردية من 96 جيدا عالية الانخفاض مرفق U-أسفل خلية لوحة الثقافة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل إضافة وسائل الإعلام، تحقق من أن الخلايا قد تم توزيعها بالتساوي عن طريق فحص العينات مع المجهر brightfield.
  6. إعداد 1 مل من وسط الثقافة يتكون من EGM-2 تستكمل مع 10 μM Y-27632 و 50 نانوغرام /مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من كل محلول مخزون إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد خلط جيدا، ماصة 100 درجة مئوية من هذه الخلية الثقافة المتوسطة على هيدروجيلات المحملة بالخلايا. نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية للثقافة على المدى الطويل.
  7. استبدال وسط الثقافة يوميا، مضيفا عوامل نمو وعائية إضافية أو مثبطات جزيء صغير كما يمليها هدف الدراسة. لإزالة الوسائط على النحو الأمثل، قم بإمالة اللوحة واستخدم طرف P100 لإستقاسقاء الوسائط برفق دون إزعاج الهيدروجيل.

6. تحديد، وتلطيخ المناعة، والتصور من الشبكات الوعائية المستندة إلى EP

  1. بعد أسبوع واحد من الثقافة، إضافة 250 درجة مئوية من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) الحل إلى لوحة 48 جيدا. ملء العديد من الآبار كما أن هناك هيدروجيل. إزالة المتوسطة من هيدروجيلز (PFA) واستخدام ملاقط ذات رؤوس دقيقة لنقل هيدروجيلات إلى PFA التي تحتوي على الآبار. حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة PFA عن طريق الغسيل بسرعة مع PBS.
  2. Permeabilize عن طريق إضافة 250 درجة مئوية من 0.5٪ من السطحي غير الأيونية (انظر جدولالمواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل مرتين مع 250 درجة مئوية من PBS تستكمل مع 300 مل غليسين. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل خطوة الغسيل لضمان إزالة المنظفات الزائدة. كتلة عن طريق غمر هيدروجيلات في 250 درجة مئوية من العازلة حجب لمدة 30 دقيقة.
  3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المطلوبة المخففة في حظر العازلة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. على سبيل المثال، إذا تمييع المناعة مع الفيلويدين وVE-كادرين، تمييع 1:40 و 1:200، على التوالي، في حظر المخزن المؤقت.
  4. في اليوم التالي، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل مرتين مع الكاشف الاستحلاب 0.5٪ في DPBS. تغطية مع رقائق الألومنيوم وحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع (على سبيل المثال، 1:200 اليكسا فلور 488 في PBS) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسل مرتين مع الكاشف استحلاب 0.5٪ في DPBS. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل خطوة الغسيل لضمان إزالة الفلوروفورمجانا مجانا.
  6. لتصور نوى الخلايا، تمييع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) 1:10000 في PBS وإضافة إلى العينة (العينات).
    1. الحضانة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسل مرتين مع PBS. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل خطوة الغسيل لضمان إزالة الفلوروفورمجانا مجانا.
  7. نقل العينات إلى تكوين الأوعية الدموية أو طبق بيتري أسفل الزجاج باستخدام ملاقط ذات رؤوس دقيقة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين تحت هيدروجيل.
  8. صورة على مجهر البؤري عن طريق الحصول على z-مكدسات التي تمتد من أسفل إلى أعلى العينة. تأكد من أن الكاشف غير مشبعة وأن أقل التكبير المتاحة هي في الاستخدام (حقل كبير من وجهة النظر هو مرغوب فيه).
    ملاحظة: للمعالجة المستقبلية، تأكد من حفظ مكدسات z مع ضغط الحد الأدنى (على سبيل المثال، .czi).

7. استخدام خط الأنابيب الحسابي لتحليل ومقارنة طبولوجيا شبكة الأوعية الدموية

  1. فحص كل كومة z للتأكد من أن شرائح تحتوي على السفن فقط. افتح مكدس z في ImageJ وحسّن التباين بالنقر فوق صورة > ضبط > السطوع/التباين. وقد تم الآن ترسيم حدود السفينة بشكل واضح، كما أن مستوى الخلفية قد تم تقليله إلى أدنى حد. في كثير من الأحيان، لا تتطابق أبعاد z مع أبعاد x/y. لتصحيح ذلك، انقر فوق صورة > ضبط > الحجم وتغيير عدد شرائح z بحيث تكون المسافة بين كل شريحة مساوية لبكسل واحد في x/y. سيتم استيفاء ImageJ تلقائيًا. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، ستظهر وحدات التخزين ثلاثية الدناصعة النهائية مضغوطة.
    تحذير: سوف تهاجر ECs نحو حواف الجل وسوف تشكل مستعمرات صغيرة مرصوفة بالحصى. في حين أن هذه مفيدة لتقدير حدود هيدروجيل، فإنها سوف تتداخل مع تحليل الصورة النهائية وينبغي حذفها.
    ملاحظة: ImageJ هو برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر القائم على جافا الذي تم تطويره بالتنسيق مع المعاهد الوطنية للصحة ومختبر الأجهزة البصرية والحسابية. من المستحسن لتحميل فيجي، والتي هي ببساطة ImageJ المجمعة مع الإضافات مفيدة (https://fiji.sc/).
  2. في ImageJ، قم بتمويه الصورة في 3 أبعاد بالنقر فوق معالجة > المرشحات > Gaussian Blur 3D ثم قم بوضع قيم سيغما في جميع الأبعاد الثلاثة إلى 2.0 (قد تحتاج هذه القيمة إلى تعديل هامن قبل المستخدم النهائي).
  3. في ImageJ، انقر فوق عملية > ثنائي > جعل ثنائي ثم حدد خوارزمية العتبات المناسبة. خوارزمية عتبة الانتروبيا عبر القصور الغذائي التي وضعتها لي وآخرون فعالة في فصل السفن عن الخلفية21. حساب عتبة لكل صورة وتعيين الخلفية إلى "الافتراضي".
  4. في ImageJ، قم بإزالة الضوضاء الزائفة وملء "الثقوب" في التجويف بالنقر فوق عملية > الضوضاء > إزالة القيم الخارجية.
    ملاحظة: إزالة "مشرق" outliers سوف تملأ ثقوب صغيرة في السفن المتصلة; إزالة "الظلام" outliers إزالة الخلايا الميتة. ويختلف حجم دائرة نصف قطر هالاوة الإزالة استنادا إلى تكبير وحجم الأوعية. بالنسبة للصور التي تم الحصول عليها بهدف حقل عريض 512 × 512 بكسل، فإن الراديوي عادة ما يتراوح بين 4-6 بكسل.
  5. معالجة كافة الملفات الخام (على سبيل المثال، ملحق czi) وتحويلها إلى ملفات .tif قبل الانتقال إلى الخطوة 7.6. للمساعدة في هذه المعالجة، تم إرفاق نص ImageJ ، "Binarize وFilter.ijm" بهذه المخطوطة.
  6. حفظ ملفات .tif التي تمت معالجتها في نفس المجلد مثل الملف "BatchProcessSkeleton.m"، المتوفرة للتنزيل في المخطوطة. هذا السيناريو، التي وضعتها المؤلفين، يدعو الوظائف التي نشرتها فيليب Kollmannsberger22 وتجري بعض التلاعب ملف إضافية.
  7. تحميل وفك جميع الملفات المرتبطة بالوظيفتين الرئيسيتين "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) و "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). حفظ كافة الدالات في نفس المجلد مثل مكدس z معالجة المفتوحة.
  8. افتح بيئة حوسبة رقمية متعددة النماذج (راجع جدولالمواد) وانتقل إلى المجلد حيث تم حفظ كافة الملفات الموضحة أعلاه.
  9. تشغيل "BatchProcessSkeleton.m" إما عن طريق كتابة BatchProcessSkeleton في إطار الأوامر أو عن طريق فتح البرنامج النصي ثم الضغط على الزر تشغيل (السهم الأخضر الذي يواجه اليمين) في المحرر.
    ملاحظة: لتحليل مجموعة بيانات كبيرة مع أمر واحد تأكد من أن السلسلة داخل الدالة dir في السطر 6 يحتوي على علامة نجمية (على سبيل المثال، '*.tif'). وإلا، استبدل العلامة النجمية باسم الملف إذا كان تحليل ملف واحد مرغوباً فيه.
  10. سيختلف طول الوقت الذي سيستغرقه هذا البرنامج النصي لتنفيذه بشكل كبير استنادًا إلى القدرة الحاسوبية المتوفرة. من المستحسن إجراء هذا التحليل على جهاز كمبيوتر مع 8 غيغابايت على الأقل من ذاكرة الوصول العشوائي بحيث يمكن للمستخدم الوصول إلى البرامج الأخرى أثناء تشغيل البرنامج النصي.
    تحذير: على الرغم من عدم الضرورة القصوى، فإن الرسم البياني للاكتساب البؤري الأصلي (باللون الرمادي) وتراكب مع مصفوفة الصورة هذه مع مصفوفة الهيكل العظمي (باللون الأحمر) يمكن أن يساعد في تقييم أداء خوارزمية الهيكل العظمي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للقارئ إنشاء رسم بياني العقدي، على النحو الذي ينفذه Kollmannsberger وآخرون، لتقييم دقة تحليل الشبكة. إنشاء كلا الرسمين البيانيين، على الرغم من أن مفيدة، سوف تزيد بشكل كبير وقت تشغيل البرنامج النصي وتتطلب ذاكرة إضافية; إذا كان المستخدم يتطلب ببساطة تحليل طبولوجيا النهائي ولا يريد أن تصور مجموعة البيانات، ببساطة التعليق على الخطوط 44 إلى 61 (الرسم البياني الهيكل العظمي) وخطوط 104 إلى 143 (الرسم البياني الطبولوجيا).
  11. عند الانتهاء، تحتوي مصفوفة البيانات، المرئية في مساحة العمل، الآن على البيانات التي تمت معالجتها. انقر نقراً مزدوجاً فوق بيانات ثم افتح هذه الخلية في محرر متغير.
    1. لاحظ أن هذه المصفوفة سوف تحتوي، من اليسار إلى اليمين: 1) اسم الملف، 2) عدد العقد (نقاط الفرع + نقاط النهاية)، 3) نقاط الفرع، 4) وصلات (أي السفن)، 5) طول الشبكة (بما في ذلك السفن المعزولة)، و 6) عدد الشرائح الموجودة في كومة z. حفظ هذه البيانات كملف .csv والتصدير لمزيد من التحليل إلى أي برنامج من الاختيار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد التمايز (الشكل1)،FACS وتغليف iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين، وسوف تبقى الخلايا عادة تقريب لمدة 24 ساعة قبل البدء في الهجرة وتشكيل التجويف الأولي. بعد حوالي 6 أيام من الثقافة، سوف تكون الضفيرة الشعرية البدائية مرئية فيهيدروجيل عندما ينظر إليها مع المجهرية برايتفيلد (الشكل 2). بعد تصوير هيدروجيلات ثابتة وملطخة بالخلايا على مجهر بؤري (فيلم1، فيلم تكميلي1)، يتم تحويل الصور المعالجة مسبقًا إلى هيكل عظمي يتيح تحليل الطول الكلي للشبكة واتصالها. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه التدابير الكمية لتحديد مجموعة الشروط المثلى لإنتاج شبكات الأوعية الدموية القوية.

يسمح هذا البروتوكول بتطوير الضفيرة الشعرية ثلاثية الأبعاد القوية التي تستجيب للإشارات الفيزيائية والكيميائية المحلية. في العمل السابق، وقد ثبت أن هذا التكوين الشبكة لتكون حساسة لكثافة المصفوفة، وصلابة المصفوفة، وتثبيط مصفوفة metalloprotease، ونوع وتركيز الميتوجينات الوعائية المختلفة20،23.

Figure 1
الشكل 1: توليد الـ iPSC-EPs من الخلايا الجذعية متعددة القوى. (أ) WiCell 19-9-11 iPSCs، التي ملطخة إيجابية لOct4، تم استزراعها في E8 المتوسطة تكملها 10 μM Y-27632 ROCK المانع ل48 ح. (ب) ثم تم حث iPSCs مع 6 ميكرومتر من CHIR99021 في وسط بازل ل48 ساعة، وعند هذه النقطة الخلايا كانت إيجابية لBrachyury، علامة mesoderm. (ج) تم زراعة الخلايا بشكل أكبر في وسائل الإعلام الباسلة لـ LaSR حتى عبّروا عن CD34، وهي علامة للذرية البطانية. (D) ما يقرب من 15٪-25٪ من الخلايا المتمايزة أعرب CD34. جميع القضبان مقياس تمثل أطوال 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توليد وتحليل شبكات الأوعية الدموية iPSC-EP في هيدروجيلات الكولاجين. (أ) مقطع عرضي من البيئة الدقيقة ثلاثية الجوانب المستخدمة في هذا التفتيش لتعزيز تكوين شبكة الأوعية الدموية من iPSC-EPs. يتم بذر هيدروجيل الكولاجين العائم مع iPSC-EPs ويتعرض لEGM-2 مع 50 نانوغرام /مل VEGF وجرعة زمنية من Y-27632. (ب) الضفيرة الشعرية الناتجة متفرعة للغاية ومترابطة، كما تصور عن طريق تلطيخ مع F-أكتين (سماوي). يتم إنشاء الصورة البينازية، المعروضة على اليسار، عن طريق المعالجة المسبقة باستخدام ImageJ. ثم يتم تحليل هذا z-المكدس عن طريق خوارزمية وضعت سابقا، والتي هياكل عظمية الشبكة (كما هو موضح في مجموعة من الخطوط الحمراء رقيقة) ومن ثم يحلل طبولوجيا الشبكة للفروع (الأصفر)، ونقاط النهاية (الأزرق)، والسفن المعزولة (الأسود)، ومتصلة السفن (الأحمر). شريط مقياس يمثل طول 100 م (C) التغيرات المورفولوجية من هيدروجيلات الكولاجين المحملة بـ iPSC-EPs: 24 ساعة بعد البذر، وiPSC-EPs لا تزال كروية وضمن 96 ساعة تأخذ تدريجيا على النمط الظاهري أكثر ممدود. ينتج ثقافة بعيدة في اجتماع من [لومن-بووند] [ف-كثرين] شبكة, بما أنّ يبدي في ال [إينت] في ال [144-ه] وقت نقطة. تمثل أشرطة المقياس أطوال 400 درجة مئوية. الأخضر = VE-Cadherin، الأحمر = F-أكتين، والأزرق = DAPI. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Movie 1
فيلم 1: Z-كومة من الأوعية الدموية ولدت FRom iPSC-EPs. تم إصلاح شبكات الأوعية الدموية، ملطخة F-أكتين، وتصور عن طريق الحصول على z-مكدسات على المجهر البؤري. تم الحصول على شرائح على فترات 17 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

تكميلية الفيلم 1: تقديم 3D من السفن. تم إصلاح شبكات الأوعية الدموية، ملطخة F-أكتين (الأحمر) وVE-كادرين (الأخضر)، وتصور عن طريق الحصول على z-مكدسات على المجهر البؤري. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتضمن هذا البروتوكول ثقافة الخلايا على المدى الطويل في ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا: E8، LaSR Basal، وEGM-2. ولذلك، ينبغي توخي الحذر الشديد لتعقيم جميع المواد بشكل مناسب. بالإضافة إلى ذلك، يجب ارتداء معاطف المختبر والقفازات التي يتم تنظيفها بالإيثانول دائمًا عند العمل في غطاء تدفق اللامينار في المختبر. من المستحسن أن اختبار في كثير من الأحيان لتلوث الميكوزالات; إذا لوحظت كمية كبيرة من الحطام أثناء ثقافة iPSC أو لوحظ انخفاض مفاجئ في كفاءة التمايز، فإن تلوث الميكوزلا هو السبب المحتمل. وتميل الـ iPSC-EPs المتولدة عن هذا البروتوكول إلى إيداع كمية كبيرة من نظام إدارة المحتوى في المؤسسة، مما يطيل وقت التفكك ويتسبب في فصل تعليق الخلية الواحدة إلى كتل صغيرة. لا تستخدم تريبسين-EDTA (0.25٪)، لأن الحل قد يعطل epitopes CD34 على iPSC-EPs. ومع ذلك، قد العلاج مع محلول الكولاجين / ديسباسي إزالة ECM المودعة وتخفيف التفكك مع حل مفرزة الخلية القياسية. بعد تفكك واسع النطاق، قد تبقى بعض كتل صغيرة من الخلايا وECM. إزالة هذه الكتل مع طرف ماصة P100، كما أنها من المرجح أن تسد مصافي الخلايا أو تتداخل مع FACS.

الخلايا الجذعية متعددة القوى حساسة للانفصال وسوف تخضع لالمبرمج في تعليق خلية واحدة ما لم يتم إضافة مثبط روك (عادة Y-27632) إلى المتوسط24. كما أن الـ iPSC-EPs حساسة للانفصال؛ بما في ذلك Y-27632 في 10 μM لأول 24 ساعة من الثقافة أمر لا بد منه لزيادة بقاء الخلية وانتشارها. ولذلك، فمن الأهمية بمكان أن يتم تضمين مثبط اتوروك في كل من هيدروجيل والوسط المحيط مباشرة بعد FACS. كما أن كثافة البذر في المجالات الاقتصادية والبيئية يؤثر انتهاج الأوعية وحجم الشبكة الإجمالي. بشكل عام، تركيز 500،000 خلية / مل إلى 3 ملايين خلية / مل هو مجموعة مناسبة من كثافات البذر. زيادة أخرى في كثافة البذر غالباما يؤدي إلى الضغط هيدروجيل وموت الخلايا.

وقد تم العثور على كثافة البروتينات الهيكلية ECM أن يكون لها تأثير كبير على تطوير microvasculature هندسيا25،26. بشكل عام، فإن زيادة كثافة هيدروجيل القائم على ECM (في كثير من الأحيان الكولاجين أو الفيبرين) يحد من طول شبكة الأوعية الدموية والاتصال. ولذلك، فمن الأهمية بمكان أن يتم إيلاء اهتمام دقيق لكثافة مصفوفة الكولاجين. تركيزات أقل من 2 ملغ / مل يعزز التدهور البروتيوليتيك السابق لأوانه من هيدروجيلات الكولاجين، مما يؤدي إلى فقدان لا يمكن إصلاحه من السلامة الهيكلية هيدروجيل. وعلى النقيض من ذلك، فإن التركيزات التي تزيد عن 4 ملغم/مل تحفز على تكوين لومن قصير وواسع النطاق يظهر ضعف في الاتصال؛ تشوه هيدروجيل وتغيير في حجم المسام هي المسؤولة في المقام الأول عن هذا الإلغاء20.

لا ترتبط هيدروجيلات الكولاجين الخلوية والمحملة بالخلايا بلوحات المرفقات المنخفضة للغاية. هيدروجيلات تميل إلى البقاء معلقة في وسائل الإعلام، وسوف تطفو في بعض الأحيان إلى أعلى البئر. إذا تم استخدام لوحات معالجة زراعة الأنسجة في هذا البروتوكول، فإن الذرية جزءا لا يتجزأ من الهجرة إلى الجزء السفلي من البئر، وسوف تشكل طبقة أحادية مترافقة تقريبا في الجزء السفلي من لوحة. يؤدي الانخفاض الناتج في كثافة بذر الخلايا إلى منع تجميع هذه الذرية في شبكات ثلاثية الدناق. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم إلقاء هيدروجيلات في آبار لوحة معالجة ثقافة الأنسجة، فإنها سوف تربط بشكل ضعيف السطح الداخلي للبئر. هذا الربط ينطبق سلالة على هيدروجيل. منذ تم تطوير هذه المنصة لعزل أهمية العظة الفيزيائية والكيميائية، فمن الأهمية بمكان أن يتم نقل أي قوى دخيلة إلى الخلايا27. قد يكون من الصعب تغذية هيدروجيلات العائمة لأن معظم وسائل الإعلام ثقافة الخلية تقع تحت هيدروجيل. للتغلب على هذا، إمالة لوحة واستخدام ماصة P100 لإزالة وسائل الإعلام من جانب الجدار.

عند تصوير شبكات الأوعية الدموية على المجهر البؤري، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل لضمان أن الفلوروفور الزائد لا يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. الفلورة الزائدة قد تخلط بين خوارزميات العتبة الافتراضية وجعل z-كومة من الصعب binarize. للتغلب على هذه المشكلة، استخدم phalloidin، وهو سم فطري يقوم بتسمية F-actin بشكل انتقائي ويعرض ربط ًا محدودًا خارج الهدف. بشكل عام، استخدم الأجسام المضادة الأولية التي تم مترافقة مسبقًا مع جسم مضاد ثانوي للحد من تركيز الفلوروفور الحر الذي ينتشر من خلال الجل. عند توليد z-مكدسات ينصح عمق شريحة من 10-20 ميكرون لتحقيق التوازن بين الوقت اللازم للحصول على كومة z مقابل الحاجة إلى صورة عالية الدقة.

هنا يتم وصف اختبار كمي لتقييم الإمكانات الأوعية الدموية للـ iPSC-EPs في البيئات الدقيقة ثلاثية الجوانب. يستخدم هذا اليتوفر برامج مفتوحة المصدر ولا يتأثر بتحيزات المستخدم. ومع ذلك، فإنه يمثل نموذجا مفرط التبسيط من محراب الأوعية الدموية الفسيولوجية. في حين يمكن أن يفرق iPSC-EPs في الخلايا اللازمة للأوعية الدموية الناضجة والوظيفية، فإن هذا الفحص يتجاهل مساهمات أنواع الخلايا الأخرى (مثل الخلايا الليفية والضامة) التي تشارك في العمليات الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام ثابت ولا يعرض السفن النامية للتدفق. وأخيرا، في حين الكولاجين الأول هو واحد من البروتينات المهيمنة في ECM28 ويحافظ على الهندسة المعمارية الفيبريلار في المختبر، وهو يعتمد على الكثير ويقتصر على ضعف الربط المادي عند تحييدها في درجات حرارة عالية. على الرغم من هذه القيود، يمثل هذا القول خطوة هامة إلى الأمام في السعي إلى هندسة الأوعية الدموية الوظيفية لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية والنمذجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (منحة رقم 15SDG25740035، منحت لJ.Z.)، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) من المعاهد الوطنية للصحة (منحة رقم EB007507، منحت إلى C.C.)، و التحالف من أجل البحث والتدريب في مجال إعادة التأهيل التجديدي (AR3T، منحة رقم 1 P2C HD086843-01، منحت لJ.Z.). نود أن نعرب عن تقديرنا للبروفيسورة جين ستاشوياك (جامعة تكساس في أوستن) على مشورتها التقنية بشأن الفحص المجهري البؤري. كما أننا ممتنون للمناقشات مع صموئيل ميهيليتش (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة أليسيا ألين (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة جولي ريتلوفسكي (التكنولوجيا الحيوية التكيفية)، والدكتور ليون بيلان (جامعة فاندربيلت) لبصيرتهم في التحليل الحسابي للشبكات ثلاثية الجوانب. وأخيراً، نشكر الدكتور شياوبينغ باو (جامعة كاليفورنيا، بيركلي) على مشورته بشأن التمييز بين المراكز في مجال المجالات المتوسطة الأجل في مجال المجالات المتوسطة الأجل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموية، العدد 147، الخلايا الجذعية، الذرية البطانية، تكوين الأوعية الدموية، مصفوفة خارج الخلية، الكولاجين، التحليل الحسابي، شبكات السفن
نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter