Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular proliferativa específica del paciente que puede diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. Los progenitores endoteliales bipotentes (EP), que pueden diferenciarse en los tipos celulares necesarios para ensamblar la vasculatura funcional madura, se han derivado de células madre embrionarias e pluripotentes inducidas. Sin embargo, estas células no han sido rigurosamente evaluadas en entornos tridimensionales, y una medida cuantitativa de su potencial vasculogénico sigue siendo esquiva. Aquí, la generación y el aislamiento de iPSC-EPs a través de la clasificación de células activadas por fluorescentes se describen primero, seguido de una descripción de la encapsulación y el cultivo de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno. Este microambiente de imitación de matriz extracelular (ECM) fomenta una respuesta vasculogénica robusta; redes vasculares se forman después de una semana de cultivo. Se delinea la creación de una canalización computacional que utiliza software de código abierto para cuantificar esta respuesta vasculogénica. Esta canalización está diseñada específicamente para preservar la arquitectura 3D del plexo capilar para identificar de forma robusta el número de ramas, los puntos de bifurcación y la longitud total de la red con una mínima entrada del usuario.
Las células endoteliales de las venas umbilicales humanas (HUVEC) y otros tipos de células endoteliales primarias se han utilizado durante dos décadas para modelar la brotación de vasos sanguíneos y el desarrollo in vitro1. Estas plataformas vasculares prometen iluminar los mecanismos moleculares y a nivel tisular de las enfermedades cardiovasculares y pueden presentar información fisiológica sobre el desarrollo de las redes vasculares primitivas2,3. Aunque el campo del modelado vascular ha sido testigo de avances significativos, un ensayo de “estándar de oro” que puede modelar cuantitativamente y evaluar el desarrollo vascular fisiológico sigue siendo esquiva. La mayoría de los protocolos publicados no recapitulan adecuadamente el nicho vascular para fomentar la formación de vasos sanguíneos maduros y funcionales o no tienen un método para comparar cuantitativamente el potencial vasculogénico de los tipos de células evaluados en tres dimensiones ( 3D).
Muchos modelos vasculares actuales están limitados en su capacidad para imitar el nicho vascular fisiológico. Una de las plataformas in vitro más comúnmente empleadas es el ensayo de formación de tubos a base de mezcla de proteínage. Brevemente, los HUVEC se sembran como células individuales en una capa delgada de gel que consiste en proteínas cosechadas a partir de la matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de uno o dos días, los HUVECse autoensamblan en tubos primitivos 4. Sin embargo, este proceso se produce en dos dimensiones (2D) y las células endoteliales (CE) utilizadas en este ensayo no forman lúmenes huecos cerrados, limitando así la importancia fisiológica de estos estudios. Más recientemente, las CE y las células de apoyo (por ejemplo, células madre mesenquimales (MSC) y pericitas) han sido cocultivadas en microambientes 3D quesimulan la arquitectura fibrosa del ECM nativo, como el colágeno o los hidrogeles de fibrina 5. Para modelar el desarrollo vascular en este microambiente, las perlas poliméricas recubiertas con CE se emplean típicamente6. La adición de factores de crecimiento exógenos y/o factores de crecimiento secretados por otras células interstitialmente incrustadas en el hidrogel puede inducir a los CE, cubriendo las cuentas poliméricas, a brotar y formar un solo lumen; el número y el diámetro de los brotes y recipientes se pueden calcular. Sin embargo, estos brotes son singulares y no forman una red cerrada y conectada como se ve en condiciones fisiológicas y, por lo tanto, recuerda más a un modelo de vasculatura tumoral. También se han utilizado dispositivos microfluídicos para imitar el nicho vascular y promover la formación de vasculatura en hidrogeles cargados por LA CE7,8. Típicamente, un factor de crecimiento angiogénico-gradiente se aplica al medio de cultivo celular circulante para inducir la migración EC y la brotación. Las CE que constituyen el lumen de los vasos desarrollados son sensibles a la tensión de cizallamiento inducida por la aplicación del flujo de fluidos a través del dispositivo microfluídico; por lo tanto, estos dispositivos microfluídicos capturan parámetros fisiológicos clave que no son accesibles en los modelos estáticos. Sin embargo, estos dispositivos requieren costosas capacidades de microfabricación.
Lo más importante es que los tres modelos vasculares (2D, 3D, microfluídicos) utilizan abrumadoramente los CE primarios, así como los tipos de células de soporte primarias. Las células primarias no se pueden desarrollar en una terapia cardiovascular eficaz porque las células generarían una respuesta inmune tras la implantación; además, los HUVEC y tipos de células primarias similares no son específicos del paciente y no capturan anomalías vasculares que se producen en pacientes con una disposición genética o condiciones de salud preexistentes, por ejemplo, diabetes mellitus. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han surgido en la última década como una fuente celular proliferativa específica para el paciente que se puede diferenciar en todas las células somáticas del cuerpo humano9. En particular, se han publicado protocolos que describen la generación y el aislamiento de progenitores endoteliales derivados de la IPSC (iPSC-EP)10,11; los iPSC-EP son bipotentes y, por lo tanto, pueden diferenciarse aún más en células endoteliales y células musculares lisas/pericitas, los bloques de construcción de la vasculatura funcional madura. Sólo un estudio ha detallado convincentemente el desarrollo de un plexo capilar primario a partir de iPSC-EPs en un microambiente 3D12; aunque este estudio es fundamental para la comprensión del montaje y la diferenciación de iPSC-EP en hidrogeles naturales y sintéticos, no comparó cuantitativamente las topologías de red de la vasculatura resultante. Otro estudio reciente ha utilizado el modelo de cordón polimérico para comparar la brotación de HUVECs y ECs derivados de iPSC5. Por lo tanto, existe una clara necesidad de dilucidar aún más los mecanismos de señalización física y química que regulan la vasculogénesis iPSC-EP en microambientes 3D y determinar si estas células son adecuadas para la terapia isquémica y las enfermedades cardiovasculares Modelado.
En la última década, se han desarrollado diferentes canalizaciones computacionales de código abierto y algoritmos de esqueletización para cuantificar y comparar la longitud de la red vascular y la conectividad. Por ejemplo, Charwat y otros desarrollaron una canalización basada en Photoshop para extraer una imagen filtrada y binariza de redes vasculares derivadas de un cocultivo de células madre derivadas de adiposos y EF de crecimiento en una matriz de fibrina13,14. Tal vez la herramienta de comparación de topología más utilizada es AngioTool, un programa publicado en línea por el Instituto Nacional del Cáncer15; a pesar de la adopción generalizada del programa y la fidelidad bien documentada, el programa se limita a analizar estructuras similares a buques en dos dimensiones y otros programas, incluyendo AngioSys y Wimasis, comparten la misma limitación de dimensionalidad16. Se han desarrollado potentes conjuntos de software como Imaris, Lucis y Metamorph para analizar la topología de red de la microvasculatura de ingeniería; sin embargo, estas suites son prohibitivas para la mayoría de los laboratorios académicos y limitan el acceso al código fuente, lo que puede dificultar la capacidad del usuario final para personalizar el algoritmo a su aplicación específica. 3D Slicer, un paquete de resonancia magnética/tomografía computarizada de código abierto, contiene un kit de herramientas de modelado vascular que puede analizar eficazmente la topología de las redes vasculares 3D17; sin embargo, el análisis depende de que el usuario coloque manualmente los puntos finales de la red, lo que puede llegar a ser tedioso al analizar un dataset grande y puede verse influenciado por los sesgos subconscientes del usuario. En este manuscrito, se describe en detalle una canalización computacional que puede cuantificar redes vasculares 3D. Para superar las limitaciones anteriores, esta canalización computacional de código abierto utiliza ImageJ para preprocesar imágenes confocales adquiridas para cargar el volumen 3D en un analizador de esqueletos. El analizador de esqueletos utiliza un algoritmo de adelgazamiento del eje medial paralelo, y fue desarrollado originalmente por Kerschnitzki et al. para analizar la longitud y conectividad de las redes de osteocitos18; este algoritmo se puede aplicar eficazmente para caracterizar la longitud y la conectividad de la microvasculatura de ingeniería.
En conjunto, este protocolo describe la creación de redes microvasculares en microambientes 3D y proporciona una canalización computacional libre de código abierto y sesgo de usuario para comparar fácilmente el potencial vasculogénico de iPSC-EPs.
Este protocolo implica el cultivo a largo plazo de células en tres tipos de medios de cultivo celular: E8, LaSR Basal y EGM-2. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para esterilizar adecuadamente todos los materiales. Además, las batas de laboratorio y los guantes limpiados con etanol siempre deben usarse cuando se trabaja en la campana de flujo laminar del laboratorio. Se recomienda realizar pruebas frecuentes de contaminación por micoplasma; si se observa una gran cantidad de escombros durante el cultivo de iPSC…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón (número de subvención 15SDG25740035, otorgado a J.Z.), el Instituto Nacional de Imagen Biomédica y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud (número de concesión EB007507, otorgado a C.C.), y la Alianza para la Investigación y Formación en Rehabilitación Regenerativa (AR3T, concesión número 1 P2C HD086843-01, otorgada a J.Z.). Nos gustaría reconocer a la profesora Jeanne Stachowiak (Universidad de Texas en Austin) por su asesoramiento técnico sobre microscopía confocal. También estamos agradecidos por las discusiones con Samuel Mihelic (La Universidad de Texas en Austin), la Dra. Alicia Allen (La Universidad de Texas en Austin), la Dra. Julie Rytlewski (Biotech Adaptativa) y el Dr. Leon Bellan (Universidad Vanderbilt) por su visión sobre la análisis computacional de redes 3D. Por último, agradecemos al Dr. Xiaoping Bao (Universidad de California, Berkeley) su consejo sobre la diferenciación de iPSC en iPSC-EPs.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |